王嘉廳 李冬青 吳信峰

[摘要]傷口愈合是皮膚受傷或感染后修復皮膚屏障的一個復雜生物學過程。傷口愈合不良會導致機體的功能障礙，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，同時顯著增加了患者的經(jīng)濟負擔。隨著高通量測序技術的發(fā)展和成熟，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術因其能精細劃分細胞亞群、評估細胞異質(zhì)性、追蹤細胞譜系、識別稀有細胞等獨特優(yōu)勢已被廣泛應用于生物醫(yī)學領域中。本文主要綜述單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術在傷口愈合中的研究進展，旨在為傷口愈合的基礎和臨床研究提供參考。

[關鍵詞]單細胞轉(zhuǎn)錄組測序；傷口愈合；急性傷口；慢性傷口；病理性瘢痕

[中圖分類號]R619+.6? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）05-0175-05

Advances in Single-cell Transcriptome Sequencing Technology in Wound Healing

WANG Jiating1， LI Dongqing 1，2， WU Xinfeng1

（ 1.Hospital for Skin Diseases， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Nanjing 210042， Jiangsu， China; 2.Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology of Dermatology and Venereal Diseases， Institute of Dermatology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Nanjing 210042， Jiangsu， China ）

Abstract： Wound healing is a complex biological process of repairing the skin barrier after a skin injury or infection. Poor wound healing leads to dysfunction of the organism， which seriously affects the quality of life of patients and significantly increases their economic burden. With the development and maturation of high-throughput sequencing technology， single-cell transcriptome sequencing technology has been widely used in biomedical fields due to its unique advantages such as its ability to finely delineate cell subpopulations， assess cellular heterogeneity， track cell lineage， and identify rare cells. In this paper， we summarize the research progress of single-cell transcriptome sequencing technology in wound healing， aiming to provide a reference for basic and clinical research on wound healing.

Key words： single-cell transcriptome sequencing; wound healing; acute wounds; chronic wounds; pathological scarring

皮膚損傷后的傷口愈合涉及皮膚不同層次的各種細胞成分和細胞外基質(zhì)之間的結(jié)合和交流。在正常的生理條件下，表皮屏障功能的修復是非常有效的，但真皮深層的修復則相對較差，會導致瘢痕的形成，喪失了原有的組織結(jié)構和功能。當正常的皮膚修復程序出現(xiàn)問題時，有兩個主要的結(jié)果：皮膚潰瘍（慢性傷口）或瘢痕組織過度增生（病理性瘢痕）[1]。傷口愈合過程極其復雜，其分子機制尚不明確，且易受各種系統(tǒng)因素如高齡、肥胖、糖尿病和血管性疾病等影響。近年來，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術已成為生命科學領域中的新寵兒，與傳統(tǒng)的bulk轉(zhuǎn)錄組測序獲得混合細胞群的平均基因表達相比，其可在單個細胞的轉(zhuǎn)錄組學水平上進行高通量測序，為人類更加深入地研究和理解疾病的發(fā)生發(fā)展提供了全新的視角。本文主要闡述單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在傷口愈合（包括急性傷口、慢性傷口、病理性瘢痕）中的研究進展。

1? 急性傷口與單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

在正常皮膚中，皮膚穩(wěn)態(tài)和屏障功能是通過常駐的角質(zhì)形成細胞、樹突狀細胞、T細胞、肥大細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和微生物組之間的相互作用建立的。當皮膚屏障被破壞時，傷口執(zhí)行一套循序漸進的自我修復過程，包括炎癥期、增殖期和重塑期，每個階段都被一系列的細胞因子和介質(zhì)激活，最終愈合修復皮膚屏障。

1.1 角質(zhì)形成細胞：角質(zhì)形成細胞作為表皮主要細胞類型，參與急性傷口愈合的各個階段。在炎癥期，角質(zhì)形成細胞能釋放各種促炎因子和抗菌肽，進一步趨化免疫細胞擴大炎癥反應，同時輔助免疫細胞清除傷口中病原體；在增殖期和重塑期，角質(zhì)形成細胞增殖、遷移、分化來形成表皮屏障[2]。

Haensel D等[3]剖析了小鼠急性傷口和正常健康皮膚中基底細胞構成、異質(zhì)性和細胞動力學，發(fā)現(xiàn)兩者均存在四種基底細胞亞群：Early-response （ER）、Growth-arrested （GA）、Col17a1Hi三種非增殖亞群以及MKi67+增殖亞群，前三者分別高表達Fos、Cdkn1a、Col17a1/Trp63；擬時序分析表明基底細胞分化軌跡是從Col17a1Hi亞群開始的，首先分化成ER亞群，進而分化為MKi67+增殖亞群或分化為GA亞群，最終向著棘層分化。Siriwach R等[4]發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酸能通過RHO/ROCK-SRF和ERK信號通路誘導小鼠傷口中基底細胞分化為THBS1+遷移型角質(zhì)形成細胞，促進傷口愈合。Li D等[5]解析了人類急性傷口和正常健康皮膚中角質(zhì)形成細胞的異質(zhì)性，可分為四類亞群：KRT10+棘層細胞、S100A7+顆粒層細胞、IFITIM1+和IGFBP3+基底細胞，急性傷口信號可誘導前兩者的比例升高。

此外，表皮中有1%～10%的基底細胞屬于表皮干細胞，按解剖部位可分為毛囊間表皮干細胞和毛囊皮脂腺單位中的干細胞。毛囊間表皮干細胞通過增殖、終末分化從而實現(xiàn)表皮自我更新，維持表皮的穩(wěn)態(tài)；來自毛囊的干細胞有助于傷口的再上皮化。Wang S等[6]研究發(fā)現(xiàn)人類新生兒表皮中存在四種處于不同空間位置的毛囊間表皮干細胞亞群，分別高表達PTTG1、RRM2、ASS1、KRT6A/GJB2，WNT靶基因和表觀遺傳修飾因子UHRF1和HELLS以及原癌基因PTTG1對表皮穩(wěn)態(tài)至關重要。Joost S等[7]發(fā)現(xiàn)皮膚傷口信號會激活Lgr5+毛囊隆突干細胞的毛囊間表皮特性，下調(diào)隆突相關基因，來快速適應傷口微環(huán)境。

1.2 成纖維細胞：在增殖期和重塑期，各種細胞因子刺激成纖維細胞增殖和遷移形成傷口肉芽組織，分泌細胞外基質(zhì)，最終逐漸纖維化形成瘢痕。成纖維細胞也能釋放各種生長因子促進角質(zhì)形成細胞增殖，部分成纖維細胞亞群可以被激活形成肌成纖維細胞促進傷口收縮[1]。

Driskell RR等[8]通過對小鼠進行系譜追蹤，發(fā)現(xiàn)小鼠背部真皮成纖維細胞按解剖部位和標記基因可分為四個亞群：CD26+/Sca1-乳頭層成纖維細胞、Dlk1+/Sca1-網(wǎng)狀層成纖維細胞、Sca1+/Dlk1+和Sca1+/Dlk1-原脂肪成纖維細胞。Guerrero-Juarez CF等[9]發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷會誘發(fā)小鼠傷口中成纖維細胞的高度異質(zhì)性，確定了一種罕見的具有髓系特征的成纖維細胞亞群可以促進脂肪的再生。Tabib T等[10]首次通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序識別了人類真皮中兩種主要的成纖維細胞亞群：第一種表達SFRP2和DPP4/CD26，可能參與細胞外基質(zhì)沉積或定向的經(jīng)典作用，第二種表達FMO1、LSP1和CXCL12，可能在CXCR4+免疫細胞的滯留中發(fā)揮作用。Philippeos C等[11]通過空間轉(zhuǎn)錄組和單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析的結(jié)合，將人類真皮成纖維細胞劃分為：CD90+/CD39+/CD26-細胞，其特點是表達特定的膠原，定位在真皮上部；CD90+/CD36+細胞，位于真皮下部，代表前脂肪細胞；其余三種位于整個網(wǎng)狀真皮：CD90+/CD39-/RGS5+細胞，對應周細胞，以及CD90+/CD39+/CD26+和CD90+/CD39-/RGS5-細胞，它們是尚未定性的成纖維細胞亞群。由此可見，人類真皮成纖維細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)集的結(jié)果之間明顯缺乏可重復性，這可能歸因于供體部位和特征不同或樣本處理的取樣異質(zhì)性[12]。Ascensión AM等[13]對已發(fā)表的單細胞數(shù)據(jù)集進行重新分析，識別了三大類成纖維細胞和十種亞型，其標記基因在不同研究中具有顯著一致性。還有研究表明，成纖維細胞類型的轉(zhuǎn)變及其分泌的炎癥因子IL6/TNF的比例是小鼠體外重編程的變異性和影響體內(nèi)傷口愈合速率的關鍵因素[14]。

1.3 免疫細胞：在傷口早期，中性粒細胞主要負責促進炎癥反應和殺滅傷口部位入侵的病原體；M1促炎型巨噬細胞需要清除凋亡的中性粒細胞，而M2抗炎型巨噬細胞發(fā)揮調(diào)節(jié)和修復功能，促進傷口閉合，導致后期瘢痕形成[2，15]。

Liu Y等[16]發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體能誘導中性粒細胞和巨噬細胞的異質(zhì)性，改變兩者的功能表型，傷口中存在BCL2A1B+增殖型中性粒細胞以及RETNLG+和SLC2A3+遷移型中性粒細胞；外泌體還能誘導巨噬細胞向抗炎表型分化，加速傷口愈合。Wee WKJ等[17]發(fā)現(xiàn)Angptl4能激活干擾素激活基因202B的表達，從而調(diào)節(jié)單核細胞向巨噬細胞分化，協(xié)調(diào)中性粒細胞和炎癥的清除；Angptl4缺失會延長中性粒細胞的存在時間，減少單核細胞衍生的巨噬細胞，延長傷口愈合的炎癥階段。

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示了皮膚穩(wěn)態(tài)和急性傷口微環(huán)境中各類表皮細胞亞群及其異質(zhì)性，識別了某些特定的表皮細胞亞群在急性傷口愈合中發(fā)揮的關鍵作用，了解各類細胞亞群在傷口愈合中的作用有助于研發(fā)新的治療策略。通過抑制有害的細胞亞群的作用，如抑制這些亞群特異的信號通路或使用單克隆抗體介導的消融；或者在體外擴增有益的細胞亞群有望成為治療的研究熱點。例如：在小鼠的傷口愈合過程中，實驗性地耗盡肌成纖維細胞可以減少纖維化的程度[18]。乳頭層成纖維細胞在構建組織工程皮膚替代品方面似乎比其他成纖維細胞更有效[19]。

2? 慢性傷口與單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

慢性傷口是指因某些因素如高齡、糖尿病、血管性疾病等，炎癥細胞未能清除傷口中殘存的微生物污染，傷口停留在炎癥晚期，炎癥細胞與駐留的微生物形成一個穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，傷口不能愈合，而是形成一個持續(xù)的潰瘍，常見的慢性傷口類型有靜脈性潰瘍、糖尿病足潰瘍及壓力性潰瘍等。

2.1 角質(zhì)形成細胞：慢性傷口中角質(zhì)形成細胞分泌的各種基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）會導致再上皮化缺陷，傷口邊緣的角質(zhì)形成細胞的細胞周期蛋白相關基因表達上調(diào)，反映了其可能處于增殖激活的狀態(tài)。角質(zhì)形成細胞中某些miRNA的調(diào)節(jié)功能受損也會導致皮膚傷口修復延遲。Li D等[5]首次通過SMART-Seq2對人類壓力性潰瘍（Pressure ulcer，PU）進行全長單細胞轉(zhuǎn)錄測序分析，并與正常急性傷口和匹配的健康皮膚相比較，發(fā)現(xiàn)壓力性潰瘍中IFN-γ能刺激MHC-II+角質(zhì)形成細胞亞群比例升高，抑制T細胞的激活，這可能與PU中的免疫失調(diào)相關，預示著PU的預后不良。

2.2 成纖維細胞：慢性傷口不能愈合的一個重要因素是肉芽組織有缺陷，部分原因是MMPs表達升高和成纖維細胞浸潤不良。此外，不愈合的慢性潰瘍傷口中成纖維細胞表現(xiàn)出衰老表型，遷移能力減弱，對生長因子信號無反應[1]。

Theocharidis G等[20]通過比較愈合和不愈合的糖尿病足潰瘍（Diabetic foot ulcer，DFU）單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，發(fā)現(xiàn)愈合的DFU中富集表達MMP1、MMP3、MMP11、HIF1A、CHI3L1和TNFAIP6的獨特成纖維細胞亞群，功能實驗表明過表達CHI3L1可以改變成纖維細胞行為，表現(xiàn)為黏附能力增強和遷移能力降低，表明此類成纖維細胞亞群可能黏附在細胞外基質(zhì)上并通過分泌相關分子介導愈合。與不愈合的DFU相比，愈合的DFU中成纖維細胞亞群表型主要為膠原生成和促纖維化[21]。此外，愈合的DFU中存在一類富含COL7A1的乳頭層成纖維細胞亞群，VII型膠原蛋白是基底膜的主要成分，是真表皮交界處的中心結(jié)構，在傷口愈合中起著關鍵作用[22]。

2.3 免疫細胞：慢性傷口通常會受到感染，并表現(xiàn)出持續(xù)的異常炎癥反應，TNF-α和ROS等促炎因子表達升高，IL-10和TGF-β等促愈合因子表達下降，中性粒細胞和M1型巨噬細胞長期存在導致傷口炎癥持續(xù)，肥大細胞和CD8+T細胞增強了這一過程。其他炎癥T細胞亞型（如 Th1、Th17和Th22）的水平也會升高。

單細胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，愈合的DFU中有更高的M1型巨噬細胞、幼稚和中央記憶T細胞豐度，而不愈合的DFU中存在更多的NK和NKT細胞，IFN-γ、VEGF和sVCAM-1等表達增加與DFU愈合有關[20，22]。Ma J等[23]對鏈霉素誘導的糖尿病小鼠模型傷口邊緣內(nèi)的CD45+免疫細胞進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序研究，揭示了慢性傷口模型中巨噬細胞的異質(zhì)性，為研究糖尿病慢性傷口的免疫相關機制提供了重要參考。

慢性傷口的共同特征是反復發(fā)生細菌感染、血管生成減少、表皮上皮化受損和活性氧（ROS）過多，最終導致持續(xù)的炎癥和傷口難以愈合[15]。上述研究探索了與慢性傷口愈合相關的各種細胞因子、細胞亞群，靶向此類細胞因子和細胞亞群有利于實現(xiàn)慢性傷口的精準醫(yī)療。更多慢性傷口如靜脈性潰瘍的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序圖譜仍有待進一步的研究。

3? 病理性瘢痕與單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

病理性瘢痕是一種由異常的傷口愈合引起的纖維增生性皮膚病，是機體對損傷修復的過度反應，表現(xiàn)為成纖維細胞的過度增殖和細胞外基質(zhì)的過度沉積，包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。

3.1 成纖維細胞：傷口愈合炎癥期延長會導致成纖維細胞活性增加，并增強TGF-β1、TGF-β2、IGF1和其他細胞因子的分泌，TGF-β1促使成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞具有收縮表型，其特點是過度分泌細胞外基質(zhì)成分，是形成病理性瘢痕的主要因素。

Vorstandlechner V等[24-25]發(fā)現(xiàn)了一組絲氨酸蛋白酶（二肽基肽酶DPP4和尿激酶PLAU）能夠調(diào)節(jié)TGF-β1介導的肌成纖維細胞分化和細胞外基質(zhì)過度產(chǎn)生，應用DPP4和PLAU抑制劑進行局部治療能夠抑制增生性瘢痕的形成。Griffin MF等[26]發(fā)現(xiàn)JUN在全身或特異性過表達能促進細胞外基質(zhì)沉積，誘導小鼠增生性瘢痕形成，此過程由CD36來調(diào)控，用抑制劑阻斷CD36或在小鼠模型上敲除CD36可以抵消JUN介導的纖維化功效。在瘢痕疙瘩中，成纖維細胞可分為四種亞群：乳頭層分泌型、網(wǎng)狀層分泌型、間充質(zhì)型和促炎癥型[27-28]。與正常瘢痕相比，瘢痕疙瘩中CD90+/CD266+/CD9-間充質(zhì)型成纖維細胞亞群的比例明顯升高，可能通過POSTN促進瘢痕疙瘩中膠原合成[27]。Liu X等[29]確定了可能參與瘢痕疙瘩纖維生成的關鍵轉(zhuǎn)錄因子如TWIST1、FOXO3和SMAD3，TWIST1抑制劑harmine可以明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的纖維化。Xia Y等[30]研究發(fā)現(xiàn)曲安奈德聯(lián)合5-氟尿嘧啶可以阻斷成纖維細胞向促纖維化亞型分化，并可能通過抑制細胞間通訊中FGF信號傳導途徑誘導瘢痕疙瘩萎縮，但同時刺激了部分成纖維細胞自我復制和多向分化的潛能，這可能是瘢痕疙瘩復發(fā)的細胞來源。

3.2 施萬細胞：細胞作為外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，在周圍神經(jīng)損傷后會進行轉(zhuǎn)錄重編程，包括向未成熟的狀態(tài)去分化和獲得特異性修復功能，確保神經(jīng)的正常發(fā)育和完整性。已有相關研究表明，施萬細胞不僅有助于神經(jīng)再生，還能促進真皮傷口愈合[31]。Direder M等[32]發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩中施萬細胞的比例明顯升高，其中主要是高表達NES、IGFBP3、IGFBP5、TFGBI、TNFAIP6的瘢痕疙瘩型施萬細胞亞群，表型為促纖維化，能夠促進細胞外基質(zhì)合成和影響巨噬細胞M2型極化。該團隊后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩旁的正常皮膚中施萬細胞比例也顯著升高，這可能與瘢痕疙瘩的高復發(fā)率相關；并通過標記基因確定了各類施萬細胞亞群[33]。Xia Y等[30]發(fā)現(xiàn)曲安奈德聯(lián)合5-氟尿嘧啶皮損內(nèi)注射治療瘢痕疙瘩，能減少瘢痕疙瘩型施萬細胞亞群比例，并誘導施萬細胞向衰老、凋亡方向分化。Gong T等[34]發(fā)現(xiàn)施萬細胞與細胞外基質(zhì)相關細胞群包括成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞之間存在著由SEMA3C信號通路和MK/PTN基因家族介導的相互作用，這種細胞群之間的相互作用可以促進細胞增殖和遷移，從而促進耳部瘢痕疙瘩的形成。

3.3 免疫細胞：越來越多的證據(jù)表明免疫細胞在瘢痕疙瘩中失調(diào)。與正常皮膚相比，瘢痕疙瘩皮損中有大量的T細胞、B細胞和肥大細胞浸潤，高活性的巨噬細胞還可以促進Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的分化，瘢痕疙瘩中免疫微環(huán)境失調(diào)尚未完全闡明。

Xu H等[35]發(fā)現(xiàn)NKG2A/CD94復合物特異性的上調(diào)可能是瘢痕疙瘩皮損中CD8+T細胞明顯減少的原因，NKG2A/CD94復合物與可溶性人類白細胞抗原-E（sHLA-E）的高血清水平有關，且sHLA-E具有較高的敏感性和特異性，與瘢痕疙瘩的高復發(fā)率高度相關，因此，sHLA-E可有效地作為評估瘢痕疙瘩形成風險的診斷指標和皮內(nèi)治療臨床結(jié)果的預后指標。Feng C等[36]研究了瘢痕疙瘩的免疫細胞圖譜，結(jié)果表明瘢痕疙瘩中可能存在以巨噬細胞為中心的通訊調(diào)控網(wǎng)絡，這有助于進一步理解瘢痕疙瘩的免疫學特征。

目前，已知皮膚纖維化與機械張力增加、特定生長因子（TGF-β1）的上調(diào)、特定成纖維細胞亞群產(chǎn)生過度的細胞外基質(zhì)相關，但由于缺乏理想的病理性瘢痕動物模型，對介導病理性瘢痕的關鍵機制闡明受到了極大的阻礙。上述研究闡明了病理性瘢痕形成過程中的關鍵調(diào)節(jié)因子、信號通路和細胞亞群，描述了其相關表型，部分解釋了病理性瘢痕高復發(fā)率等相關臨床特征，靶向這些信號分子及其下游通路可以有效抑制病理性瘢痕的形成。但是小鼠的瘢痕模型并不能完全反映人類病理性瘢痕的纖維化狀態(tài)。因此，在大型動物（豬）上測試病理性瘢痕治療的有效性能更好地反映人病理性瘢痕的病理狀態(tài)。

4? 小結(jié)和展望

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序通過對異質(zhì)組織中單個細胞的轉(zhuǎn)錄組情況進行分析，在剖析復雜的異質(zhì)細胞群方面非常有效，可以識別特定細胞類型內(nèi)單個細胞表達水平的極端差異性，闡明特定細胞表達水平對整體表型的獨特作用，并預測細胞配體-受體的相互作用，使人類更加深入地了解細胞的功能和疾病的病理生理學。但單細胞轉(zhuǎn)錄組測序也存在一定的局限性，如某些組織類型單細胞懸液制備困難、價格昂貴、細胞的空間信息丟失、技術噪音、某些非編碼RNA仍難以檢測等。其中部分不足可以通過與空間轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合互補，空間轉(zhuǎn)錄組學是一種較新的方法，能夠?qū)蝹€組織切片的轉(zhuǎn)錄組進行可視化和定量，保留了空間分子信息。將單細胞轉(zhuǎn)錄組與空間轉(zhuǎn)錄組測序相結(jié)合，有望為轉(zhuǎn)錄動態(tài)和基因調(diào)控機制提供新的見解。除轉(zhuǎn)錄組外，單細胞技術的發(fā)展在基因組、表觀遺傳、蛋白組等方面也取得了許多進展，單細胞多組學策略的應用能夠?qū)ν患毎亩喾N分子模式進行聯(lián)合分析，極大地改善了我們對人類疾病的基本認識。在傷口愈合研究方面，人類急性傷口的單細胞數(shù)據(jù)尚未有相關研究發(fā)表，是研究的一個空白和未來值得探索的一個方向；雖然人類慢性創(chuàng)面已有相關的研究，但不同慢性創(chuàng)面差異極大，機制也不同，仍缺乏對不同慢性創(chuàng)面的單細胞基因表達的橫向比較。

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[收稿日期]2023-06-11

本文引用格式：王嘉廳，李冬青，吳信峰.單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術在傷口愈合中的研究進展[J].中國美容醫(yī)學，2024，33（5）：175-179.