黃秀芳+原向偉

α干擾素增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對依托泊苷敏感性的

實(shí)驗(yàn)研究

黃秀芳1 原向偉2

1.廣東省江門市中心醫(yī)院病理科，廣東江門 529030；2.廣東省江門市中心醫(yī)院骨科，廣東江門 529030

[摘要] 目的 探討α干擾素（IFN-α）在人骨肉瘤U2OS和MG63細(xì)胞中對依托泊苷敏感性的作用及其機(jī)制。 方法 采用IFN-α和依托泊苷單獨(dú)或聯(lián)合處理骨肉瘤U2OS和MG63細(xì)胞72 h，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和DNA Ladder檢測細(xì)胞凋亡的變化，Western blot法檢測PARP、p53、MDM2、Bax、Bcl-2的表達(dá)。 結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)表明IFN-α在p53正常的U2O啊、胞中明顯增強(qiáng)依托泊苷誘導(dǎo)的凋亡（P < 0.05），卻對依托泊苷誘導(dǎo)p53突變的MG63細(xì)胞凋亡無明顯影響（P > 0.05）；DNA Ladder表明與單藥組相比，IFN-α與依托泊苷聯(lián)用72 h在U2OS細(xì)胞出現(xiàn)明顯的DNA梯形條帶，而在MG63細(xì)胞中無此現(xiàn)象；Western blot結(jié)果表明在U2OS細(xì)胞中聯(lián)合用藥組出現(xiàn)PARP的明顯裂解活化，并且IFN-α明顯增強(qiáng)依托泊苷引起的p53信號通路p53、MDM2、Bax等凋亡基因的表達(dá)，并抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，而在MG63細(xì)胞中則無此現(xiàn)象。 結(jié)論 IFN-α能夠通過激活p53依賴性信號通路增強(qiáng)依托泊苷誘導(dǎo)的骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡，聯(lián)合應(yīng)用IFN-α和傳統(tǒng)化療藥物如依托泊苷可能成為提高骨肉瘤化療敏感性的有效途徑。

[關(guān)鍵詞] α干擾素；依托泊苷；骨肉瘤；凋亡；p53

[中圖分類號] R738.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）03（a）-0004-05

Experimental study of IFN-α for enhancing sensitivity to Etoposide in human osteosarcoma cells

HUANG Xiufang1 YUAN Xiangwei2

1.Department of Pathology， Jiangmen Central Hospital， Guangdong Province， Jiangmen 529030， China； 2.Department of Orthopaedic Surgery， Jiangmen Central Hospital， Guangdong Province， Jiangmen 529030， China

[Abstract] Objective To study effect of IFN-α on the sensitivity to Etoposide in human osteosarcoma U2OS and MG63 cells with its molecular mechanisms. Methods U2OS and MG63 cells were treated with IFN-α and Etoposide， alone or in combination， for 72 h. Flow cytometry analysis and DNA Ladder were used to examine apoptosis. Western blot was used to determine expression of PARP， p53， Bax， Mdm2 and Bcl-2. Results IFN-α enhanced Etoposide-induced apoptosis in p53-wild U2OS cells （P < 0.05）， but not p53-mutant MG63 cells （P > 0.05）. IFN-α+Etoposide combination result in obvious DNA Ladder in U2OS， but not MG63 cells and activation of PARP in U2OS cells. The enhanced apoptosis was associated with the accumulation of transcriptionally active p53 accompanied with the increased Bax and MDM2， as well as decreased Bcl-2， in U2OS cells， which was not observed in MG63 cells. Conclusion IFN-α enhances Etoposide-induced apoptosis in human osteosarcoma U2OS cells by activation of p53-dependent signal pathway. This work implies that rational combination with IFN-α and chemotherapy including Etoposide may be a useful strategy for enhancing the chemosensitivity of osteosarcoma.

[Key words] IFN-α； Etoposide； Osteosarcoma； Apoptosis； p53

骨肉瘤高發(fā)于青少年人群，居于人類骨骼系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率第1位，其惡性程度高，發(fā)展快，許多患者在發(fā)現(xiàn)時已存在肺轉(zhuǎn)移，因此療效不佳。目前主要治療方法包括新輔助化療+外科手術(shù)包括保肢或截肢手術(shù)，但能否手術(shù)及保證手術(shù)效果的重要前提是化療有效。臨床上相當(dāng)患者因?yàn)榛熌退幓蚨靖弊饔么蟮葐栴}，引起化療失敗，導(dǎo)致患者無法行保肢手術(shù)從而截肢，甚至無法手術(shù)而導(dǎo)致死亡[1]。因此，提高化療療效對于骨肉瘤的治療來講具有重大意義。IFN-α屬于Ⅰ型干擾素，具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用[2]，IFN-α可直接抑制耐藥骨肉瘤細(xì)胞的生長[3]，然而其對骨肉瘤化療敏感性的影響目前尚不清楚。因此筆者聯(lián)合使用IFN-α與依托泊苷（Etoposide）處理人骨肉瘤U2OS和MG63細(xì)胞，探討其對兩種細(xì)胞生長抑制和凋亡的影響，并研究其分子機(jī)制，以期為提高骨肉瘤對化療藥物敏感性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細(xì)胞U2OS（p53基因野生型）和MG63（p53基因突變型）購自中山大學(xué)病理教研室，培養(yǎng)液為DMEM（GIBCO產(chǎn)品），其中含10%胎牛血清（GIBCO產(chǎn)品）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，培養(yǎng)于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱（Forma，美國）。

1.2 藥物處理

IFN-α購自Peprotech公司，批號300-02A，Etoposide購自Sigma公司，批號E1383，稀釋分裝凍存-20℃，使用時采用DMEM培養(yǎng)液稀釋成工作濃度，處理分為四組：對照組（加入與等量于其余組的DMEM培養(yǎng)液）、IFN-α（加入含工作濃度藥物的DMEM培養(yǎng)液使終濃度為5000 U/mL）組，Etoposide（終濃度在U2OS細(xì)胞為2.5 μg/mL、MG63細(xì)胞為0.625 μg/mL）組和IFN-α+Etoposide（終濃度同上）組。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測

細(xì)胞經(jīng)處理后，消化離心，收集細(xì)胞；PBS洗兩次，離心；70%乙醇固定過夜；細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L的碘化丙啶（PI）染色5 min，4℃避光30 min；上FCM流式細(xì)胞儀（BD，美國）用488 nm激發(fā)光檢測細(xì)胞DNA含量，LYSIS軟件分析凋亡率。

1.4 DNA Ladder檢測

細(xì)胞經(jīng)各處理后，消化離心，收集細(xì)胞；PBS洗兩次；加入0.8 mL的DNAzol（Invitrogen產(chǎn)品，批號：10503-027），室溫放置數(shù)分鐘；4℃離心15 min；將上清移入新EP管，加入0.4 mL的無水乙醇；4℃離心10 min；棄上清，加入75%乙醇洗2次，加入適量TE溶解基因組DNA，在含有EB的1.8%瓊脂糖凝膠電泳（水平電泳槽為北京六一廠產(chǎn)品），紫外線激發(fā)，凝膠成像分析儀（Bio-Rad，美國）采集DNA梯形條帶。

1.5 Western blot

收集細(xì)胞，PBS清洗離心，加入蛋白裂解液，定量蛋白（BCA法），SDS-PAGE電泳（垂直電泳儀為美國Bio-Rad產(chǎn)品），然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜（電轉(zhuǎn)儀為美國Bio-Rad產(chǎn)品），將膜封閉于含5%脫脂奶粉的TBST，4℃過夜；鼠抗人p53、MDM2、Bax、Bcl-2、GAPDH單克隆抗體和兔抗人PARP多克隆抗體均為SantaCruz公司產(chǎn)品，稀釋后室溫封膜3 h或4℃過夜，二抗稀釋后室溫封膜1 h或4℃過夜，暗室ECL化學(xué)發(fā)光，膠片顯影，定影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用q檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-α在U2OS和MG63細(xì)胞對Etoposide引起凋亡的影響

U2OS和MG63細(xì)胞經(jīng)IFN-α（5000 U/mL）和etoposide（U2OS細(xì)胞為2.5 μg/mL、MG6細(xì)胞為0.625 μg/mL）單獨(dú)或聯(lián)合處理72 h后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，U20S細(xì)胞在對照組、IFN-α組、Etoposide組和IFN-α+Etoposide的細(xì)胞凋亡率分別為：（5.1±2.3）%、（5.7±2.7）%、（15.3±3.8）%和（45.5±5.2）%（圖1A），結(jié)果表明IFN-α單獨(dú)并不誘導(dǎo)明顯的U2OS細(xì)胞凋亡，卻明顯增強(qiáng)了Etoposide誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞凋亡，Etoposide組與IFN-α+Etoposide比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。然而同樣處理MG63細(xì)胞后結(jié)果顯示，MG63細(xì)胞在對照組、IFN-α組、Etoposide組和IFN-α+Etoposide組的細(xì)胞凋亡率分別為：（2.2±0.8）%、（2.5±1.1）%、（23.8±4.6）%和（24.9±5.3）%（圖1B），表明IFN-α不僅單獨(dú)不誘導(dǎo)明顯的MG63細(xì)胞凋亡，也無增強(qiáng)Etoposide誘導(dǎo)的MG63細(xì)胞凋亡的作用，Etoposide組與IFN-α+Etoposide比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

A：U2OS；B：MG63

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測α干擾素對依托泊苷誘導(dǎo)的U2OS和MG63細(xì)胞凋亡的影響

2.2 IFN-α在U2OS和MG63細(xì)胞中對“DNA梯形條帶”的影響

U2OS和MG63細(xì)胞經(jīng)IFN-α（5000 U/mL）和etoposide（U2OS細(xì)胞為2.5 μg/mL，MG6細(xì)胞為0.625 μg/mL）單獨(dú)或聯(lián)合處理72 h后進(jìn)行DNA Ladder電泳。DNA Ladder是凋亡的特征性表現(xiàn)，結(jié)果顯示，與其他各組相比，IFN-α/Etoposide組的U20S細(xì)胞出現(xiàn)明顯的梯形條帶（圖2A）；而在MG63細(xì)胞，各組均未出現(xiàn)明顯梯形條帶（圖2B）。表明IFN-α可明顯增強(qiáng)Etoposide誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞凋亡，并且這種效應(yīng)僅出現(xiàn)在p53功能正常的U2OS細(xì)胞中，而在因突變導(dǎo)致p53功能喪失的MG63細(xì)胞中無此效應(yīng)，提示了p53可能參與此效應(yīng)。

A：U2OS；B：MG63

圖2 DNA梯形條帶分析α干擾素對依托泊苷誘導(dǎo)的U2OS和MG63細(xì)胞凋亡的影響

2.3 IFN-α在U2OS細(xì)胞中對Etoposide引起PARP活化的影響

U2OS細(xì)胞經(jīng)IFN-α（5000 U/mL）和etoposide （2.5 μg/mL）單獨(dú)或聯(lián)合處理72 h后進(jìn)行western blot檢測PARP蛋白活化。采用Western blot法檢測凋亡關(guān)鍵酶PARP的裂解，結(jié)果表明，在U2OS細(xì)胞，對照組、IFN-α組和Etoposide組均未出現(xiàn)PARP的活化，在聯(lián)合用藥組可見116 KD的無活性PARP前體明顯裂解為85 KD的活化片段（圖3）。提示聯(lián)合用藥明顯增強(qiáng)PARP活化，從而觸發(fā)U2OS細(xì)胞凋亡。

圖3 α干擾素在U2OS細(xì)胞中增強(qiáng)依托泊苷誘導(dǎo)的

PARP裂解活化（Western blot法）

2.4 IFN-α對Etoposide活化p53凋亡通路的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證IFN-α對Etoposide的增敏作用與野生型p53的功能有關(guān)，筆者進(jìn)一步檢測了p53凋亡通路相關(guān)基因p53、Bax、Bcl-2、Mdm2等的表達(dá)。如圖4所示，在U2OS細(xì)胞中，IFN-α單獨(dú)對p53及其靶基因MDM2的表達(dá)無明顯影響，而Etoposide可明顯增強(qiáng)二者的表達(dá)，聯(lián)合用藥則進(jìn)一步增高二者的表達(dá)。Bax和Bcl-2均是p53的下游調(diào)控基因，促凋亡的Bax的表達(dá)被Etoposide增高，并被IFN-α+Etoposide進(jìn)一步增強(qiáng)；與對照組相比，抗凋亡的Bcl-2的表達(dá)雖然在Etoposide組無變化，卻被聯(lián)合用藥明顯減弱。因此p53、Bax、MDM2和Bcl-2的表達(dá)變化與凋亡保持同步，提示了在IFN-α通過激活p53凋亡通路增強(qiáng)Etoposide誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞凋亡。然而在MG63細(xì)胞中，上述基因的蛋白表達(dá)均無明顯變化，與MG63細(xì)胞中的陰性結(jié)果相符合。

圖4 IFN-α在U2OS、MG63細(xì)胞中對Etoposide誘導(dǎo)p53，Bax，Mdm2和Bcl-2表達(dá)的影響（Western blot法）

3 討論

干擾素是一類多功能細(xì)胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)作用[1]，包括Ⅰ型和Ⅱ型，其中IFN-α屬于Ⅰ型干擾素，可與細(xì)胞表面的IFN-α/β受體結(jié)合，從而引起JAK1和TYK的活化，活化的JAK1和TYK可分別使STAT1發(fā)生和酪氨酸位點(diǎn)（Tyr701）和絲氨酸位點(diǎn)（Ser727）的磷酸化，磷酸化的STAT1蛋白形成同源或異源二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核與其靶基因啟動子上的干擾素刺激反應(yīng)元件或者γ活化序列結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控下游基因表達(dá)[4]。IFN-α也是臨床治療腫瘤的第一種細(xì)胞因子，已用于膀胱癌、腎癌、肝癌、白血病的臨床治療[5]。

以依托泊苷、阿霉素、順鉑等DNA損傷性藥物為代表的傳統(tǒng)化療藥物已廣泛用于人類骨肉瘤的新輔助化療，并獲得一定療效，但因其無腫瘤靶向特異性，常常在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時也破壞正常組織細(xì)胞，從而帶來嚴(yán)重的毒副作用，最終導(dǎo)致化療的失敗并影響骨肉瘤的最終療效[6-7]。有研究表明IFN-α本身即可抑制多藥耐藥的骨肉瘤細(xì)胞生長[3]，那么IFN-α聯(lián)合化療藥物對骨肉瘤細(xì)胞的生長是否存在協(xié)同作用，筆者對此進(jìn)行了一系列研究。

CAD（caspase activated DNAase）是細(xì)胞中一種能切割染色質(zhì)的核酸酶，可被caspase-3激活，CAD可識別DNA序列中的特定位點(diǎn)，將細(xì)胞基因組DNA在核小體單位之間的連接處剪斷，從而形成180～200 bp或其整數(shù)倍大小的寡核苷酸片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳會出現(xiàn)梯形電泳條帶，是凋亡的特征性表現(xiàn)，因而成為鑒定凋亡的經(jīng)典指標(biāo)[8]。筆者從流式細(xì)胞術(shù)和形態(tài)學(xué)兩方面證明IFN-α對U2OS細(xì)胞無明顯影響，卻明顯增強(qiáng)Etoposide誘導(dǎo)凋亡，提示二者聯(lián)用比化療藥物單用具有更好的抗癌作用。并且，在U2OS細(xì)胞中，聯(lián)合用藥可明顯增強(qiáng)PARP[poly（ADP-ribose） polymerase]的活化。實(shí)際上，PARP是反映凋亡的經(jīng)典指標(biāo)，受到促凋亡信號的刺激后，細(xì)胞內(nèi)蛋白酶Caspases家族成員caspase 8、9被激活，繼而激活下游效應(yīng)性caspase 3，最終裂解其底物PARP發(fā)生活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。上述變化在p53基因突變而喪失功能的MG63細(xì)胞中卻沒有發(fā)生，這提示此效應(yīng)可能與p53有關(guān)。p53是一個經(jīng)典的抑癌基因，在超過50%的惡性腫瘤包括骨肉瘤中都存在缺失或突變，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[10]，作為凋亡調(diào)控的主要靶點(diǎn)，激活的p53可通過調(diào)節(jié)其下游基因如MDM2，Bax、Bcl-2等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡[10]。目前，p53已被認(rèn)為是眾多化療藥物（包括Etoposide）抗癌作用的主要介導(dǎo)者[7]。不僅如此，最近研究表明，p53也參與了IFN-α引發(fā)的信號通路[11]。筆者發(fā)現(xiàn)，Etoposide激活了p53及其下游基因如MDM2、Bax等的表達(dá)。IFN-α雖然單獨(dú)應(yīng)用對p53通路無明顯影響，卻明顯增強(qiáng)Etoposide引起的p53、Bax和MDM2的表達(dá)，同時減弱了Bcl-2的表達(dá)，充分說明IFN-α通過激活p53依賴性信號通路增強(qiáng)Etoposide誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞凋亡。

MDM2基因是調(diào)節(jié)p53的一個重要因子，它在細(xì)胞核中直接與p53結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，并通過胞核-胞漿穿梭將p53轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿并使其降解，從而降低p53水平；另一方面，p53的上調(diào)可激活MDM2轉(zhuǎn)錄表達(dá)，來反饋性抑制p53蛋白的繼續(xù)增高。如此二者形成一個負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)，使細(xì)胞內(nèi)MDM2/p53比率保持恒定[12]。本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥引起的p53上調(diào)伴隨著MDM2水平的升高，表明p53的上調(diào)反饋性地激活了MDM2的表達(dá)，使其水平升高。Bax和Bcl-2基因同屬Bcl-2家族，均為p53的靶基因，表達(dá)于線粒體，是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因[13]。二者功能相互拮抗，Bax具有促進(jìn)凋亡的作用，Bcl-2則具有抗凋亡的作用，二者的比例決定了細(xì)胞是否走向凋亡[14-16]。而聯(lián)合用藥通過激活p53上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2，使Bax/Bcl-2比例增高，從而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。

因此，IFN-α可通過誘導(dǎo)p53依賴性凋亡來增強(qiáng)骨肉瘤U2OS細(xì)胞對依托泊苷的敏感性，提示IFN-α與骨肉瘤傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可望成為提高骨肉瘤化療療效的新方向。

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（收稿日期：2013-10-19 本文編輯：衛(wèi) 軻）

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（收稿日期：2013-10-19 本文編輯：衛(wèi) 軻）

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