王曉英　劉盼　韓丹　趙媛媛

摘要 目的：探討丙泊酚靶向調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路干預(yù)心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的作用機制。方法：分別構(gòu)建體內(nèi)大鼠心肌梗死模型和體外原代心肌細胞糖氧剝奪（OGD）模型模擬MIRI，實驗分為對照組、模型組、陰性對照組和丙泊酚組。分別用流式細胞術(shù)檢測原代心肌細胞凋亡率，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白及MAPK/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達；使用轉(zhuǎn)錄組測序和VIPER方法檢測心肌組織中蛋白質(zhì)活性；通過2，3，5－氯化三苯基四氮唑（TTC）染色和蘇木精－伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌梗死面積、心肌組織變化；檢測各組血清心肌酶活性。結(jié)果：與模型組比較，丙泊酚組丙泊酚處理后原代心肌細胞凋亡率、凋亡蛋白Caspase－3和Bax表達明顯降低（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl－2表達明顯升高（P＜0.01），血清肌酸激酶同工酶（CK－MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌鈣蛋白T（cTnT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平明顯下降（P＜0.01），心肌梗死面積明顯縮小，磷酸化ERK1/2（p－ERK1/2）、磷酸化C－Raf（p－C－Raf）和磷酸化MEK1/2（p－MEK1/2）蛋白表達明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論：丙泊酚能減輕心肌缺血再灌注損傷，發(fā)揮心肌保護作用，可能是通過靶向調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞 心肌缺血再灌注損傷；丙泊酚；細胞凋亡；心肌酶；絲裂原活化蛋白激酶；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.010

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠心病最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)之一［1］。急性心肌梗死時心臟血氧流動受阻，導(dǎo)致心肌缺血和缺氧壞死，同時心肌再灌注會加重原有的心肌損傷［2］。這一病理生理過程在臨床上被定義為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）［3］。以往的研究表明，MIRI的病理機制非常復(fù)雜，主要包括心肌能量代謝受損、活性氧大量產(chǎn)生、鈣離子超載、中性粒細胞浸潤和血管內(nèi)皮功能障礙，最終導(dǎo)致心肌細胞凋亡或壞死［4］。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）家族的重要成員［5］。先前的研究表明，ERK可以調(diào)節(jié)細胞增殖和分化，活化的ERK/MAPK會進入細胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子［如c－fos和血清反應(yīng)因子（SRF）］，從而促進相關(guān)基因的表達［6］。心肌缺血狀態(tài)下，MAPK/ERK信號通路被激活，促進缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor－1，HIF－1）的表達，最終適應(yīng)缺氧［7］。目前的研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號通路在MIRI中發(fā)揮心臟保護作用，此外ERK1/2信號通路的抑制促進缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡［8］。

丙泊酚主要用于麻醉和鎮(zhèn)靜，藥理學(xué)研究顯示，其作用包括抗炎和抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生以及中性粒細胞浸潤［9］。臨床研究表明，丙泊酚可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物血紅素加氧酶－1（heme oxygenase－1，HO－1）的大量表達，從而發(fā)揮抗氧化作用［10］。丙泊酚通過ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1（ABCA1）上調(diào)促進膽固醇流出，防止內(nèi)皮細胞炎癥和活性氧引起的死亡［11］。此外，已被證明丙泊酚可以通過抑制缺氧缺糖即糖氧剝奪（OGD）對H9c2細胞的損傷發(fā)揮心臟保護作用［12］。然而，丙泊酚對預(yù)防和治療心肌損傷的機制尚未完全闡明。丙泊酚可增加一氧化氮（NO）的生物利用度，上調(diào)人靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表達水平，增加NO的生物合成水平［13］。此外，有研究報道，丙泊酚可激活ERK1/2信號通路［14］?？傊?，丙泊酚可能通過靶向調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路發(fā)揮缺血再灌注損傷后心臟的保護作用。本研究通過結(jié)扎左前降支建立的經(jīng)典模型和原代心肌細胞OGD模型，探討丙泊酚的心臟保護作用及其對MAPK/ERK信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 原代心肌細胞的培養(yǎng)

所有動物手術(shù)均根據(jù)《實驗動物護理和使用指南》（1996年修訂）進行，本實驗獲得我院動物倫理委員會批準(zhǔn)。用膠原酶Ⅱ（美國Sigma公司）從1～3 d齡Sprague－Dawley（SD）大鼠心室中分離原代心肌細胞。將含有懸浮細胞的上清液預(yù)培養(yǎng)1.5 h以除去非心肌細胞。隨后將分離的心肌細胞以5×104 個/cm2密度接種到細胞培養(yǎng)板中，隨后在含有10%胎牛血清（FBS，美國Gibco公司生產(chǎn)）和1%的青霉素－鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）的DMEM/F－12和羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES，美國Hyclone公司生產(chǎn)）混合液中培養(yǎng)，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2 OGD細胞模型

以二甲基亞砜（DMSO，美國Gibco公司生產(chǎn)）為介質(zhì)，將丙泊酚（美國Gibco公司）溶解于含10% FBS中。丙泊酚治療后24 h，丟棄培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）仔細沖洗。然后用KRB緩沖液替換溶液（KRB配制：NaCl 115 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2 2.5 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L，NaHCO3 24 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，pH 7.4）。在低氧環(huán)境（95%N2和5% CO2）中培養(yǎng)6 h后，將細胞在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，該培養(yǎng)箱含有5%CO2和95%空氣，用于復(fù)氧損傷。

1.3 大鼠心肌梗死模型

術(shù)前將體質(zhì)量為180～200 g的雄性SD大鼠飼養(yǎng)在溫度為25 ℃、濕度為45%的環(huán)境中，所有實驗動物都可以自由獲得食物和水。將丙泊酚溶解在0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）溶液（美國Gibco公司）中。將所有大鼠隨機分為對照組、模型組、陰性對照組和丙泊酚組。在造模前1 h尾靜脈注射藥物，通過缺血30 min和再灌注2 h建立缺血/再灌注模型。待動物麻醉后，在第2肋和第4肋間左胸壁切口切開胸腔，6－0鋼絲穿入左前降支遠端1/3處的滑結(jié)，之后將導(dǎo)管置于結(jié)扎線和心肌組織之間。然后通過收緊縫合線來阻塞冠狀動脈，缺血2 h后，松弛滑結(jié)，隨后心肌再灌注24 h。除缺血再灌注外，對照組進行上述手術(shù)。

1.4 心肌梗死面積的測量

通過2，3，5－氯化三苯基四氮唑（2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染色評估心肌梗死面積。再灌注后立即處死大鼠，取出心臟樣本，沿心尖至心臟底部切成5 mm厚的切片，在37 ℃用1%TTC孵育15～20 min后，采用數(shù)碼相機（日本Canon公司）拍攝切片。心臟的紅色部分被TTC染色，表明是幸存的組織，白色部分表示心肌梗死。最后使用Image－Pro Plus軟件測量心肌梗死面積。

1.5 采用VIPER算法預(yù)測蛋白質(zhì)活性的變化

基于從GEO數(shù)據(jù)庫獲得的233個RNA－seq表達譜數(shù)據(jù)，使用ARACNe建立心肌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。該網(wǎng)絡(luò)的參數(shù)設(shè)置為：引導(dǎo)程序＝100，P＜10－8，圖像每英寸長度內(nèi)的像素點數(shù)（DPI）＝0。轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包含1 623個轉(zhuǎn)錄因子、15 432個靶基因和432231個相互作用?；谝陨汐@得的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使用Bioconductor（https：//www. bioconductor.org/packages/release/bioc/html/viper.html）提供的VIPER算法預(yù)測參麥注射液對蛋白質(zhì)活性的影響。最后將樣本隨機均勻地加擾1 000次，以估計統(tǒng)計學(xué)意義［15］。

1.6 細胞凋亡檢測

采用膜聯(lián)蛋白V－異硫氰酸熒光素（Annexin V－FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色試劑盒（英國abcam公司）檢測心肌細胞凋亡的變化。用胰蛋白酶消化5×105個細胞，PBS在4 ℃漂洗2次。離心后將細胞重新懸浮在500 μL染色緩沖液中，然后加入5 μL膜聯(lián)蛋白Annexin V－FITC和5 μL的PI染料，37 ℃黑暗中染色15 min，最后用細胞儀檢測凋亡細胞［16］。

1.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達情況

向細胞中加入適量的RIPA裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）并混合均勻（RIPA和PMSF均購自Beyotime公司），胰蛋白酶消化細胞后加入裂解緩沖液，收集裂解物并轉(zhuǎn)移到新的EP管中，隨后使用冷凍高速離心機在14 000 r/min和4 ℃下離心30 min。離心完成后，收集蛋白質(zhì)上清液，并在95 ℃加熱10 min，使蛋白質(zhì)變性，將制備好的蛋白質(zhì)樣品放在－80 ℃的冰箱中備用。蛋白質(zhì)的濃度用二喹啉甲酸（BCA，購自Beyotime公司）法測量。蛋白樣品在80 V恒壓下用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分離2.5 h后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。隨后將PVDF膜浸入含有5%脫脂奶粉的TBST（購自瑞士Roche公司）中，并在搖床上緩慢搖動1 h。封閉完成孵育一抗，置于4 ℃冰箱過夜。次日取出，用TBST清洗3次，每次10 min后，孵育相應(yīng)的第二抗體2 h。在暗室中使用增強化學(xué)發(fā)光試劑（ECL，購自美國Media公司）暴露免疫反應(yīng)帶，最后使用Image－Pro Plus v6分析蛋白質(zhì)的相對表達。實驗使用的一抗：小鼠抗大鼠Caspase－2單克隆抗體、免抗大鼠Bax單克隆抗體、免抗大鼠Bcl－2單克隆抗體、免抗大鼠ERK1/2單克隆抗體、兔抗大鼠絲氨酸－蘇氨酸激酶1/2（MEK1/2）單克隆抗體、小鼠抗大鼠原癌基因絲蘇氨酸蛋白激酶（C－Raf）單克隆抗體和小鼠抗大鼠甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體，均購自SantaCruzBiotechnology公司。實驗使用的二抗有HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，均購自SantaCruz 公司。

1.8 蘇木精－伊紅（HE）染色觀察心臟組織的變化

將大鼠處死后分離心臟樣本，然后用4%多聚甲醛/PBS（pH 7.4）在4 ℃下處理48 h。然后用流動水洗滌組織，用70%、80%和95%乙醇脫水，并用100%乙醇處理，之后用二甲苯除去乙醇。將組織包埋在石蠟（2 μm）中，并嚴(yán)格按照制造商的HE染色試劑盒（購自Beyotime公司）說明進行染色。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清心肌酶活性

將大鼠處死后采集全血樣品，根據(jù)肌酸激酶同工酶（CK－MB）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）和肌鈣蛋白T（cTnT）試劑盒（購自Beyotime公司）的說明，全血樣品在室溫下放置20 min，然后在室溫下以3 000 r/min離心20 min。隨后，收集分離的透明血清，用多功能酶標(biāo)儀測定450 nm處CK－MB、AST、LDH和cTnT的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每個樣品中CK－MB、AST、LDH和cTnT的濃度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗均重復(fù)3次。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 丙泊酚對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的原代心肌細胞凋亡的影響

與對照組比較，模型組、陰性對照組原代心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，丙泊酚組原代心肌細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。詳見圖1、圖2。Western Blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組、陰性對照組凋亡蛋白Caspase－3和Bax表達明顯升高（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl－2表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，丙泊酚組凋亡蛋白Caspase－3和Bax表達明顯降低（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl－2表達明顯升高（P＜0.01）。詳見圖3、圖4。

2.2 丙泊酚對缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠血清心肌酶活性的影響

與對照組比較，模型組、陰性對照組血清CK－MB、LDH、cTnT和AST水平有不同程度升高（P＜0.01），提示MIRI大鼠模型成功建立。經(jīng)丙泊酚治療后，丙泊酚組血清CK－MB、LDH、cTnT和AST水平較模型組明顯下降（P＜0.01），提示丙泊酚能減輕MIRI。詳見圖5、圖6。

2.3 丙泊酚對缺血再灌注誘導(dǎo)大鼠心肌梗死面積的影響

TTC染色結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組、陰性對照組大鼠心肌梗死面積明顯增加（P＜0.01），丙泊酚組心肌梗死面積明顯小于模型組（P＜0.01）。詳見圖7、圖8。

2.4 HE染色分析丙泊酚對缺血再灌注誘導(dǎo)大鼠心臟組織的影響

HE染色結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組、陰性對照組中心肌細胞排列紊亂，心肌細胞胞漿染色不均勻，心肌纖維排列松散無序，細胞間隙明顯增寬，肌漿染色也不均勻，同時部分肌纖維變性腫脹，間質(zhì)水腫，紅細胞滲漏，中性粒細胞浸潤。丙泊酚治療后，可以觀察到心肌細胞排列有序，染色均勻，細胞邊界清晰，無間質(zhì)水腫和中性粒細胞浸潤，對心肌組織表現(xiàn)出了明顯的保護作用。詳見圖9。

2.5 丙泊酚對原代心肌細胞MAPK/ERK信號通路的影響

為了尋找丙泊酚治療后活性發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)，從GEO數(shù)據(jù)庫中下載了231個心肌組織基因表達譜數(shù)據(jù)，然后使用ARACNe法構(gòu)建心肌組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。ARACNe算法是基于大規(guī)?；虮磉_譜數(shù)據(jù)預(yù)測轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與信號蛋白下游基因關(guān)系的理論預(yù)測方法，已被證明是進行VIPER分析的有力方法。本實驗基于VIPER分析得到6個活性顯著上調(diào)的蛋白［MAPK3、反應(yīng)結(jié)合蛋白（CREB）、絲裂原激活蛋白激酶1（MAP2K1）、c－fos、絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶（Raf1）和MAPK1］和2個活性顯著下調(diào)的蛋白植物鹽超敏感基因（SOS1）和叉頭框蛋白O3（FOXO3），提示MAPK/ERK信號通路的蛋白活性顯著上調(diào)（見圖10）。Western Blot檢測結(jié)果顯示：與模型組比較，丙泊酚處理后MAPK/ERK信號通路中磷酸化ERK1/2（p－ERK1/2）、磷酸化C－Raf（p－C－Raf）和磷酸化MEK1/2（p－MEK1/2）蛋白表達明顯增加（P＜0.05）。詳見圖11、圖12。

3 討 論

心肌細胞活力下降和心室重構(gòu)可能是急性心肌梗死病人因心力衰竭死亡的主要原因［17］。隨著急診溶栓、急診介入治療和冠狀動脈搭橋術(shù)的廣泛應(yīng)用，急性心肌梗死病人的死亡率明顯降低，同時病人的生存率顯著提高［18］。研究發(fā)現(xiàn)，MIRI后心肌發(fā)生壞死，多種心肌酶釋放到血液中，最終增加血清心肌酶的活性，該結(jié)果與之前的文獻報道結(jié)果［19］一致。經(jīng)丙泊酚預(yù)處理后，MIRI模型大鼠血清CK－MB、AST、LDH和cTnT水平下降，心肌細胞損傷減輕。本研究還通過流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡，結(jié)果顯示：經(jīng)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)后，模型組心肌細胞凋亡率明顯增加。然而在丙泊酚處理后，心肌細胞凋亡率明顯降低。通過TTC染色和HE染色檢測心肌梗死面積和心肌組織的變化，結(jié)果顯示：經(jīng)缺血/再灌注誘導(dǎo)后，MIRI模型大鼠心肌梗死面積明顯增大，心肌細胞排列紊亂，心肌纖維排列松散無序，細胞間隙明顯增寬，同時部分肌纖維變性腫脹，間質(zhì)水腫，紅細胞滲漏，中性粒細胞浸潤。經(jīng)丙泊酚處理后，心肌梗死面積明顯縮小，心肌細胞排列有序，染色均勻，細胞邊界清晰，無間質(zhì)水腫和中性粒細胞浸潤。提示丙泊酚能改善心肌細胞損傷，對缺血再灌注大鼠心肌損傷有一定的預(yù)防作用。

目前研究表明，調(diào)控MIRI的分子機制非常復(fù)雜，主要集中在與細胞生長和存活相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［20］和 磷脂酰肌醇3－激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［21］。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與心肌細胞凋亡有關(guān)［22］。細胞外刺激與細胞膜表面受體結(jié)合并將信號傳遞到細胞膜的過程中需要MAPK級聯(lián)反應(yīng)［23］。目前ERK信號通路是研究最多的MAPK相關(guān)通路，其參與調(diào)節(jié)多種生物過程，如各種細胞的存活、生長和死亡以及炎癥相關(guān)的免疫反應(yīng)［20，24］。有研究表明，在急性心肌梗死大鼠模型中激活ERK途徑可增強心肌細胞的復(fù)氧作用，抑制心肌細胞的凋亡和炎癥反應(yīng)，這在一定程度上保護心肌免受缺血再灌注引起的繼發(fā)性損傷［25］。本研究結(jié)果顯示：在缺血/再灌注的體內(nèi)心肌損傷模型中，與模型組比較，丙泊酚組MAPK/ERK信號通路中關(guān)鍵蛋白p－ERK1/2、p－MEK1/2和p－C－Raf表達水平明顯升高，提示丙泊酚在MIRI大鼠的心臟保護作用可能是通過激活MAPK/ERK信號通路來實現(xiàn)的。另外，有研究報道，MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游分子ERK可以在刺激下將上游級聯(lián)信號傳遞到細胞核中，最終調(diào)節(jié)細胞核中各種凋亡相關(guān)基因的表達如Caspase－3、Bcl－2、Bcl－xL、Bax、Bad和Bim［26－27］。Bcl－2和Bax是決定細胞接受細胞外刺激信號后是否激活凋亡信號通路的關(guān)鍵基因。本研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)丙泊酚干預(yù)處理后，p－ERK1/2表達上調(diào)，p－ERK的活性被顯著激活，從而抑制Caspase－3和Bax的表達并增加Bcl－2的表達，表明丙泊酚可以通過調(diào)節(jié)ERK通路的激活來干預(yù)Caspase－3、Bax和Bcl－2的表達。

綜上所述，丙泊酚可降低缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡率，縮小心肌梗死面積，減輕心肌組織損傷，發(fā)揮對心臟的保護作用，其保護機制可能與激活MAPK/ERK信號通路有關(guān)。

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（收稿日期：2022－01－30）

（本文編輯郭懷?。?/p>

基金項目 四川省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題（No.17PJ596）

引用信息 王曉英，劉盼，韓丹，等.丙泊酚靶向調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路干預(yù)心肌缺血再灌注損傷的實驗研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（1）：56－61；87.