林新 余天興 許俊平 陳麗芳 謝萬(wàn) 包宇旺

【摘要】 目的 研究具有高表達(dá)miRNA-9-5p的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）對(duì)呼吸機(jī)引起的肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）大鼠的影響以及機(jī)制。方法 建立機(jī)械通氣的肺損傷模型，通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建高miRNA-9-5p表達(dá)的BMSCs，評(píng)估BMSCs和高miRNA-9-5p表達(dá)的BMSCs對(duì)VILI大鼠的影響。通過蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR方法檢測(cè)BMSCs和高表達(dá)miRNA-9-5p的BMSCs對(duì)VILI大鼠肺部的LC3、Atg5和Atg7表達(dá)的影響。結(jié)果 移植BMSCs可顯著降低VILI大鼠肺部損傷的嚴(yán)重程度以及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）中的IL-1β和IL-2水平。移植高表達(dá)miRNA-9-5p的BMSCs能顯著降低VILI大鼠的肺部損傷嚴(yán)重程度和BAL液中的IL-1β和IL-2水平。與VILI大鼠相比，移植的BMSCs明顯增加了自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括Atg5和Atg7。與對(duì)照組相比，移植高表達(dá)miRNA-9-5p的BMSCs可顯著提高VILI大鼠的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例以及Atg5和Atg7水平。結(jié)論 BMSCs可能通過上調(diào)miRNA-9-5p表達(dá)提高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例、Atg5和Atg7介導(dǎo)的自噬水平，進(jìn)而緩解VILI。

【關(guān)鍵詞】 BMSCs；VILI；miRNA-9-5p；自噬

文章編號(hào)：1672-1721（2024）16-0001-05? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?中國(guó)圖書分類號(hào)：R563

危重病人的機(jī)械通氣不可避免誘發(fā)病理性和生理性的VILI，其特點(diǎn)是肺血管通透性增加、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和血液凝固[1]。確定有效的促進(jìn)肺損傷修復(fù)的保護(hù)性通氣策略，將推動(dòng)機(jī)械通氣治療發(fā)展。BMSCs是具有自我復(fù)制能力的多功能、多潛能的細(xì)胞，可在培養(yǎng)基中增殖并多樣化形成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。BMSCs在體外具有強(qiáng)大的增殖能力。有研究表明，移植BMSCs可治療一些疾病，包括肺部損傷[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，BMSCs可加速大鼠VILI的恢復(fù)[3]。BMSCs恢復(fù)VILI的機(jī)制還需進(jìn)一步探索。因此，本研究探討B(tài)MSCs和具有高表達(dá)miRNA-9-5p的BMSCs對(duì)VILI大鼠的影響及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）動(dòng)物。SPF級(jí)雄性SD大鼠60只[常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SCXK（豫）2005-0001]，年齡6～8周。隨機(jī)分為5組，即正常組、VILI組、VILI+BMSC組、VILI+BMSC+LV-NC（NC）組和VILI+BMSC+LV-miRNA -9-5p（OE）組，每組12只。（2）BMSCs的分離和培養(yǎng)。從大鼠后肢解剖股骨和脛骨，切開末端暴露骨髓腔。將骨髓分散在DMEM中，以1 500 r/min離心5 min。將骨髓顆粒重新懸浮在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞，每2 d更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%匯合時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶消化，傳代。取4代的BMSCs用于慢病毒感染。

1.2 方法

（1）慢病毒感染法構(gòu)建高表達(dá)miRNA-9-5p的

BMSCs。陰性對(duì)照慢病毒（LV-NC）、攜帶miRNA-9-5p的慢病毒（LV-miRNA-9-5p）用于感染BMSCs。72 h觀察綠色熒光。得到穩(wěn)定感染的BMSCs（OE）和BMSCs（NC），用于隨后的大鼠體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)。（2）肺部損傷模型的建立。為建立機(jī)械通氣的肺部損傷模型，5%水合氯醛麻醉后，大鼠被固定成仰臥位。使用小型動(dòng)物呼吸機(jī)（DW3000，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）通氣4 h，潮氣量為40 mL/kg。為防止過度通氣，呼吸頻率調(diào)整為15次/min。實(shí)驗(yàn)得到了福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。（3）標(biāo)本的采集和處理。模型建立的第7天，抽取動(dòng)脈血測(cè)量氧氣和二氧化碳的分壓。每組取6只大鼠的肺部進(jìn)行稱重，在80 ℃的烘箱中干燥72 h，然后再次稱重，計(jì)算肺部濕/干（W/D）比率。采用改良方法[4]從其余大鼠身上獲得BAL，于-80 ℃冰箱保存，后續(xù)用于測(cè)定促炎癥細(xì)胞因子的含量。右上肺組織在室溫下用4%多聚甲醛緩沖液固定24 h，然后石蠟包埋并切片進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。右下肺組織冷凍在液氮中，保存于-80 ℃冰箱，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析（western blot，WB）。（4）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。使用ELISA試劑盒IL-1β和IL-2（ABclonal Technology）測(cè)定促炎癥細(xì)胞因子的水平。（5）蘇木精-伊紅染色。石蠟切片在室溫下用二甲苯脫蠟2次。乙醇處理后用自來(lái)水清洗2 min。用蘇木精染色5 min，自來(lái)水清洗，在1%酸性酒精中分化，在1%氨水中變藍(lán)，伊紅染色1 min，并再次用自來(lái)水清洗。然后用乙醇進(jìn)行脫水，在二甲苯中清洗2次，持續(xù)10 min，用中性膠固定。顯微鏡觀察。（6）RNA提取和定量實(shí)時(shí)PCR（qRT-PCR）分析。用RNA提取試劑盒（TransGen Biotech）從肺部分離出總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransGen Biotech）的說明，以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為qRT-PCR的模板。引物見表1。（7）WB法測(cè)定LC3、Atg7和Atg5的表達(dá)。從肺部切片中提取總蛋白，用BCA試劑盒定量檢測(cè)蛋白水平。20～30 μg的蛋白質(zhì)使用SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在室溫下用牛血清白蛋白溶液封閉1 h。然后將PVDF膜與一抗在4 ℃下靜置孵育過夜。洗膜后，與相應(yīng)的HRP結(jié)合的二抗進(jìn)行孵育。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。使用Image J軟件定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以x±s表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析（ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs對(duì)VILI大鼠的影響

圖1（a）中，與正常組相比，VILI組的肺部W/D比率明顯增加（P<0.05）；正常組和VILI+BMSC組的的肺部W/D比率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。圖1（b）中，VILI+BMSC組的氧分壓高于VILI組（P<0.05），但低于正常組（P<0.05）。圖1（c）中，VILI組BAL液中IL-1β和IL-2的水平明顯高于正常組（P<0.05），VILI+BMSC組IL-1β和IL-2的水平明顯低于VILI組（P<0.05），說明炎癥的發(fā)展受到了一定程度的抑制。大鼠肺組織的組織學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果見圖2。正常組沒有肺泡巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，沒有明顯的病理變化。VILI組的肺組織有明顯的病理變化，肺泡間隔增厚，部分肺泡腔內(nèi)有血性滲出。移植BMSCs后，肺組織的病理變化得到了改善。這些結(jié)果表明，BMSCs對(duì)VILI大鼠肺損傷有改善作用。

2.2 BMSCs對(duì)LC3、Atg5和Atg7介導(dǎo)的自噬的影響

WB法檢測(cè)LC3、Atg5和Atg7的蛋白表達(dá)，見圖3（a）。與正常/VILI組相比，VILI+BMSC組Atg5和Atg7蛋白的相對(duì)表達(dá)明顯增加（P<0.05），見圖3（b）。VILI組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的比例明顯低于正常組和VILI+BMSC組，見圖3（c）。上述結(jié)果表明，BMSCs的移植可能會(huì)增加VILI大鼠的自噬。本研究通過qRT-PCR檢測(cè)了大鼠肺部LC3、Atg5和Atg7的mRNA水平。與蛋白質(zhì)水平類似，與正常組和VILI組相比，VILI+BMSC組大鼠肺部LC3、Atg5和Atg7的水平都有所增加，見圖3（d）。本研究還檢測(cè)了miRNA-9-5p的mRNA表達(dá)，見圖3（e）。與正常組和VILI組相比，VILI+BMSC組miRNA-9-5p的mRNA表達(dá)明顯增加（P<0.05）。由此可見，LC3、Atg5和Atg7在大鼠肺部的表達(dá)與BMSCs的移植有關(guān)，高miRNA-9-5p表達(dá)的BMSCs可能對(duì)VILI大鼠有積極作用。

2.3 miRNA-9-5p高表達(dá)的BMSCs對(duì)VILI大鼠的影響

為了探索miRNA-9-5p對(duì)VILI大鼠的影響，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)成功建立高表達(dá)miRNA-9-5p的BMSCs，見圖4（a）。qRT-PCR檢測(cè)也顯示，用高表達(dá)miRNA-9-5p的BMSCs治療的大鼠肺組織中miRNA-9-5p的表達(dá)高于NC組，見圖4（b）。雖然NC組和OE組的肺部W/D比率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但OE組的肺部W/D比率有下降趨勢(shì)，見圖4（c）。OE組的氧分壓高于NC組（P<0.05），見圖4（d）。OE組BAL液中IL-1β和IL-2的水平明顯低于NC組（P<0.05），見圖4（e）。OE組部分肺泡腔內(nèi)的肺組織有明顯的病理變化，見圖5，表明高miRNA-9-5p表達(dá)的BMSCs可在一定程度上改善VILI大鼠肺泡腔內(nèi)的肺泡間隔增厚。上述研究結(jié)果表明，高表達(dá)miRNA-9-5p的BMSCs可能有助于改善VILI大鼠的肺部損傷。

2.4 miRNA-9-5p高表達(dá)的BMSCs對(duì)由LC3、Atg5和Atg7介導(dǎo)的自噬的影響

OE組的LC3、Atg5和Atg7的mRNA、蛋白表達(dá)與NC組相比明顯升高（P<0.05），見圖6（a）、圖6（b）和圖6（d）。OE組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例明顯高于NC組（P<0.05），見圖6（c）。由此可見，LC3、Atg5和Atg7在肺部的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)與miRNA-9-5p的含量有關(guān)。BMSCs可能通過VILI大鼠的miRNA-9-5p的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)LC3、Atg5和Atg7的表達(dá)，并介導(dǎo)自噬。

3 討論

VILI是指在治療過程中由機(jī)械通氣引起或加重的急性肺損傷，是呼吸支持患者不可避免的嚴(yán)重并發(fā)癥。據(jù)報(bào)道，BMSCs可以增強(qiáng)VILI大鼠肺損傷的恢復(fù)，然而其基本機(jī)制仍不清楚。本研究探討了miRNA-9-5p高表達(dá)的BMSCs對(duì)VILI大鼠的影響以及它們是否通過自噬發(fā)揮作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMSCs可能通過上調(diào)miRNA-9-5p、增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率、Atg5和Atg7介導(dǎo)的自噬水平緩解VILI。這也是首次報(bào)道m(xù)iRNA-9-5p高表達(dá)的BMSCs對(duì)VILI大鼠自噬的影響。

BMSCs已被廣泛用于創(chuàng)傷、炎癥損傷修復(fù)、抗感染和免疫調(diào)節(jié)等實(shí)驗(yàn)，在肺損傷領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐中受到越來(lái)越多的關(guān)注[5]。有研究表明，BMSCs可以分化和修復(fù)受損的肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管膜，降低其通透性，還可促進(jìn)血管生成素-1的分泌，預(yù)防結(jié)構(gòu)損傷、肺水腫[6]。本研究中，移植BMSCs后，大鼠肺部W/D比率降低，氧分壓明顯改善，IL-1β和IL-2水平降低，肺泡腔內(nèi)出血滲出程度明顯減輕，提示移植BMSCs可明顯減輕VILI大鼠的肺部損傷。

自噬作為程序性細(xì)胞死亡，在體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)可維持細(xì)胞的平衡。許多研究證實(shí)，自噬的激活可在一定程度上促進(jìn)先天免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。自噬反應(yīng)由一系列的自噬相關(guān)蛋白介導(dǎo)。Atg5和Atg7是上游自噬信號(hào)的關(guān)鍵蛋白，可幫助細(xì)胞減輕壓力，抵抗細(xì)胞毒性，并促進(jìn)細(xì)胞生存[7]。LC3Ⅱ是一種重要的自噬體膜標(biāo)志蛋白，由細(xì)胞質(zhì)LC3（LC3Ⅰ）轉(zhuǎn)化而來(lái)，LC3通過使用各種自噬相關(guān)蛋白來(lái)調(diào)節(jié)自噬反應(yīng)[8]。本研究結(jié)果顯示，移植BMSCs后，VILI大鼠肺部Atg5和Atg7的水平以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例明顯增加，表明移植BMSCs減輕VILI大鼠肺部損傷與自噬有關(guān)。

有研究報(bào)道，miRNA-9可以通過激活自噬來(lái)促進(jìn)BMSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞[9]。在許多病理狀態(tài)下，miRNA-9-5p是血管生成的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因素。本研究中，移植高表達(dá)miRNA-9-5p的BMSCs組明顯減輕了VILI大鼠的肺部損傷，表明BMSCs可能通過上調(diào)miRNA-9-5p的表達(dá)緩解機(jī)械通氣引起的肺部損傷。與NC組相比，移植高表達(dá)miRNA-9-5p的BMSCs還能顯著提高VILI大鼠的Atg5和Atg7水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例。這些結(jié)果表明，BMSCs可能通過上調(diào)miRNA-9-5p表達(dá)、增加LC3、Atg5和Atg7介導(dǎo)的自噬減輕VILI引起的肺損傷。然而本研究不夠深入，未來(lái)還需要在動(dòng)物和臨床上進(jìn)行更深層次的研究。

綜上所述，移植BMSCs可明顯減輕呼吸機(jī)誘發(fā)的大鼠肺損傷，BMSCs可通過上調(diào)miRNA-9-5p表達(dá)、增加LC3、Atg5和Atg7介導(dǎo)的自噬緩解VILI。

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