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益肝膠囊對藥物性肝損傷大鼠HMGB1、RAGE 和NF-κB 蛋白表達的影響

2024-03-12 09:28齊雅芝翟燕玲韓玉生
關(guān)鍵詞:低劑量膠囊通路

唐 婭,李 君,齊雅芝,曹 睿,翟燕玲,韓玉生,徐 強

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

結(jié)核病作為全球第二大單一感染源,其致死率僅次于新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)[2]??菇Y(jié)核藥物性肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury,ATB-DILI)是一種發(fā)生率較高的結(jié)核病治療不良反應(yīng)[3]。研究表明,高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)是介導(dǎo)慢性和急性肝病發(fā)病機制的關(guān)鍵蛋白,包括APAP 誘導(dǎo)的藥物性肝損傷(DILI)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、HBV 導(dǎo)致的肝病、肝纖維化、肝癌和急性肝衰竭[4],HMGB1 與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)在肝組織中廣泛表達[5]。肝細胞損傷時,大量釋放的HMGB1 會誘導(dǎo)促炎細胞因子的分泌、免疫細胞的聚集,使炎癥反應(yīng)持續(xù)不間斷的發(fā)生,使肝損傷進一步加重[4]。

目前西醫(yī)對ATB-DILI 防治沒有有效的手段,中醫(yī)藥具有多組分、多靶點和副作用少等特點,在臨床防治ATB-DILI 方面具有獨特優(yōu)勢。益肝膠囊是治療肝損傷的經(jīng)驗方,臨床上用于肝損傷的防治療效顯著,前期實驗研究表明其具有抗炎、抑制HMGB1 蛋 白 表 達 及 抗 脂 質(zhì) 過 氧 化 等 作 用[6,7]。本實驗中采用異煙肼(isoniazid,INH)和利福平(rifampicin,RFP)聯(lián)合用藥復(fù)制ATB-DILI 的大鼠模型,研究益肝膠囊是否通過HMGB1/RAGE/NF-κB 信號通路對ATB-DILI 起到保護作用,為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級,SD 雄鼠,體重(160~180) g,遼寧長生生物技術(shù)有限公司,許可證編號:SCXK(遼)2020-0001。飼養(yǎng)一個星期后開始實驗。

1.2 藥品與試劑

廣東華南制藥異煙肼片(H44020699)、利福平膠囊(H44020771);苦參、丹參、五味子、按照1∶3∶3的比例配制成益肝膠囊(藥材購于北京同仁堂藥房哈爾濱分店);ALT(批號C009-2-1)、AST(批號C010-2-1)、ALP(批號A059-2-2)、γ-GT(批號C017-2-1)、TBIL(批號C019-1-1)檢測試劑盒(南京建成生物);兔抗TNF-α(bs-10802R)、兔抗IL-1β(bs-0812R)、兔抗RAGE(bs-0177R)、兔抗β-Actin(bs-0061R)(北京博奧森);兔抗NF-κBp65(bs-0664R)(博士德);兔抗HMGB1(P09429)(江蘇親科生物);兔二步法試劑盒(PV-6001)(北京中杉金橋);抗兔IgG-HRP(bs-0295G-HRP)、DAB 顯色劑、預(yù)染廣譜蛋白Marker(北京博奧森);BCA 試劑盒、電泳SDSPAGE 試劑(江蘇碧云天);PVDF 膜(美國Millipore);及其余試劑均為國產(chǎn)。

1.3 實驗儀器

酶標儀(型號:DNM-9602,北京普朗新技術(shù)有限公司生產(chǎn));組織切片機(型號:YD-1508B,浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn));正置熒光顯微鏡FR-4A(上海光學(xué)儀器廠);Motic3000 顯微攝影成像系統(tǒng)(美國Motic);iCEN-24R 型臺式高速冷凍離心機(杭州奧盛儀器有限公司);Tanon EPS-300 型電泳儀(上海天能科技有限公司);Tanon VE-186 電泳槽(上海天能科技有限公司);Tanon VE-180B 轉(zhuǎn)膜槽(上海天能科技有限公司);Tanon-4600 凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);Image-pro plus6.0 圖像分析軟件。

1.4 分組與給藥

24 只大鼠隨機分為4 組(空白組、模型組、益肝膠囊低劑量組、益肝膠囊高劑量組)。除空白組(n=6)外,其余18 只用50 mg/kgINH+50 mg/kgRFP混合液[8](INH 溶于無菌蒸餾水中,RFP 溶于pH3.0的鹽酸溶液),連續(xù)灌胃28 d 復(fù)刻模型。模型復(fù)刻成功后,連續(xù)灌胃益肝膠囊低劑量(0.468 g/kg)、高劑量(1.872 g/kg)4 周,余下2 組灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液[1]。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 HE 染色觀察肝組織病理變化 最后一次灌胃后,將大鼠禁食但不禁水12 h。腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,剖取出肝,先經(jīng)10%的中性甲醛固定48 h,再將組織進行脫水、透明,然后再經(jīng)石蠟包埋切片、最后HE 染色觀察;其余組織保存于-80 ℃冰箱中待測。

1.5.2 檢測大鼠血清中肝功能指標 取材時用真空采血管采集適量血液,4 ℃放置12 h 后,3 500 r/min 離心10 min 后取上清,按試劑盒說明書對ALT、AST、ALP、γ-GT、TBIL 進行檢測。

1.5.3 IHC 檢 測 肝 組 織 中HMGB1、NF-κBp65、RAGE 蛋白表達 使用“1.5.1”項下制備好的肝組織石蠟切片,再由PV 二步法測肝臟中HMGB1、NF-κBp65 和RAGE 蛋白,切片 經(jīng)脫蠟至水、微波抗原修復(fù)、一抗孵育(濃度為1∶100)4 ℃過夜、二抗孵育、顯色、復(fù)染、脫水透明封片后,用Motic3000 顯微鏡攝影系統(tǒng)拍攝照片,每張切片隨機選取3 個不連續(xù)視野,使用Image-pro plus6.0 圖像分析軟件分析所選區(qū)域內(nèi)的陽性表達。取陽性表達的平均積分光密度(IOD)表示蛋白的相對表達量。

1.5.4 WB 檢 測 肝 組 織 中HMGB1、NF-κBp65、RAGE、TNF-α 和IL-1β 蛋白表達 取適量肝組織加入RIPA 蛋白裂解液,經(jīng)研磨、低溫離心機離心、抽取上清、金屬浴蛋白變性等步驟獲取樣品。然后再上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4 ℃孵育過夜(濃度為1∶1 000)、洗膜、二抗孵育(濃度為1∶2 000)、ECL顯色后進行拍攝。再用Imagej-win64 軟件測量各組目的蛋白條帶及內(nèi)參蛋白條帶的灰度值,然后計算出目的蛋白條帶灰度值比內(nèi)參蛋白條帶灰度值的結(jié)果,用其來表示目的蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析,所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示,實驗數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA 分析,組間比較采用t檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

實驗期間,空白大鼠的飲食和飲水都正常,其行為活躍,動作靈活,毛發(fā)光滑整潔,尿液正常;RIF+INH 模型組大鼠則表現(xiàn)出呆滯、活動遲緩、進食量下降、毛發(fā)黃而干燥、尿液呈黃色、糞便呈不同程度的橙色變化;相比之下,接受益肝膠囊治療的大鼠各種表現(xiàn)明顯優(yōu)于模型組。

2.2 益肝膠囊對ATB-DILI 大鼠肝組織病理損傷的影響

于顯微鏡下觀察,空白組(A)肝組織結(jié)構(gòu)完整,肝板以中央靜脈為中心呈放射狀排列,沒有炎細胞浸潤;與空白組相比,模型組(B)肝組織排列出現(xiàn)紊亂,細胞核固縮數(shù)量增加,肝細胞有腫脹、融合,胞質(zhì)胞核的界限不清晰,炎細胞數(shù)量增多,局部可見肝組織呈點狀壞死;與模型組比較,益肝膠囊治療組肝細胞結(jié)構(gòu)清晰,肝小葉排列整齊,細胞核固縮數(shù)量減少,炎細胞數(shù)量減少,且高劑量組(D)比低劑量組(C)效果更顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色結(jié)果(×200)Fig 1 HE staining results of rat liver tissue in each group (× 200)

2.3 益肝膠囊對ATB-DILI 大鼠血清中肝功指標的影響

模型組ALT、AST、ALP、γ-GT、TBIL 的含量較空白組顯著升高(P<0.05);給予益肝膠囊后,大鼠血清中上述肝功指標有明顯改善(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、TBIL 水平比較(n=6,±s)Tab 1 The levels of ALT, AST, ALP, γ-GT and TBIL in serum of rats in each group were compared (n=6,±s)

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、TBIL 水平比較(n=6,±s)Tab 1 The levels of ALT, AST, ALP, γ-GT and TBIL in serum of rats in each group were compared (n=6,±s)

注:與空白組比較, *P<0.05;與模型組比較, #P<0.05。

組別空白模型低劑量高劑量TBIL(μmol/L)5.07±0.25 13.76±0.77*9.58±0.56#8.15±0.35#ALT(U/L)48.02±4.38 76.51±5.28*63.15±2.46#56.27±3.74#AST(U/L)84.07±4.40 142.71±6.38*118.95±5.96#105.30±8.04#ALP(U/L)180.54±13.24 308.10±14.21*247.93±10.65#225.21±77.02#γ-GT(U/L)61.28±4.65 107.97±6.53*87.22±3.54#79.52±2.31#

2.4 益肝膠囊對ATB-DILI 大鼠肝組織中NFκBp65、RAGE、HMGB1 的影響

IHC 結(jié)果顯示NF-κBp65、RAGE 和HMGB1 蛋白主要表達在肝細胞質(zhì)中,呈黃色或棕黃色樣。與空白組相比,模型組大鼠肝組織中黃色或棕黃色樣的表達明顯增加(P<0.05);而益肝膠囊各治療組黃色或棕黃色的表達明顯減少(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組大鼠肝組織NF-κBp65、RAGE、 HMGB1 蛋白表達(n=6,±s)Tab 2 Expression of NF-κBp65, RAGE and HMGB1 protein in liver tissue of rats in each group(n=6,±s)

表2 各組大鼠肝組織NF-κBp65、RAGE、 HMGB1 蛋白表達(n=6,±s)Tab 2 Expression of NF-κBp65, RAGE and HMGB1 protein in liver tissue of rats in each group(n=6,±s)

注:與空白組比較, *P<0.05;與模型組比較, #P<0.05。

組別空白模型低劑量高劑量HMGB1 78.32±3.37 171.57±5.69*115.25±3.76#85.39±4.01#NF-κBp65 97.58±6.27 162.15±1.49*144.43±2.10#123.69±3.52#RAGE 56.88±2.85 225.63±13.96*105.95±2.08#68.52±11.26#

圖2 各組大鼠肝組織NF-κBp65、RAGE、 HMGB1 蛋白陽性表達(IHC,×200)Fig 2 Positive expression of NF-κBp65, RAGE and HMGB1 protein in liver tissue of rats in each group(IHC,×200)

2.5 益肝膠囊對ATB-DILI 大鼠肝組織TNF-α 和IL-1β 蛋白表達的影響

WB結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組大鼠肝組織中TNF-α 和IL-1β 蛋白表達均不同程度的升高(P<0.05);與模型組相比較,益肝膠囊各治療組TNF-α和IL-1β蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組大鼠肝組織TNF-α 和IL-1β 的水平比較(n=3,±s)Tab 3 Comparison of TNF-α and IL-1β levels in liver tissue of rats in each group(n=3,±s)

表3 各組大鼠肝組織TNF-α 和IL-1β 的水平比較(n=3,±s)Tab 3 Comparison of TNF-α and IL-1β levels in liver tissue of rats in each group(n=3,±s)

注:空白組比較, *P<0.05;與模型組比較, #P<0.05。

IL-1β/β-Actin 0.68±0.01 1.15±0.02*0.85±0.01#0.81±0.02#組別空白模型低劑量高劑量TNF-α/β-Actin 0.74±0.02 1.19±0.04*0.87±0.04#0.79±0.02#

圖3 各組大鼠肝組織NF-κBp65、RAGE、HMGB1 等蛋白表達電泳圖Fig 3 Electrophoretogram of NF-κBp65, RAGE and HMGB1 protein expression in liver tissue of rats in each group

2.6 益肝膠囊對ATB-DILI 大鼠肝組織NFκBp65、RAGE、HMGB1 蛋白表達的影響

WB 結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組大鼠肝組織中NF-κBp65、RAGE、HMGB1 蛋白的表達均顯著增高(P<0.05);與模型組比較,益肝膠囊各治療組NF-κBp65、RAGE、 HMGB1 蛋白的表達水平都明顯降低(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表4、圖3。

表4 各組大鼠肝組織NF-κBp65、RAGE、HMGB1 蛋白表達水平比較(n=3,±s)Tab 4 Comparison of NF-κBp65, RAGE and HMGB1 protein expression levels in liver tissue of rats in each group(n=3,±s)

表4 各組大鼠肝組織NF-κBp65、RAGE、HMGB1 蛋白表達水平比較(n=3,±s)Tab 4 Comparison of NF-κBp65, RAGE and HMGB1 protein expression levels in liver tissue of rats in each group(n=3,±s)

注:空白組比較, *P<0.05;與模型組比較, #P<0.05。

HMGB1/β-Actin 0.97±0.02 1.21±0.02*1.06±0.01#0.98±0.01#組別RAGE/β-Actin空白模型低劑量高劑量NF-κBp65/β-Actin 1.15±0.03 1.71±0.05*1.41±0.04#1.19±0.01#0.81±0.03 1.33±0.06*0.96±0.01#0.86±0.02#

3 討論

結(jié)核病(tuberculosis,TB),一種由結(jié)核桿菌所引起的慢性傳染病。根據(jù)世衛(wèi)組織數(shù)據(jù)顯示,2021年全球新發(fā)結(jié)核病患者達1 060 萬,發(fā)病率比2020年上升了3.6%[2],已經(jīng)對人類的健康造成了嚴重威脅??菇Y(jié)核藥物利福平與異煙肼,可以有效地治療結(jié)核病,但長期使用會引起肝細胞損傷,甚至導(dǎo)致急性肝衰竭。因此,尋找可以有效防治ATB-DILI的 藥 物 治 療 至 關(guān) 重 要[9,10]。ALT、AST、ALP、γ-GT、TBIL 等是檢測ATB-DILI 診斷和預(yù)后的重要指標[11]。本研究結(jié)果表明,與空白組相比較,模型組大鼠血清中的ALT、AST、ALP、γ-GT、TBIL 水平顯著升高,HE 病理結(jié)果顯示肝小葉排列紊亂、肝細胞腫脹融合并伴有炎細胞浸潤、局部出現(xiàn)點狀壞死,提示ATB-DILI 模型制備成功。經(jīng)過益肝膠囊干預(yù)后,上述指標水平均明顯降低,肝臟的病理損傷也得到明顯改善,表明益肝膠囊對ATB-DILI 具有很好的防治效果。

HMGB1 是一種在肝、心、腦、肺和腎等組織中廣泛存在的DNA 結(jié)合核蛋白,可以在細胞因子刺激情況下主動釋放,或者在細胞受損和死亡期間被動釋放到胞外[12,13]。RAGE 在肝細胞、巨噬細胞中表達[14],是與HMGB1 具有高親和力的受體。釋放在胞外的HMGB1 與RAGE 在細胞外結(jié)合,通過激活PI3K/Akt、ERK1/2、 p38MAPK 等通路,啟動了下游的核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB),上調(diào)HMGB1、TNFα、IL-6、IL-1β 的表達,而這些炎癥因子作為NF-κB信號通路的激動劑,反饋調(diào)控NF-κB 通路,誘發(fā)瀑布效應(yīng),使炎癥持續(xù)不斷的發(fā)生,進一步加重炎癥損傷[15-17]。何玲等[18]研究發(fā)現(xiàn),ATB-DILI 模型大鼠肝組織中HMGB1、RAGE 和NF-κB 等蛋白的表達明顯增加,認為HMGB1/RAGE 信號通路或是異煙肼聯(lián)合利福平所致ATB-DILI 的重要機制。而本實驗結(jié)果也表明,模型組大鼠肝組織中HMGB1、RAGE 和NF-κBp65 蛋白表達顯著增加,與上述結(jié)果一致,同時TNF-α 和IL-1β 蛋白表達也明顯增加,提示在ATB-DILI 模型中HMGB1 與RAGE 結(jié)合激活了NF-κB 信號通路,引起了炎癥級聯(lián)反應(yīng),從而加重了肝組織病理損傷。

丹參、苦參和五味子三藥共同組成了益肝膠囊。前期臨床研究證明,益肝膠囊在病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝等疾病的治療中表現(xiàn)出了良好的作用[19]。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),益肝膠囊對肝組織中HMGB1、炎癥因子TNF-α、IL-6 的表達有抑制作用[7]。研究表明,隱丹參酮能夠抑制NF-κB 的活化,抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達[20];丹參素能夠抑制HMGB1 的轉(zhuǎn)錄和翻譯來減少HMGB1 的合成與釋放,同時還能上調(diào)TGF-β 來減少TNF-α 的表達和抑制炎癥因子的釋放[21];丹參酮ⅡA對ATB-DILI 小鼠有保護作用,其機制與激活SIRTI/NF-κB 信號通路進而降低TNF-α 和IL-1β的表達有關(guān)[22]??鄥A可以抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 通路,減少炎癥反應(yīng),促進胃潰瘍的恢復(fù)[23]??鄥A對對乙酰氨基苯酚所致肝損傷的保護作用與抑制炎性因子表達和提高機體的抗氧化能力有關(guān)[24]。五味子衍生藥物可通過抑制CYP450 酶的活性、增強抗氧化反應(yīng)和抗炎等途徑,對肝臟損傷起到時保護作用[25];五味子木脂素提取物能夠抑制NF-κB 活性,降低其下游炎性因子TNF-α、IL-1β 的表達,從而使小鼠肝組織免受CCL4 引起的損傷[26];并且臨床研究發(fā)現(xiàn),五味子能夠有效減輕ATB-DILI,各項指標都優(yōu)于單純的結(jié)核藥物治療組[27]。本實驗結(jié)果顯示,益肝膠囊干預(yù)組大鼠肝組織中HMGB1、RAGE 和NF-κBp65 蛋 白 表 達 明 顯 降 低,而TNF-α 和IL-1β 蛋白表達也下調(diào)。提示益肝膠囊能夠下調(diào)ATB-DILI 模型大鼠肝組織中HMGB1、RAGE 的蛋白表達,進一步抑制NF-κB 及其下游的促炎因子TNF-α、IL-1β 的表達,從而減輕ATB-DILI 所引起的病理損害。

綜上,益肝膠囊可能是通過HMGB1/RAGE 信號通路調(diào)控NF-κB 蛋白表達,抑制TNF-a、IL-1β 等炎癥因子的水平,阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng)的進程,從而對ATB-DILI 起到較好的防治作用。但是本實驗未設(shè)計陽性對照組,不能與益肝膠囊治療組形成對照關(guān)系,從而不能更好的反映益肝膠囊對ATB-DILI療效。

作者貢獻度說明:

唐婭:負責(zé)文章的撰寫、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析;李君、齊雅芝:負責(zé)實驗操作與指標檢測;曹睿、翟燕玲:負責(zé)相關(guān)文獻的查閱與資料的整合;韓玉生:負責(zé)實驗技術(shù)指導(dǎo);徐強:提出實驗方案,文章修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。

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