譚丹丹，馮振宇，孟 霜，王旭艷，王鑫鑫，趙 杰，，趙建平

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030602；2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山西 太原 030013）

病毒性肺炎是由呼吸道病毒感染鼻腔、咽喉后向下發(fā)展引起的肺部炎癥。新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）在2019 年底的爆發(fā)已經(jīng)對全球各個行業(yè)造成了巨大的損害。這種疾病具有長期潛伏和高度傳播性，嚴(yán)重的情況下可能會演變?yōu)榧毙院粑狡染C合征、膿毒癥休克、腎衰竭，甚至可能導(dǎo)致死亡［1，2］。其臨床治療主要是針對性的，并沒有特效藥物［3］。COVID-19 歸屬于中醫(yī)“疫病”范疇，其主要的病理機(jī)制是“病毒侵入體內(nèi)，熱毒侵襲肺部”［2，4］。中醫(yī)與疫病抗?fàn)幍臍v史至今已有上千年［5］。中醫(yī)的“未病先防，既病防變”的優(yōu)勢在此次疫情防控中得到了充分的體現(xiàn)［6］，與西醫(yī)治療配合使用，更縮短了病程，降低了輕癥轉(zhuǎn)重癥率與死亡率［7］。因此，對于挖掘防治病毒性肺炎的藥物，越來越多的科研工作者開始將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向中醫(yī)藥。

扶陽解表方由大黃、附子、知母、升麻、蒼術(shù)、細(xì)辛、干姜、麻黃、白術(shù)、川椒10 味中藥組成，由山西省經(jīng)方扶陽創(chuàng)始人趙杰根據(jù)麻黃附子細(xì)辛湯和大建中湯化裁而成，以“扶陽辟疫法”為理論基礎(chǔ)，具有溫陽散寒，健脾瀉濁的功效。病毒性肺炎疫情發(fā)生以來，扶陽解表方在本院發(fā)熱門診患者中證屬“脾虛濕濁夾熱型”的高危人群中使用，療效明顯，使用安全，無不良反應(yīng)，可改善發(fā)熱患者的發(fā)熱、惡寒癥狀，并有效地緩解伴隨的咳嗽、喘促、腹瀉等呼吸道、消化道臨床癥狀。目前該制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確，因此在前期研究的基礎(chǔ)上，該研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從分子水平的角度上初步探究扶陽解表顆粒治療病毒性肺炎的潛在靶點(diǎn)和相關(guān)信號通路，并進(jìn)一步以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討扶陽解表顆粒的藥效學(xué)，為扶陽解表顆粒的臨床應(yīng)用提供有力的理論依據(jù)，同時為中醫(yī)藥治療病毒性肺炎提供新的契機(jī)，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化添磚加瓦。

1 材料與方法

1.1 藥物制備

扶陽解表顆粒由山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室制備并提供。

1.2 有效成分篩選

利用CNKI、萬方以及PubMed 的數(shù)據(jù)庫，研究扶陽解表顆粒的化學(xué)組成，并通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和TCMSP，對藥物體內(nèi)ADME 過程的化學(xué)組成進(jìn)行藥效學(xué)篩選。分別以麻黃、升麻、附子、細(xì)辛、白術(shù)、大黃、蒼術(shù)、川椒、干姜、知母為關(guān)鍵詞，設(shè)置篩選參數(shù)條件為口服生物利用度OB≥30%和類藥性DL≥0.18，檢索扶陽解表顆粒的活性成分，并找出相應(yīng)的靶點(diǎn)基因。

1.3 病毒性肺炎靶點(diǎn)篩選

在Gene Cards 數(shù) 據(jù) 庫、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫、Drug Bank、PharmGKB、TTD 數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“novel coronavirus pneumonia”搜索與病毒性肺炎相關(guān)的基因。

1.4 潛在靶點(diǎn)的確定

通過R 語言將以上搜索到的靶點(diǎn)進(jìn)行交接，得到潛在共同作用靶點(diǎn)，即扶陽解表顆粒治療病毒性肺炎的潛在作用靶點(diǎn)，作出韋恩圖。

1.5 活性成分與潛在靶點(diǎn)間的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 軟件，將篩選出的有效成分與潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行組合，從而建成有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI 的構(gòu)建

利用STRING 蛋白互作在線分析數(shù)據(jù)庫Multiple Proteins 中，并設(shè)置為Homo sapiens，設(shè)定 high confidence 為0.400，將潛在作用靶點(diǎn)保存為TSV 格式，將其導(dǎo)入Cytoscape（v3.8.2）中進(jìn)行優(yōu)化。利用Cytoscape 3.8.2 軟件中的插件CytoNCA 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，得到扶陽解表顆?？共《拘苑窝椎暮诵陌悬c(diǎn)。

1.7 基因本體（GO）功能富集分析和KEGG 信號通路富集分析

利用ClusterProfiler 軟 件r（x64 4.1.0），對1.4 中的潛在作用目標(biāo)進(jìn)行了GO 富集和KEGG 信號通道富集的研究，并繪制了相應(yīng)的柱狀圖和氣泡圖。

1.8 分子對接

利用Pubchem 數(shù)據(jù)庫，獲取扶陽解表顆粒中活性成分的“mol2”格式文件。從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫獲 取ACE2、MPro、PLP、IL6、MAPK1、MAPK8、TNF、AKT1 、MAPK3、TP53 以及PTSG2 靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)。通過PyMOL 軟件，對蛋白質(zhì)執(zhí)行了去水、加氫等步驟，然后將其保存為“pdb”格式。使用AutoDock Tools 軟件，將蛋白質(zhì)和活性成分的格式轉(zhuǎn)換為“pdbqt”格式。最終通過Autodock-vina 軟件，調(diào)整了連接盒，并實(shí)現(xiàn)了分子與蛋白的連接，從而獲取了結(jié)合能（affinity）。使用TBtools 軟件來繪制分子連接的熱圖。

1.9 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)［8，9］

1.9.1 動物 SPF 級健壯SD 大鼠（北京維通利華動物技術(shù)有限公司），其許可證編號為 SCXK（京）2016-0011。該大鼠在24 ℃的環(huán)境下，每天12 h 進(jìn)行日夜更替的光照，保持良好的通風(fēng)，并能夠自主進(jìn)行飲食和喝水，進(jìn)行7 d 的適應(yīng)性飼養(yǎng)。此次試驗(yàn)嚴(yán)格按照試驗(yàn)動物倫理要求進(jìn)行。

1.9.2 藥物、試劑與儀器 扶陽解表顆粒共大黃、附子、知母、升麻、蒼術(shù)、細(xì)辛、干姜、麻黃、白術(shù)、川椒10 味中藥（山西維康堂中藥飲片有限公司，批號分 別 為200306，200207，190032，190034，200107，200107，190021，202001，180022，190308），蛋清，安琪高活性酵母（安琪酵母股份有限公司，CE2015）；阿司匹林（拜耳公司，國藥準(zhǔn)字J20171021）；毛果蕓香堿（華納大藥廠，國藥準(zhǔn)字H20100117）；IL-6、IL-17 、IL-1β、TNF-α、ELISA 試劑盒（上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司，貨號分別為：F3066-A、F2964-A、F2923-A、F3056-A）；蓖麻油（科田藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z42020991）；市售碘、淀粉。電子體溫計(jì)；臺式高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司，Centrifuge5328R），顯微鏡（徠卡公司）。

1.9.3 造模方法 選擇35 只SPF 級的健壯SD 大鼠，并將它們隨機(jī)地劃分成了空白組、模型組、阿司匹林組以及扶陽解表顆粒中、高劑量組，實(shí)驗(yàn)開始之前將大鼠進(jìn)行7 d 的適應(yīng)性喂養(yǎng)。扶陽解表顆粒中、高劑量組分別是2.56、5.13 g/kg，而阿司匹林組的劑量則是200 mg/kg。在空白組與模型組，提供相同體積的生理鹽水，并持續(xù)7 d（灌胃容積按照15 mL/kg）。

炎癥模型：在給藥前，對每組大鼠的足趾進(jìn)行了體積測量，作為基準(zhǔn)數(shù)據(jù)。給藥1 h 后，將0.1 mL的蛋清液注入到每組大鼠的足趾底部，使各組大鼠的足趾急性發(fā)炎。出現(xiàn)炎癥后，測量并記錄每組大鼠0.5、1、2、3 和4 h 的足趾腫脹情況，以計(jì)算出足趾的腫脹率（%）=［（體積-體積基礎(chǔ)）/體積基礎(chǔ)］×100%。

發(fā)熱模型：利用電子體溫計(jì)測量每只大鼠的肛溫（測量前使大鼠排空糞便以減少誤差，并在大鼠肛周涂抹石蠟），測溫時將探頭插入肛門內(nèi)3 cm 待溫度穩(wěn)定聽到電子溫度計(jì)發(fā)出響聲后測量結(jié)束，即可讀數(shù)。試驗(yàn)前大鼠禁食不禁水12 h，試驗(yàn)當(dāng)日給藥前測量1 次肛溫，0.5 h 后再測1 次，以2 次測量的平均值作為動物的基礎(chǔ)體溫（0 h）。大鼠足趾體積檢測結(jié)束后第2 天，將140 mL 的蒸餾水加入21 g 干酵母，稀釋成15%的酵母菌懸液，按照10 mL/kg 在模型組、扶陽解表顆粒中、高劑量組、阿司匹林組大鼠頸背下部皮下注射15%的酵母菌懸液，空白組以10 mL/kg 注射0.9%的生理鹽水。分別監(jiān)測造模后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10（即給藥2、3、4、5、6、7、8、9、10、11）的大鼠體溫，對大鼠的體溫進(jìn)行觀察，然后在各個時刻對其與基本體溫的差異進(jìn)行對照，最終在10 h 之后，按以下公式計(jì)算發(fā)熱抑制率。發(fā)熱抑制率=（模擬組的升溫?cái)?shù)值-藥物組的升溫?cái)?shù)值）/模擬組的升溫?cái)?shù)值×100%。

發(fā)汗模型：取雄性SD 大鼠28 只，隨機(jī)分為空白組、毛果蕓香堿組、扶陽解表中、高劑量組，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 h。扶陽解表中、高劑量組給藥劑量分別為2.56、5.13 g/kg，毛果蕓香堿組灌胃毛果蕓香堿溶液8.75 mg/kg，空白組給予等劑量生理鹽水，灌胃容量15 mg/kg。在實(shí)驗(yàn)開始前，大鼠需要禁食并且不能飲水8 h。給藥30 min 后，將大鼠置于仰臥位置，然后用棉簽蘸取無水乙醇擦拭大鼠的腳掌，接著涂上高原氏A 液。待其完全干燥后，再涂上一層和田-高原氏B 液（將2 g 碘溶解在100 mL 的無水乙醇中，形成和田-高原氏A 液；將50 g 可溶性淀粉溶解在100 mL 的蓖麻油中，形成和田-高原氏B 液），以此來復(fù)制出發(fā)汗模型。及時監(jiān)測足部紫色斑點(diǎn)的變化，并使用微距攝像機(jī)進(jìn)行拍攝和記錄。

1.9.4 標(biāo)本采集 在對每組大鼠進(jìn)行稱重之后，使用以生理鹽水配制成10%水合氯醛（3.5 mL/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，然后從腹主動脈取血，并在取血后靜置1～2 h。離心機(jī)設(shè)置3 000 r/min，離心時間15 min，收集上層血清，并將其存儲在-20 ℃的冰箱中以備后用。將發(fā)熱模型大鼠的肺部組織放入4%的多聚甲醛溶液中，保持24 h 以備后用。

1.9.5 指標(biāo)檢測 采用ELISA 法對大鼠的血液樣本IL-17、IL-1β、TNF-α 和IL-6 的含量進(jìn)行分析；采用HE 染色檢測大鼠肺部病理性情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 24.0 軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是均采取“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較，LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間的比較。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 扶陽解表顆粒的有效成分及靶點(diǎn)篩選

在搜索到的有效成分中，7 個是白術(shù)，9 個是蒼術(shù)，16 個是大黃，21 個是附子，5 個是干姜，5 個是花椒，23 個是麻黃，17 個是升麻，8 個是 細(xì)辛，15 個是知母。共得到1 410 個靶點(diǎn)。

2.2 相關(guān)靶點(diǎn)

病毒性肺炎相關(guān)的靶點(diǎn)基因在Gene Cards、OMIM、Drug Bank、PharmGKB、TTD 數(shù)據(jù)庫中篩選有3 613 個、201 個、27 個、95 個、86 個，去除重復(fù)基因，共檢索到3 007 個與病毒性肺炎相關(guān)的靶點(diǎn)基因。見圖1。

圖1 病毒性肺炎的相關(guān)靶點(diǎn)Fig 1 Relevant targets for viral pneumonia

2.3 潛在靶點(diǎn)

篩選出114 個扶陽解表顆粒治療病毒性肺炎的潛在作用靶點(diǎn)。圖中粉色表示病毒性肺炎的疾病靶點(diǎn)，綠色表示藥物有效成分靶點(diǎn)；交集部分是114個潛在作用靶點(diǎn)。見圖2。

圖2 藥物潛在靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的veen 圖Fig 2 Veen diagram of potential drug targets and diseaserelated targets

2.4 有效成分-潛在靶點(diǎn)

由173 個節(jié)點(diǎn)組成的有效成分-可能的目標(biāo)靶點(diǎn)（圖3），每個節(jié)點(diǎn)都代表著一種特定的藥品，而它們之間的聯(lián)系則通過一條線來展現(xiàn)。由456 條邊組成，箭頭的部位象征著藥品的有效成分，而方形的部位則象征著目標(biāo)靶點(diǎn)。正相關(guān)性在于節(jié)點(diǎn)的尺寸和其度量（degree），即節(jié)點(diǎn)和字體的尺寸越大，其度量就越高。

圖3 活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Active ingredient-core target network diagram

2.5 PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

由114 個節(jié)點(diǎn)以及1 928 條邊構(gòu)成互作圖，其中，節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，而連接的部分則表示這些節(jié)點(diǎn)之間的交互（圖4）。節(jié)點(diǎn)的尺寸以及顏色的深淺與其度數(shù)之間存在著正向的聯(lián)系（圖5）。通過Cytoscape 3.8.2 軟件的CytoNCA 插件對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，從而確定扶陽解表顆粒對抗病毒性肺炎的 核 心 靶 點(diǎn) 為IL6、MAPK1、MAPK8、TNF、AKT1 、MAPK3、TP53、PTSG2。

圖4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Protein-protein interaction network diagram

圖5 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 5 Core target network diagram

2.6 GO 功能富集分析和KEGG 富集分析

GO 富集分析主要針對生物學(xué)步驟（BP）、細(xì)胞構(gòu)造（CC）和分子作用（MF）3 個領(lǐng)域，本研究設(shè)置篩查標(biāo)準(zhǔn)P＜0.05，對前10 個樣本進(jìn)行了圖像分析。GO 的功能聚類分析共計(jì)2 512 個項(xiàng)，包括2 300 個關(guān)于生物過程的項(xiàng)（BP），154 個關(guān)于分子功能的項(xiàng)（MF），以及58 個關(guān)于細(xì)胞構(gòu)造的項(xiàng)（CC）。BP 的研究重點(diǎn)包括脂多糖的響應(yīng)、對于來自細(xì)菌的分子的響應(yīng)以及細(xì)胞對于化學(xué)緊急情況的響應(yīng)。CC 的主要分布區(qū)域包括膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域和核被膜，而MF 則主要聚焦于蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶的活躍度、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合以及泛素樣蛋白連接酶的結(jié)合（圖6）。

圖6 GO 功能富集分析Fig 6 GO functional enrichment analysis

在KEGG 富集分析中，找到179 條KEGG 路徑，并以P＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終選出前30 條進(jìn)行了圖像分析（圖7）。在KEGG 富集分析中，排名前列的是脂質(zhì)動脈粥樣硬化信號通道、人類巨細(xì)胞病毒感染通道、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物信號通道、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通道、腫瘤壞死因子通道等。在圖像中，氣泡的數(shù)量越多，說明通道中基因的富集程度越高。而且，排序靠前，則可能是扶陽解表顆粒治療病毒性肺炎的主要生物學(xué)功能和作用機(jī)制。

圖7 KEGG 通路富集分析Fig 7 Enrichment analysis of KEGG pathway

2.7 有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對接

有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對接的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，故分子對接效果佳。見圖8。

圖8 化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果圖Fig 8 Molecular docking results of compounds and key targets

2.8 扶陽解表顆粒對大鼠炎癥模型血清

TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17 因 子 水 平 的 影 響ELISA 結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-6 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組均可以顯著降低大鼠模型血清TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-6 因子水平（P＜0.01 或P＜0.05），見表1。

表1 扶陽解表顆粒對大鼠血清IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-6 表達(dá)水平（pg/mL，±s，n=7）Tab 1 Expression levels of serum IL-1β， IL-17， TNF-α and IL-6 induced by Fuyang Jiebiao granules in rats（pg/mL，±s，n=7）

表1 扶陽解表顆粒對大鼠血清IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-6 表達(dá)水平（pg/mL，±s，n=7）Tab 1 Expression levels of serum IL-1β， IL-17， TNF-α and IL-6 induced by Fuyang Jiebiao granules in rats（pg/mL，±s，n=7）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01，③P＜0.05。

IL-6 112.11±4.59 134.11±7.82①114.59±7.79②123.45±8.28③115.85±6.49②組別空白組模型組阿司匹林陽性組FYJBKL 中劑量組FYJBKL 高劑量組IL-1β 32.90±1.65 43.62±1.11①33.69±0.97②36.50±1.25②35.39±1.68②IL-17 42.95±1.48 53.83±1.92①45.65±2.02②48.79±0.81②46.40±1.13②TNF-α 259.62±10.33 340.32±7.64①307.11±1.26②305.74±17.39②295.03±19.29②

2.9 扶陽解表顆粒對蛋清致大鼠足腫脹率的影響

與空白組相比，模型組大鼠（0.5、1、2、3、4 h）足腫脹率顯著降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，阿司匹林組大鼠足趾腫脹率都顯著降低（0.5、1、2、3、4 h）（P＜0.01 或P＜0.05），扶陽解表中劑量組（0.5、1、3 h）沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（2、4 h）足趾腫脹率都顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05）；扶陽解表高劑量組大鼠足趾腫脹率都顯著降低（0.5、1、2、3、4 h）（P＜0.01或P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 扶陽解表顆粒對大鼠足趾腫脹率（±s，n=6， %）Tab 2 Effect of Fuyang Jiebiao granules on toe swelling rate in rat（±s，n=6， %）

表2 扶陽解表顆粒對大鼠足趾腫脹率（±s，n=6， %）Tab 2 Effect of Fuyang Jiebiao granules on toe swelling rate in rat（±s，n=6， %）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01，③P＜0.05。

組別空白組模型組阿司匹林陽性組FYJBKL 中劑量組FYJBKL 高劑量組4 h 0.00±0.00 25.76±10.05①9.76±3.73②14.67±8.78③6.30±5.60②0.5 h 0.00±0.00 52.26±15.55①32.20±14.16③48.95±9.61 17.69±11.04②1 h 0.00±0.00 51.91±14.57①29.00±14.76②43.64±7.47 19.34±13.02②2 h 0.00±0.00 41.00±15.66①14.50±9.10②27.10±13.13③11.85±7.63②3 h 0.00±0.00 33.67±13.88①14.80±5.35②28.08±8.01 12.85±4.71②

2.10 扶陽解表顆粒對酵母致大鼠體溫的影響

注射酵母后，與空白對照組比較，模型組1、3、5～10 h 體溫升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01或P＜0.05）。與模型組比較，扶陽解表中劑量組可顯著降低7～10 h 體溫，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05），扶陽解表高劑量組可顯著降低1～4，6～10 h 體溫，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；結(jié)果表明扶陽解表在多個時間點(diǎn)可顯著降低酵母致大鼠的體溫，具有較好的解熱作用。結(jié)果見表3、4。

表3 扶陽解表顆粒對大鼠10 h 體溫變化參數(shù)（±s，n=6）Tab 3 Temperature change parameters of rats induced by Fuyang Jiebiao granules at 10 h（±s，n=6）

表3 扶陽解表顆粒對大鼠10 h 體溫變化參數(shù)（±s，n=6）Tab 3 Temperature change parameters of rats induced by Fuyang Jiebiao granules at 10 h（±s，n=6）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01，③P＜0.05。

組別空白組模型組阿司匹林陽性組FYJBKL 中劑量組FYJBKL 高劑量組5 h 0.19±0.25 0.96±0.50①0.69±0.37 0.42±0.22 0.52±0.07 1 h 0.33±0.20-1.30±0.46①-0.46±0.38②-1.21±0.48-0.70±0.37③2 h-0.02±0.21 0.16±0.46-0.17±0.31-0.17±0.36-0.42±0.12③3 h 0.38±0.08-0.03±0.04①0.30±0.06②0.01±0.14-0.59±0.18②4 h-0.06±0.05-0.04±0.06 0.19±0.08-0.27±0.28-0.30±0.08③

表4 扶陽解表顆粒對大鼠10 h 體溫變化參數(shù)（±s，n=6）Tab 4 Variation parameters of body temperature of rats induced by Fuyang Jiebiao granules at 10 h（±s，n=6）

表4 扶陽解表顆粒對大鼠10 h 體溫變化參數(shù)（±s，n=6）Tab 4 Variation parameters of body temperature of rats induced by Fuyang Jiebiao granules at 10 h（±s，n=6）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01，③P＜0.05。

組別空白組模型組阿司匹林陽性組FYJBKL 中劑量組FYJBKL 高劑量組10 h 0.31±0.12 2.28±0.31①0.96±0.24②1.35±0.40②1.28±0.25②6 h 0.44±0.02 1.90±0.85①0.28±0.17②1.47±0.67 0.78±0.17③7 h-0.06±0.13 2.41±0.62①1.60±0.47②1.54±0.29③1.46±0.49②8 h 0.12±0.11 2.77±0.57①1.31±0.16②1.57±0.15②1.66±0.25②9 h 0.11±0.29 2.42±0.53①1.24±0.31②1.56±0.28②1.51±0.32②

2.11 扶陽解表顆粒對酵母致大鼠發(fā)熱抑制率的影響

發(fā)熱抑制率計(jì)算結(jié)果顯示，扶陽解表高、中劑量組在5～10 h 的個時間點(diǎn)對酵母致大鼠發(fā)熱均有不同程度的抑制作用。從表5 看出，阿司匹林在6 h抑制率最高為85.26%，而扶陽解表中劑量在5 h 的抑制率最高為56.25%，高劑量在6 h 的抑制率最高為58.95%。

表5 大鼠發(fā)熱抑制率（%）Tab 5 Inhibitory rate of fever in rats（%）

2.12 扶陽解表顆粒對大鼠足跖汗液分泌的影響

扶陽解表顆粒各劑量組的空泡汗斑數(shù)明顯高于正常對照組，與毛果蕓香堿組比較，扶陽解表中劑量組發(fā)汗作用略差，而高劑量組與毛果蕓香堿組的發(fā)汗作用作用相當(dāng)。見表6。

表6 扶陽解表對大鼠足跖部汗斑數(shù)（±s，n=6）Tab 6 The number of sweat spots on the plantar of the foot of rats induced by Fuyang Jiebei（±s，n=6）

表6 扶陽解表對大鼠足跖部汗斑數(shù)（±s，n=6）Tab 6 The number of sweat spots on the plantar of the foot of rats induced by Fuyang Jiebei（±s，n=6）

注：與空白組比較，①P＜0.01。

汗斑數(shù)（個）89.33±30.00 258.33±21.50①196.00±18.52①228.33±24.68①組別空白組毛果蕓香堿組FYJBKL 中劑量組FYJBKL 高劑量組

2.13 HE 染色光鏡觀察

在正常組中，大鼠的肺支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)保持完好，肺內(nèi)未見炎癥細(xì)胞的浸潤；在模型組中，大鼠的肺部組織纖維化程度較高，肺泡壁厚度增大，炎性細(xì)胞浸潤也有所增加；然而，在陽性組中，肺組織纖維化程度有所緩解，肺泡開始擴(kuò)大，肺間質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤的情況并未發(fā)生，相較于模型組，肺組織損傷程度有了顯著的降低。所有藥物組都能在一定程度上改善肺組織纖維化和炎癥滲出的狀況。見圖9。

圖9 大鼠肺組織結(jié)果圖Fig 9 Results of rat lung tissue

3 討論

病毒性肺炎的主要表現(xiàn)形式就是對肺部的深層和中層進(jìn)行攻擊，導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生，通常出現(xiàn)在長期患有疾病或免疫系統(tǒng)不健康的人群中。若病情控制不佳，將會對生命構(gòu)成威脅，例如冠狀病毒肺炎的爆發(fā)。因此，研究新的藥物來緩解和控制這種病癥已經(jīng)變得非常緊迫［10-13］?！端氖覙小分赋?，“外感之邪，秋冬傷寒，春夏病溫，寒溫之外，乃有疫”，這是對病毒性肺炎的中醫(yī)定義。中醫(yī)治療疫病有著數(shù)千年的寶貴經(jīng)驗(yàn)，擁有全面的治療方法，如針對性的診斷和治療，以及針對不同目標(biāo)和不同路線的干預(yù)［14］。王亞勤等［15］運(yùn)用了分消三焦、保護(hù)肺部和脾臟的營養(yǎng)，調(diào)整和改善病毒性肺炎病人的呼吸狀況。趙杰教授認(rèn)為陽氣是保持身體健康的重要因素，病毒性肺炎患者的表面看起來有濕濁的病毒夾雜，但實(shí)際上陽氣的虛弱是最主要的原因。因此，趙杰教授根據(jù)經(jīng)典名方麻黃附子細(xì)辛湯和大建中湯進(jìn)行改良和創(chuàng)新，以“扶陽辟疫法”為理論依據(jù)，創(chuàng)立了扶陽解表方，以恢復(fù)陽氣，提高身體的免疫力。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對藥物靶點(diǎn)活性成分預(yù)測發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素、山奈酚等化合物為度值靠前的活性成分。ACE2、MPro 和PLP 是抗SARS-CoV-2 病毒藥物篩選的重要靶點(diǎn)，是病毒感染宿主細(xì)細(xì)胞中的重要分子之一［16-19］，故對其也做分子對接。分子對接結(jié)果示，槲皮素、木犀草素、山奈酚等化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)均有良好的結(jié)合力。

探索發(fā)現(xiàn)扶陽解表顆粒治療病毒性肺炎的核心 靶 點(diǎn) 有IL6、MAPK1、MAPK8、TNF、AKT1 、MAPK3、TP53、PTSG2 等，大多數(shù)與炎癥反應(yīng)相關(guān)；GO 富集分析顯示潛在靶點(diǎn)與生物學(xué)過程相關(guān)，如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子等。細(xì)胞因子風(fēng)暴在病毒感染中發(fā)揮著極為重要的作用［20］。其中誘發(fā)病毒性肺炎患者的關(guān)鍵炎癥因子主要包括TNF-α 和IL-6［21］。此 外，IL-6 指標(biāo)變 化 可引做COVID-19 重型、危重型的評估［22］。MAPK1、MAPK3和MAPK8 也可通過細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等生 物 過 程 來 防 治COVID-19［22］。Cox-2/PTGS2 在多個組織和器官的炎癥反應(yīng)中起著重要作用［23］。此外，在新冠肺炎的預(yù)防和治療過程中，Cox-2/PTGS2 的抑制劑被廣泛應(yīng)用于COVID-19 的治療［24］。

KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)30 條信號路徑（P＜0.05），路徑涵蓋了白細(xì)胞介素17 信號路徑（IL-17 signaling pathway）、人類巨細(xì)胞病毒感染路徑（human cytomegalovirus infection）、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感/染路徑（Kaposi's sarcoma-as-sociated herpesvirus infection）、NF-κB 信號通路等。促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄受NF-κB 信號通路調(diào)控，NF-κB 是多種損傷反應(yīng)基因的多效調(diào)節(jié)因子［24］。Toll 樣受體（TLR）通過利用自身中的基因多態(tài)性導(dǎo)致自身免疫性疾病的風(fēng)險增加［25］。機(jī)體的免疫反應(yīng)與T 細(xì)胞受體信號通路異常關(guān)聯(lián)密切，因此T 細(xì)胞受體通路可能是治療病毒性肺炎的通路之一［26，27］。白細(xì)胞介素（IL-17） 家族是肺部炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)［28］。IL-17 信號通路、TNF 信號通路和糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE 信號通路、已被證實(shí)與SARSCoV-2 感染相關(guān)［29-31］。因此，扶陽解表顆粒可能通過參與炎癥多個靶點(diǎn)TNF、PTGS2 和IL-6 等作用于抗病毒、抗炎機(jī)制相關(guān)通路。

本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的基礎(chǔ)上建立不同的大鼠病理模型，進(jìn)一步探討扶陽解表顆粒對病毒性肺炎相關(guān)癥狀的改善及可能的作用機(jī)制。中藥組可以明顯降低炎癥模型大鼠血中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 水平表達(dá)；能不同程度地改善肺組織病理性現(xiàn)象，如纖維化及炎癥滲出；另本研究選用經(jīng)典動物模型考察了扶陽解表的抗炎、解熱、發(fā)汗作用，并對其作用機(jī)理進(jìn)行了探討，充分體現(xiàn)了其多途徑、多靶點(diǎn)、多成分的整體特征，為后續(xù)對扶陽解表顆粒臨床應(yīng)用提供了有效科學(xué)支撐。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了扶陽解表顆粒的活性成分、潛在靶點(diǎn)及相關(guān)通路，初步探索扶陽解表顆粒治療病毒性肺炎的作用靶點(diǎn)及機(jī)制，并運(yùn)用分子對接技術(shù)、藥效學(xué)進(jìn)行研究。然而，這項(xiàng)研究也存在一些限制，例如，從數(shù)據(jù)庫中篩選出的中藥有效成分與實(shí)際被人體吸收進(jìn)入體內(nèi)的藥物成分并不完全一致，需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)，且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的核心靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，明確其作用機(jī)制，為扶陽解表顆粒的臨床使用提供有力支持。

作者貢獻(xiàn)度說明：

譚丹丹：負(fù)責(zé)實(shí)施實(shí)驗(yàn)、文稿撰寫；趙杰：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)思路設(shè)計(jì)；馮振宇、孟霜：負(fù)責(zé)論文指導(dǎo)及校審。王旭艷、王鑫鑫：參與實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)分析和指標(biāo)檢測；趙建平：補(bǔ)充部分內(nèi)容。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。