易 林，張文豪，向文遠(yuǎn)，石正譽(yù)，熱米拉·艾買(mǎi)提，鄧迎杰，方 銳

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830099）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，主要病理特征包括軟骨、半月板和軟骨下骨的進(jìn)行性改變以及滑膜炎癥［1］。軟骨細(xì)胞是軟骨組織中唯一的細(xì)胞種類，具有維持和修復(fù)軟骨組織的作用［2］，軟骨細(xì)胞凋亡導(dǎo)致軟骨變性及喪失功能，最終引發(fā)OA［3，4］。由于骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制涉及多種復(fù)雜過(guò)程［5］，其確切機(jī)制尚不清楚，因此，有必要尋找有效的臨床治療方案。目前，非甾體抗炎藥常用于緩解OA 的癥狀，但長(zhǎng)期副作用不可避免［6］。近年來(lái)，中藥與常規(guī)治療的結(jié)合引發(fā)研究人員興趣，中藥副作用更小、成本更低、易于獲得［7，8］。研究表明中藥單體促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制損傷軟骨細(xì)胞的凋亡［9，10］，同時(shí)中藥復(fù)方在治療OA 中也展現(xiàn)出療效全面和安全可靠的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［11］。補(bǔ)腎痹通方是新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院王繼先教授臨床經(jīng)驗(yàn)方，前期臨床研究表明［12］，補(bǔ)腎痹通方改善患者關(guān)節(jié)功能并降低患者疼痛和血清中TNF-α、IL-6 水平，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在觀察補(bǔ)腎痹通方對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響，并研究其通過(guò)調(diào)節(jié)SOX9/NF-κB/MMP-13 信號(hào)通路的作用機(jī)理，探討補(bǔ)腎痹通方治療OA 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物 20 只8 周齡的SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，用于制備補(bǔ)腎痹通方含藥血清和提取軟骨細(xì)胞，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2023-0002，實(shí)驗(yàn)方案由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)號(hào)為IACUC-20230227-25）。補(bǔ)腎痹通方由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院提供，組成包括地龍9 g，牛膝、熟地黃、杜仲、雞血藤、骨碎補(bǔ)、黃芪各15 g、川芎、防風(fēng)、當(dāng)歸、獨(dú)活、紅花各12 g，將溶液濃縮至濃度為1 g/mL，并置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，16140089、A3705001）；IL-1β （NeoBioscience；ERC007QT.96.2）；CCK-8 試劑盒、Annexin VAPC/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Elabscience，ECK-A362、E-CK-A218）；SOX9、MMP-13、NF-κBp65、BAX、Caspase-3、Bcl-2 抗 體（Affinity，AF6330、AF5355、AF5006、AF0120、AF7022、AF6139）；山羊抗鼠IgG 二抗（Affinity，S0002）；II 型膠原酶（Sigma，C-6885）；TNF-α、IL-6、bFGF 試劑盒（MULTISCIENCES 公司，70-EK182HS-96、70-EK106/2、70-EK1F032）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，IX51）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo 公司，311 型）；NovoCyte 型流式細(xì)胞儀（ACEA Biosciences，2040R）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清制作 根據(jù)人-大鼠體表面積比值［13］，大鼠服用補(bǔ)腎痹通方劑量為25.77 g·kg-1·d-1，連續(xù)灌胃7 d，2 次/日，最后1 次給藥2 h 后，給大鼠注射戊巴比妥鈉20 mg/kg 進(jìn)行腹腔麻醉，無(wú)菌條件采集腹主動(dòng)脈血液，經(jīng)過(guò)1 h 的靜置后，使用離心機(jī)在1 500 r/min 的速度下離心20 min，分離得到血清。隨后，在56 ℃環(huán)境中失活30 min，并進(jìn)行過(guò)濾處理后將其保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 大鼠采用頸椎脫臼法處死，將關(guān)節(jié)軟骨用無(wú)菌手術(shù)刀刮取并進(jìn)行3 次PBS 沖洗。隨后將軟骨切成1 mm3大小的塊狀，收集至50 mL 離心管中。加入10 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶，并在37 ℃培養(yǎng)箱中消化2 h。之后以1 000 r/min 離心3 min，收集細(xì)胞沉淀。經(jīng)PBS 清洗后，將細(xì)胞懸浮于DMEM 中，并將分離的軟骨細(xì)胞放置于25 cm2培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，取第3 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用多聚甲醛固定細(xì)胞，加入Ⅱ型膠原抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 洗滌3 次，然后加入熒光二抗，放置在室溫下避光孵育1 h，接著加入DAPI 染色液，使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 CCK8 檢測(cè) 將第3 代軟骨細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到96 孔板中。待細(xì)胞貼壁后，加入0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%濃度的含藥血清，并進(jìn)行24 h 干預(yù)。每孔加入50 μL CCK8 試劑，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔450 nm 處的吸光度值。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 取第3 代生長(zhǎng)良好的軟骨細(xì)胞按1×105個(gè)/mL 的密度接種在2 塊六孔板中，采用含10 ng/mL IL-1β 的10%FBS/DMEM 培 養(yǎng) 基 干 預(yù)24 h 后，5 mL 接種于直徑6 cm 培養(yǎng)皿，將細(xì)胞隨機(jī)分為5 組，即Control 組、IL-1β 組、IL-1β+BSBT（L）組、IL-1β+BSBT（M）組、IL-1β+BSBT（H）組（5%、10%、15%BSBT 含藥血清）。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取上述分組的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)24 h，使用0.25%胰酶消化收集軟骨細(xì)胞。用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，加500 μL 結(jié)合緩沖液，混 懸 細(xì) 胞。加5 μL AnnexinV-FITC 和5 μL 碘化丙啶，混勻后，放置在室溫下避光孵育10 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 Western blot 法檢測(cè) 收集各組軟骨細(xì)胞樣品，參照試劑盒提取軟骨細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)量蛋白濃度。蛋白使用SDS-PAGE 凝膠電泳，將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，并使用5%脫脂奶粉的封閉液在室溫下封閉1 h，加入稀釋的SOX9（1∶1 000）、MMP-13（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、BAX（1∶1 500）、Caspase-3（1∶1 500）、Bcl-2（1∶1 500）、GAPDH（1∶1 000）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜，加入稀釋的山羊抗鼠IgG 二抗（1∶3 000）孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL 顯影液，上機(jī)曝光成像。Image J 軟件分析各蛋白的表達(dá)水平，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 ELISA 檢測(cè) 收集各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀450 nm 處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后，測(cè)量各組樣品吸光度值，分別檢測(cè)上清中TNF-α、IL-6、bFGF 含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞的形態(tài)及其鑒定

培養(yǎng)24 h 后，細(xì)胞貼壁，開(kāi)始伸展，體積較小，均勻散在生長(zhǎng)。第3 代軟骨細(xì)胞狀態(tài)良好，形態(tài)多為三角形或多角形，形態(tài)飽滿，呈明顯的“鋪路石”狀。經(jīng)Ⅱ型膠原免疫熒光染色后，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色熒光，經(jīng)DAPI 染色后，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。見(jiàn)圖1。

圖1 軟骨細(xì)胞的形態(tài)及鑒定（×200）Fig 1 Morphology and identification of chondrocytes （×200）

2.2 補(bǔ)腎痹通方含藥血清對(duì)正常軟骨細(xì)胞增殖的影響

不同濃度補(bǔ)腎痹通方含藥血清干預(yù)軟骨細(xì)胞24 h 后，與0%含藥血清組比較，5%、10%和15%濃度組促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖（n=3，P＜0.05），20%濃度組未見(jiàn)明顯差異，25%、30%濃度組顯著抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05），采用5%、10%、15%濃度組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖2。

圖2 補(bǔ)腎痹通方含藥血清對(duì)正常軟骨細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Effect of BSBT-containing serum on the proliferation of normal chondrocytes

2.3 補(bǔ)腎痹通方含藥血清對(duì) IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖的影響

與Control 組比較，IL-1β 組軟骨細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.01）。與IL-1β 組比較，IL-1β+BSBT（L）組、IL-1β+BSBT（M）組、IL-1β+BSBT（H）組軟骨細(xì)胞活性顯著增加（n=3，P＜0.05，P＜0.01）；與IL-1β+BSBT（L）組比較，IL-1β+BSBT（M）組與IL-1β+BSBT（H）組軟骨細(xì)胞活性顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 各組軟骨細(xì)胞的增殖情況Fig 3 Proliferation of chondrocytes in each group

2.4 補(bǔ)腎痹通方含藥血清對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的影響

與Control 組比較，IL-1β 組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。與IL-1β 組比較，IL-1β+BSBT（L）組、IL-1β+BSBT（M）組、IL-1β+BSBT（H）組軟骨細(xì)胞的凋亡率顯著下降（n=3，P＜0.01）；與IL-1β+BSBT（L）組比較，IL-1β+BSBT（M）組與IL-1β+BSBT（H）組軟骨細(xì)胞的凋亡率顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 補(bǔ)腎痹通方含藥血清對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的影響Fig 4 Effects of BSBT-containing serum on IL-1β-induced chondrocyte apoptosis

2.5 補(bǔ)腎痹通方含藥血清對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Control 組比較，IL-1β 組軟骨細(xì)胞中BAX、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（n=3，P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與IL-1β 組比較，IL-1β+BSBT（L）組、IL-1β+BSBT（M）組、IL-1β+BSBT（H）組軟骨細(xì)胞中BAX、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與IL-1β+BSBT（L）組比較，IL-1β+BSBT（M）組與IL-1β+BSBT（H）組軟骨細(xì)胞中BAX、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 蛋 白 表 達(dá) 水 平 顯 著 升 高（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 補(bǔ)腎痹通方含藥血清對(duì)凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effects of BSBT-containing serum on the expression of apoptotic proteins

2.6 補(bǔ)腎痹通方含藥血清對(duì)SOX9/NF-κB/MMP-13 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

與Control 組 比 較，IL-1β 組 軟 骨 細(xì) 胞 中SOX9蛋白表達(dá)顯著降低（n=3，P＜0.01），NF-κB p65、MMP-13 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與IL-1β 組比較，IL-1β+BSBT（L）組、IL-1β+BSBT（M）組、IL-1β+BSBT（H）組軟骨細(xì)胞中SOX9 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），NF-κB p65、MMP-13 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與IL-1β+BSBT（L）組比較，IL-1β+BSBT（M）組、IL-1β+BSBT（H）組軟骨細(xì)胞中SOX9 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），NF-κB p65、MMP-13 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 補(bǔ)腎痹通方含藥血清對(duì)SOX9/NF-κB/MMP-13 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Effects of BSBT-containing serum on protein expression of SOX9/NF-κB/MMP-13 signaling pathway

2.7 補(bǔ)腎痹通方含藥血清對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6 和bFGF 水平的影響

與Control 組比較，IL-1β 組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6 含量顯著升高（P＜0.01），bFGF 含量 顯 著 降 低（P＜0.01）；與IL-1β 組 比 較，IL-1β+BSBT（L）組、IL-1β +BSBT（M）組、IL-1β+BSBT（H）組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），bFGF 含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與IL-1β+BSBT（L）組比較，IL-1β+BSBT（M）組、IL-1β+BSBT（H）組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6 含量顯著降低（P＜0.01），bFGF 含量顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖7。

圖7 不同濃度補(bǔ)腎痹通方含藥血清對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6 和bFGF 含量的影響Fig 7 Effects of different concentrations of BSBT-containing serum on the contents of TNF-α， IL-6 and bFGF in the supernatants of IL-1β-induced chondrocyte cultures

3 討論

中醫(yī)學(xué)多將OA 歸于“痹癥”范疇，屬慢性筋骨病，《素問(wèn)·宣明五氣》提及“腎為先天之本，主骨，生髓”。OA 常因日久不愈，主要表現(xiàn)為氣滯血瘀、腎陽(yáng)虛損等病機(jī)特點(diǎn)。地龍、牛膝、熟地黃、雞血藤、骨碎補(bǔ)等藥物具有活血化瘀、強(qiáng)壯筋骨、消腫止痛的功效，作用于治療OA 引起的疼痛和炎癥；而黃芪、川芎、紅花等藥物能夠扶正固表、活血祛風(fēng)，有助于調(diào)整人體的免疫功能和抗炎能力；杜仲、獨(dú)活、防風(fēng)、當(dāng)歸等藥物則具有溫腎助陽(yáng)、強(qiáng)筋壯骨的功效，對(duì)于腎陽(yáng)虛弱引起的關(guān)節(jié)痛和活動(dòng)受限也能發(fā)揮積極的療效。團(tuán)隊(duì)前期臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)均表明補(bǔ)腎痹通方治療OA 療效顯著，臨床上該方加減明顯緩解患者功能障礙和疼痛，降低患者血清中炎癥因子［12］；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明該方可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥與免疫改善軟骨微環(huán)境［14］。

在OA 中，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解產(chǎn)物會(huì)激活細(xì)胞表面的機(jī)械感受器、細(xì)胞因子受體，分泌炎性細(xì)胞因子，如IL-1β、TNF-α、IL-6 等［15，16］。其中IL-1β干擾結(jié)構(gòu)蛋白，影響軟骨細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的合成，破壞軟骨成分［17］，常用于構(gòu)建體外OA 模型。bFGF 是一種促進(jìn)細(xì)胞分裂的肝素結(jié)合蛋白，能夠誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成［18］。近年來(lái)，中藥多靶點(diǎn)的藥理研究在抑制炎性細(xì)胞因子和促進(jìn)生長(zhǎng)因子方面具有顯著效果［19，20］。本研究結(jié)果顯示BSBT 提高IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活性，降低軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6 水平，提高bFGF 水平，并減少軟骨細(xì)胞凋亡率。

軟骨細(xì)胞凋亡導(dǎo)致基質(zhì)降解酶上調(diào)和細(xì)胞外基質(zhì)丟失，是OA 的關(guān)鍵病理因素之一［21］。Bcl-2 家族蛋白是一組參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的蛋白家族［22］，可分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白包含Bcl-2、Bcl-XL 等，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜電位、控制線粒體膜通透性等機(jī)制，抵抗引起細(xì)胞凋亡的刺激［23］。促凋亡蛋白包含Bax、Bak 等，它們?cè)诘蛲鲂盘?hào)的刺激下活化，增加線粒體膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)分子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡［24］。除Bcl-2 家族蛋白外，半胱氨酸蛋白酶也是軟骨細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白［25］。在軟骨細(xì)胞中，Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9 是主要參與凋亡 過(guò) 程 的 成 員［26，27］。流 式 檢 測(cè) 結(jié) 果 顯 示，BSBT 具有顯著的抗細(xì)胞凋亡作用，同時(shí)BSBT 可以降低IL-1β 誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3 和Bax的表達(dá)，并增加Bcl-2 的表達(dá)。

SOX9 被廣泛認(rèn)為是軟骨細(xì)胞分化和軟骨基質(zhì)合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等過(guò)程中均發(fā)揮作用［28，29］。NF-κB 是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，能夠調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，包括炎性因子、細(xì)胞因子和凋亡相關(guān)因子［30］，與OA 的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［31］。研究表明［32］，NF-κB 信號(hào)通路可以通過(guò)直接或間接調(diào)節(jié)SOX9 的表達(dá)來(lái)調(diào)控軟骨細(xì)胞分化和基質(zhì)合成。MMP-13 是一種酶類蛋白質(zhì)，它的產(chǎn)生與多種因素有關(guān)，包括OA 引起的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子的影響等，過(guò)度表達(dá)與OA 的發(fā)展密切相關(guān)［33，34］。本研究發(fā)現(xiàn)BSBT 能夠增加IL-1β 誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SOX9 的表達(dá)水平，抑制NF-κB 通路的活化，降低MMP-13 的表達(dá)，減少軟骨細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，補(bǔ)腎痹通方可顯著降低IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)SOX9/NF-κB/MMP-13 信號(hào)通路，調(diào)控凋亡因子的釋放，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：向文遠(yuǎn)；實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)：鄧迎杰；實(shí)驗(yàn)實(shí)施：易林、張文豪；資料收集：石正譽(yù)、熱米拉·艾買(mǎi)提；做圖成文：易林，方銳審校；基金獲取：向文遠(yuǎn)、鄧迎杰、方銳。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。