楊叢語，阿茹娜，劉嘉銘

（1.蚌埠醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院生殖內(nèi)分泌科，四川 成都 610000；3.蒼溪縣人民醫(yī)院泌尿外科，四川 蒼溪 628400；4.四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科，四川 成都 610041）

膀胱癌（bladder cancer， BC）有著極高復(fù)發(fā)率和死亡率，是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一［1］。2020 年 全 球 發(fā) 病550 000 例，死 亡200 000 例，男 性的發(fā)病率顯著高于女性［2］。盡管70%～80%的患者首診為預(yù)后相對較好的非肌層浸潤性膀胱癌，但半數(shù)以上會經(jīng)歷術(shù)后復(fù)發(fā)；10%～30%會進展為預(yù)后更差、5 年生存率更低的肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invaisve bladder cancer，MIBC）［3］。雖 然 新輔助化療聯(lián)合根治性膀胱切除術(shù)已成為黃金治療方案，但在此情況下很多患者的預(yù)后仍不理想［4］。研究表明多基因模型特征可以對癌癥風(fēng)險進行分層并預(yù)測患者預(yù)后［5］。因此，構(gòu)建能夠預(yù)測患者生存預(yù)后和為臨床決策提供依據(jù)的新基因模型十分重要。

銅是人體重要的微量元素，它的存在使神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)正常運作，并能發(fā)揮調(diào)節(jié)機體新陳代謝和免疫力、抗氧化的作用［6］。Tsvetkov 等［7］提出了一種新的細(xì)胞死亡機制，即銅死亡。其原理是當(dāng)銅離子在細(xì)胞內(nèi)含量過高時，就會被轉(zhuǎn)運到線粒體中與三羧酸循環(huán)中的酯?；鞍捉Y(jié)合，導(dǎo)致酯?；鞍椎木奂丸F硫簇蛋白的減少，進而產(chǎn)生蛋白毒性應(yīng)激并最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，該過程所需的ATP 由線粒體呼吸而并非糖酵解產(chǎn)生。參與銅死亡過程的基因在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用［8］，利用銅死亡優(yōu)先清除腫瘤細(xì)胞而非正常細(xì)胞的機制制定靶向治療方案能提高治療的選擇性、降低腫瘤抗藥性，并最大限度地減少不良反應(yīng)［9］，這使其具有重要的研究意義。免疫檢查點是一類免疫抑制性分子，通過靶向效應(yīng)免疫細(xì)胞上的負(fù)調(diào)控受體激活和促進機體的抗腫瘤反應(yīng)［10］。許多接受靶向PD-1/PD-L1 免疫檢查點抑制治療的膀胱癌患者得以延長生存期。然而調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性、患者個體差異和臨床病理特征的不同，實際上只有不到20%的患者對免疫治療產(chǎn)生了客觀反應(yīng)［11］。因此，構(gòu)建有助于預(yù)測個體對免疫療法反應(yīng)的分子或基因模型對于確定個體化治療的靶點和優(yōu)化治療策略非常重要。Hu 等［12］發(fā)現(xiàn)免疫檢查點基因參與了癌癥的發(fā)生、發(fā)展，因而其可能作為免疫檢查點抑制治療的潛在靶點。所以，為進一步提高患者生存預(yù)后和臨床治療的精準(zhǔn)度，本研究擬構(gòu)建銅死亡基因和免疫檢查點基因的聯(lián)合預(yù)測模型。Voil 等［13］發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的銅可以調(diào)節(jié)免疫檢查點的表達(dá)、腫瘤免疫細(xì)胞浸潤和免疫逃逸；Xie 等［14］認(rèn)為銅能夠通過調(diào)節(jié)免疫檢查點PD-L1 的表達(dá)水平從而控制免疫檢查點的應(yīng)答情況；Bian 等［15］發(fā)現(xiàn)在腎透明細(xì)胞癌中銅死亡與免疫浸潤和PD-1 的表達(dá)量相關(guān)。這些研究都表明銅死亡和免疫檢查點之間存在生物學(xué)關(guān)聯(lián)，為構(gòu)建聯(lián)合預(yù)測模型提供了理論依據(jù)。

目前，有關(guān)銅死亡相關(guān)免疫檢查點基因在膀胱癌中預(yù)測價值的研究較少，其在膀胱癌中發(fā)揮了何種作用未有定論。本研究從公共數(shù)據(jù)庫中獲得了膀胱癌的轉(zhuǎn)錄本和臨床數(shù)據(jù)，以生物信息學(xué)聯(lián)合實驗驗證的方法來評價其在膀胱癌中的表達(dá)情況和預(yù)后價值。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas，https：//Portal.gdc.cancer.gov）中整理了膀胱癌的表達(dá)矩陣和臨床數(shù)據(jù)，包括19 例正常樣本和414 例膀胱癌樣本作為訓(xùn)練集。從既往的研究結(jié)果中提取了13 個銅死亡基因和79 個免疫檢查點基因［12］。從GEO 數(shù) 據(jù) 庫（Gene Expression Omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中整理了包括165 個樣本的GSE13507 數(shù)據(jù)集作為驗證集。

1.2 構(gòu)建與評價預(yù)后模型

銅死亡基因與免疫檢查點基因的相關(guān)性|r|＞0.3，P＜0.05 即為銅死亡相關(guān)免疫檢查點基因。由單因素和多因素Cox 回歸分析確定與患者生存預(yù)后相關(guān)的基因。用scale 函數(shù)對數(shù)據(jù)的表達(dá)矩陣進行集中化和標(biāo)準(zhǔn)化處理后計算模型的風(fēng)險評分。公式如下：

即Risk score =（Coef1×expression of BTNL9）+（Coef2×expression of CD160）+（Coef3×expression of TNFRSF14） + （Coef4×expression of TNFRSF18）。用ROC 曲線下面積評估該模型的預(yù)測能力；Kaplan-Meier 曲線評估兩組患者生存率的差異；結(jié)合臨床因素進行獨立預(yù)后分析和分層分析，評估患者的預(yù)后并鑒定該模型的預(yù)測能力。

1.3 富集分析

基因本體（Gene Ontology， GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）分析能探究預(yù)后基因潛在的生物學(xué)功能?；蚣患治觯℅ene Set Enrichment Analysis， GSEA）能發(fā)現(xiàn)兩組基因不同的富集通路。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|NES|（標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)）＞1，P＜0.05。

1.4 免疫浸潤和體細(xì)胞突變

腫瘤細(xì)胞的免疫浸潤能參與到癌癥的發(fā)展并與 預(yù) 后 相 關(guān)。 因 此，采 用 CIBERSORT，CIBERSORT-ABS， QUANTISEQ， MCP -counter， TIMER 和EPIC 算法探究高危組和低危組患者的免疫細(xì)胞浸潤水平。 從TCGA 下載BLCA-Masked Somatic Mutation 數(shù)據(jù)用于計算腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden， TMB）并用maftools 包可視化突變數(shù)據(jù)，比較兩組患者體細(xì)胞突變的信息。

1.5 免疫治療

探究各免疫檢查點基因在兩組間的表達(dá)差異以預(yù)測有效的免疫檢查點阻斷治療靶點。同時，由于參與建模的基因本身也屬于免疫檢查點基因，故研究其表達(dá)差異有助于開發(fā)膀胱癌

新的靶向阻斷治療策略。腫瘤免疫功能障礙和排斥算法（TIDE）能推斷患者接受免疫檢查點抑制治療的效果，方法為采用Wilcoxon 檢驗比較兩組患者的TIDE，Dysfunction，Exclusion 評分。

1.6 藥物治療

使用癌癥藥物敏感性基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫GDSC（https：//cancerrxgene.org/）評估病人的化療反應(yīng)。用pRRophetic 包分析藥物的半最大抑制濃度（IC50），判斷兩組患者的藥物敏感性差異。

1.7 qPCR 實驗驗證

選用人尿路上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1 和人膀胱癌細(xì)胞UMUC-3 進行實驗。以磷酸鹽緩沖液沖洗細(xì)胞，隨后每孔加入1 mL Trizol 反復(fù)吹打，直到完全裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞裂解液中的總RNA。按照Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA 梯度稀釋4、16、64、256 倍，其中各稀釋倍數(shù)條件下，設(shè)置三個平行孔上樣，進行重復(fù)檢測確定均值。PCR 反應(yīng)體系如下：

PCR Forward Primer （10 μmol/L）-1 μL； PCR Reverse Primer （10 μmol/L）-1 μL； ROX Reference Dye Ⅱ （50×Conc）-0.5 μL； SYBR?Premix Ex Taq TM Ⅱ（2×）-12.5 μL； DNA 模 板（cDNA 溶液）-2 μL； dH2O （滅 菌 蒸 餾 水）-8 μL； Total （總計）-25 μL；再經(jīng)95 ℃預(yù)變性且酶激活30 s、95 ℃變性30 s、60 ℃退火20 s，并重復(fù)變性退火共45 個循環(huán)的PCR 擴增程序后，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇比較閾值法，以GAPDH 為內(nèi)參計算基因mRNA 的相對表達(dá)量：Expression of genes = 2-△△CT×100%。4 個基因的上下游引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物Tab 1 Real-time fluorescent quantitative PCR primers

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)分析基于R（4.2.2 版本）和Graphpad Prism10 進行。采用卡方檢驗和Fisher 檢驗確定有統(tǒng)計學(xué)意義的臨床因素；KM 生存曲線和log-rank 雙側(cè)檢驗計算兩組患者的總生存時間； Spearman 相關(guān)性分析評估風(fēng)險評分與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性；Wilcoxon 檢驗比較兩組免疫檢查點基因的表達(dá)差異；獨立樣本t檢驗比較兩組間的統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)果用（±s）表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 提取目標(biāo)基因及構(gòu)建預(yù)后模型

以相關(guān)性分析共得到4 個目標(biāo)基因，分別是BTNL9，CD160，TNFRSF14和TNFRSF18。 用Cytoscape 軟件可視化兩個數(shù)據(jù)庫中銅死亡基因和免疫檢查點基因的調(diào)控關(guān)系，并展示在圖1A、B 中。單 因 素Cox 回 歸 分 析 顯 示BTNL9，CD160，TNFRSF14與降低發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，TNFRSF18與增加發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，TNFRSF14與預(yù)后顯著相關(guān)（P＜0.001）（圖1C）；多因素 Cox 回歸分析得出了相似的結(jié)論，且TNFRSF14 仍患者的獨立預(yù)后因素（P＜0.001）（圖1D）。由于基因數(shù)目較少，故將4 個基因都納入構(gòu)建預(yù)后模型。圖1E 展示了4 個基因在風(fēng)險預(yù)后模型中的分布特征，結(jié)果顯示BTNL9，CD160，TNFRSF14在 低 危 組 中 高 表 達(dá)；TNFRSF18在高危組中高表達(dá)。

圖1 預(yù)后基因的分布特征和回歸分析Fig 1 Distributional characteristics and regression analysis of prognostic genes

2.2 評價預(yù)后模型。

根據(jù)風(fēng)險評分的中位數(shù)將患者分為高危組和低危組（圖2A）。散點圖顯示TCGA 隊列死亡患者的總體生存時間較短，散點大多沉積在底部；且隨著風(fēng)險評分的增加死亡人數(shù)越來越多（圖2B）。Kaplan-Meier 生存曲線顯示高危組患者的生存率顯著低于低危組（P＜0.001）（圖2C）。ROC 曲線預(yù)測患 者1、3、5 年 的 生 存 率 為0.694、0.64、0.638（圖2D）。GEO 隊列的Kaplan-Meier 生存曲線提示高危組患者的生存率顯著低于低危組（P＜0.001）（圖2E），ROC 曲線預(yù)測患者1、3、5 年的生存率分別為0.789、0.588 和0.634（圖2F）。這些結(jié)果表明高風(fēng)險評分的患者生存預(yù)后更差，且差異在兩組間顯著，說明該模型具有良好的預(yù)測能力。

圖2 TCGA 隊列和GEO 隊列的風(fēng)險評分生存分析Fig 2 Risk score survival analysis of the TCGA cohort and GEO cohort

2.3 獨立預(yù)后分析及繪制列線圖

獨立預(yù)后的單因素Cox 回歸分析顯示，年齡、臨床病理分期、TN 分期、風(fēng)險評分均與生存預(yù)后顯著相關(guān)（P＜0.001）（圖3A）。多因素Cox 回歸分析顯示，年齡（P＜0.001）、N 分期（P＜0.01）、風(fēng)險評分（P＜0.01）與預(yù)后顯著相關(guān)（圖3B），故銅死亡相關(guān)免疫檢查點基因模型是BLCA 臨床因素的獨立預(yù)后指標(biāo)。以年齡、性別、腫瘤分級、病理分期、風(fēng)險評分、T、N 期構(gòu)建列線圖。TCGA 隊列結(jié)果顯示年齡（P＜0.001）、N 分期（P＜0.01）、風(fēng)險評分（P＜0.01）的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，校準(zhǔn)曲線的良好契合度證實了列線圖良好的預(yù)測能力（圖3C、D）。GEO 隊列的年齡、N 分期、風(fēng)險評分有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），校準(zhǔn)曲線也能證實其準(zhǔn)確的預(yù)測能力（圖3E、F）。

圖3 獨立預(yù)后分析和列線圖Fig 3 Independent prognosis analysis and nomogram

2.4 臨床因素的預(yù)后分析

采用卡方檢驗和Fisher 檢驗比較不同臨床信息的風(fēng)險評分。用卡方檢驗評估年齡、性別、腫瘤分級；用Fisher 檢驗評估病理分期、T、N 期。結(jié)果顯示，大于70 歲、高腫瘤分級、Ⅲ-Ⅳ期、T 分期3～4 期的患者具有更高的風(fēng)險評分（圖4A-D），證明該模型對指導(dǎo)臨床預(yù)后具有價值。用分層分析進一步探討模型的臨床預(yù)后價值。結(jié)果顯示（圖4E-M），低風(fēng)險組中所有年齡階段、所有臨床病理分期、男性、高腫瘤分級、低N 分期、所有T 分期的病人的生存概率均顯著高于具有上述同樣特征的高風(fēng)險組中的病人，展示了該模型良好的臨床預(yù)測能力。

2.5 功能富集分析和體細(xì)胞突變

GO 和KEGG 能分析銅死亡相關(guān)免疫檢查點基因的重要生物學(xué)功能和作用途徑。GO 功能富集分析的生物過程（Biological process， BP）分析顯示基因參與細(xì)胞黏附的正調(diào)控、免疫記憶過程、T 細(xì)胞共刺激、淋巴細(xì)胞共刺激和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控（圖5A）；細(xì)胞組分（Cellular component， CC）分析提示基因主要富集在質(zhì)膜的外側(cè)（圖5B）。分子功能（Molecular function， MF）分析提示基因主要在腫瘤壞死因子活性受體和死亡活性受體中發(fā)揮作用（圖5D）。KEGG 信號通路包括細(xì)胞因子受體互作通路和病毒蛋白與細(xì)胞因子的受體互作通路（圖5C）。GESA 顯示基因在低危組主要富集于與癌癥和DNA 的損傷相關(guān)的信號通路中，包括Bladder cancer、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、Long-term potentiation、Longevity regulating pathway-multiple species、Non-homologous end-joining（圖5E）；在高危組主要富集于與免疫和炎癥相關(guān)的信號通路，包括Hepatitis B，IL-17 signaling pathway，Natural killer cell mediated cytotoxicity，Protein processing in endoplasmic reticulum，Toll-like receptor signaling pathway（圖5F）。體細(xì)胞突變分析結(jié)果顯示，低危組的TMB 較高危組更高；MIBC 中突變頻率最高的TP53、RB1、KDM6A 在兩組中的突變頻率均大于10%，其中TP53、RB1 在高危組中突變頻率更高，KDM6A 在危組中突變頻率更高（圖5G、H）。

圖5 富集分析、體細(xì)胞突變景觀和免疫浸潤Fig 5 Enrichment analysis， somatic mutation landscapes， and immune infiltration

2.6 免疫浸潤和免疫治療

CIBERSORT、CIBERSORT-ABS、QUANTISEQ、MCP-counter、XCELL、TIMER 和EPIC 計算預(yù)后基因與免疫細(xì)胞浸潤水平的關(guān)系。CIBERSORT 計算提示M0 和M2 巨噬細(xì)胞在高風(fēng)險組的浸潤水平較高，而CD8+T 細(xì)胞、單核細(xì)胞在低風(fēng)險組的浸潤水平較高；XCELL 算法提示Treg 細(xì)胞在高危組的浸潤水平較高（圖6A）。TIDE 算法提示高危組的免疫逃逸、功能障礙和免疫排斥評分均大于低危組，提示高危組患者接受免疫治療的療效更差，而低危組患者更適合接受免疫治療（圖6B-D）。圖6E 提示PD-1、PD-L1、CTLA-4 的表達(dá)不具有差異，但本研究的預(yù)后基因BTNL9，CD160，TNFRSF14 在低危組的表達(dá)量顯著高于高危組，說明低危組患者接受該免疫檢查點阻斷治療的更好。ssGSEA 提 示 低 危 組 中 性 粒 細(xì) 胞、NK 細(xì) 胞、Th 和Th2 細(xì)胞、TIL 細(xì)胞的浸潤水平更高（圖5I）。

圖6 風(fēng)險模型的免疫浸潤和預(yù)測免疫治療Fig 6 Immune infiltration and predict immunotherapy in the risk model

2.7 藥物敏感性分析

高危組患者多西紫杉醇、順鉑、多柔比星、小白菊內(nèi)酯、毒胡羅卜素的IC50值顯著低于低危組患者，說明這些藥物對高危組患者的療效更好。高危組患者替西羅莫司、乙胺嘧啶、尼羅替尼、甲氨蝶呤、來那度胺的IC50值顯著高于低危組，說明它們對低危組患者的療效更好（圖7）。

圖7 風(fēng)險模型預(yù)測化療反應(yīng)Fig 7 Risk model predicts chemotherapy response

2.8 qPCR 驗證結(jié)果

qPCR 實驗結(jié)果顯示（圖8），BTNL9 基因在正常組和癌癥組的mRNA 表達(dá)量分別是（1.103±0.135）、（0.427±0.113），其在癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低（t=3.311，P=0.0296）； CD160 基因在正常組和癌癥組的mRNA 表達(dá)量分別是（1.626±1.032）、（2.021±1.112），其在癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低（t=4.260，P=0.013）； TNFRSF18 基因在正常組和癌癥組的mRNA 表達(dá)量分別是（0.746±0.509）、（0.805±0.475），其在癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低（t=3.555，P=0.024）；TNFRSF14 基因在正常組和癌癥組的mRNA 表達(dá)量分別是（0.860±0.402）、（1.547±1.249），其在癌細(xì)胞中的表達(dá)量顯著增加（t=3.511，P=0.025）。

圖8 qPCR 驗證預(yù)后基因的表達(dá)量Fig 8 Verify the expression of prognostic genes by qPCR

3 討論

隨著微量元素檢測技術(shù)的發(fā)展，銅在腫瘤中的關(guān)鍵作用已逐漸被人們所認(rèn)識，銅死亡作為一種新的細(xì)胞死亡機制，被認(rèn)為是研究抗腫瘤方案的有效新靶標(biāo)［11］。銅穩(wěn)態(tài)失衡能影響腫瘤的生長并促進腫瘤細(xì)胞死亡［16］，在腫瘤免疫和抗腫瘤治療中發(fā)揮著不可或缺的作用［17］。膀胱癌具有較高TMB 的特點使患者能受益于免疫檢查點阻斷治療，但是由于機體的動態(tài)免疫平衡受到嚴(yán)格的調(diào)控，且在某些情況下腫瘤可以反向調(diào)控免疫檢查點的表達(dá)，營造抑制性腫瘤微環(huán)境而發(fā)生免疫逃逸，傳統(tǒng)的靶向PD-1/PD-L1 并不能使大多數(shù)患者受益，因此尋找新的免疫檢查點治療靶點非常重要［18］。本研究從膀胱癌腫瘤微環(huán)境和生存預(yù)后的角度探究新預(yù)測模型的臨床意義，為銅死亡聯(lián)合免疫檢查點的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

本研究確定了4 個與膀胱癌預(yù)后有關(guān)的銅死亡相關(guān)免疫檢查點基因，分別是BTNL9、CD160、TNFRSF14和TNFRSF18。嗜乳脂蛋白樣9（BTNL9）可以通過調(diào)控T 細(xì)胞來影響癌癥的發(fā)展，其激活γδT 細(xì)胞使之產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和表達(dá)抗原從而對癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，以強大的細(xì)胞毒作用直接殺傷腫瘤細(xì)胞［19］。與本研究類似，BTNL9在結(jié)腸癌、肺腺癌中表達(dá)下調(diào)并與患者預(yù)后相關(guān)［20，21］。CD160是NK 細(xì)胞激活受體，它通過激活NK 細(xì)胞從而增加腫瘤微環(huán)境中IFN-γ 和TNF-α 的分泌，促進靶細(xì)胞的溶解［22］。腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF）主要源于單核巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞等，它能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答、調(diào)控腫瘤組織血管系統(tǒng)、誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡等，具有多種 生 物 學(xué) 活 性［23］。值 得 注 意 的 是，CD160是TNFRSF14的配體，二者的跨膜結(jié)合能傳遞激活信號，增強NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。Sun 等［24］發(fā)現(xiàn)膀胱癌中CD160-TNFRSF14 受體配體對的高表達(dá)能增加IL-2 擴增型NK 細(xì)胞表型并與BLCA 患者的預(yù)后密切相關(guān)。TNFRSF18 也被稱為糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNFR 相關(guān)蛋白（GITR），在T 細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞上表達(dá)。GITR 激動劑抗體通過逆轉(zhuǎn)CD25+/CD4+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受從而在多種腫瘤模型中顯示出抗腫瘤作用，被認(rèn)為與腎透明細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后相關(guān)［25］。

腫瘤的體細(xì)胞突變可以幫助其突破機體的自我監(jiān)控機制進而無限增殖和侵犯周圍組織，還能使其產(chǎn)生自身表面抗原修飾和改變腫瘤微環(huán)境進而逃避抗腫瘤免疫應(yīng)答。TMB 與患者的臨床病理特征相關(guān)，被認(rèn)為是預(yù)測免疫治療療效的標(biāo)志物［26］。高風(fēng)險性MIBC 患者的TP53 和RB1 突變頻率往往更高， TMB 更高的膀胱癌患者預(yù)后更好［27］，均與本研究的結(jié)論一致。Qiu 等［28］發(fā)現(xiàn)KDM6A 的缺失促進了M2 巨噬細(xì)胞的極化，與p53 功能失調(diào)協(xié)同作用導(dǎo)致膀胱癌的發(fā)生；其缺失還能觸發(fā)表觀遺傳開關(guān)，破壞尿路上皮分化，在膀胱的癌變過程中誘導(dǎo)其細(xì)胞增殖。同時，RB1 和TP53 共突變與膀胱癌患者免疫治療反應(yīng)的基因組生物標(biāo)志物密切相關(guān)［29］。這可能是高危組患者病情更易惡化且免疫治療效果更差的潛在機制。因此，將銅死亡聯(lián)合免疫檢查點預(yù)后模型與TMB 結(jié)合是預(yù)測患者治療反應(yīng)和預(yù)后的有效方法。

Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)TNFRSF14 與膀胱癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)（P＜0.001）；KM 生存曲線表明兩組患者具有顯著的生存率差異；ROC 預(yù)測了患者1、3、5 年的生存率；獨立預(yù)后分析表明風(fēng)險評分是良好預(yù)后指標(biāo)；臨床相關(guān)性分析、分層分析、列線圖和校準(zhǔn)曲線說明了預(yù)后模型與臨床因素良好的契合度；GSEA 顯示Bladder cancer 通路富集在低危組，證明銅死亡免疫檢查點基因的確在膀胱癌中表達(dá)；同時，qPCR 實驗驗證預(yù)后基因mRNA 的表達(dá)情況與生物信息學(xué)的分析結(jié)果一致。綜上，基于該模型預(yù)測患者的生存預(yù)后是可靠的。

為了給臨床決策提供依據(jù)，從免疫治療和化療兩個角度進行分析。盡管PD-1/PD-L1 抑制劑被指南推薦為鉑類耐受和PD-L1 陽性膀胱癌患者的一線治療方案［30］，但仍有很多患者因為嚴(yán)重的副作用和不良反應(yīng)而中斷了免疫治療。而BTNL9，CD160，TNFRSF14 屬于銅死亡相關(guān)免疫檢查點基因，具有高度選擇性，它們在低危組表達(dá)量顯著增加的特點為患者的臨床決策提供了新治療靶點，其抑制劑的應(yīng)用可能會降低腫瘤的耐藥性、減少不良反應(yīng)并實現(xiàn)個體的精準(zhǔn)化治療。TIDE 算法提示低危組患者的免疫治療療效更好，高危組更易發(fā)生免疫排斥，這可能與兩組患者免疫細(xì)胞浸潤的不同特點有關(guān)。低危組CD8+T 細(xì)胞和TILs 細(xì)胞的浸潤水平更高，使得患者生存預(yù)后和免疫檢查點阻斷治療效果更好［31］；同時，由于免疫檢查點受體主要在CTL 和NK 細(xì)胞中表達(dá)［32］，因此NK 細(xì)胞浸 潤程度更高的低危組患者更易受益于免疫治療。相反，高危組中免疫抑制性細(xì)胞如Treg 細(xì)胞、M2 巨噬細(xì)胞浸潤程度更高，它們會抑制CTLs 的浸潤水平和功能，并影響患者的臨床預(yù)后和免疫反應(yīng)［33］，這需要進一步的實驗來加以驗證。化療藥物為高危組患者提供了輔助治療方案，如順鉑能與DNA 交叉聯(lián)接破壞DNA 功能，進而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用；多西紫杉醇通過減少小管數(shù)目和破壞微管結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，且能與順鉑聯(lián)用；小白菊內(nèi)酯通過選擇抑制USP7 的活性促進β-catenin 的泛素化和降解從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖［34］；多柔比星通過嵌入DNA 抑制核酸合成，已被證明能用于膀胱癌的治療［35］。綜上，該預(yù)后模型能預(yù)測患者免疫治療療效，是決定患者輔助治療方案的可靠指標(biāo)。

總之，本研究證明了銅死亡相關(guān)免疫檢查點基因模型預(yù)測膀胱癌患者治療反應(yīng)和生存預(yù)后的可靠性，并基于此為臨床治療提供了方案。同時潛在靶點的發(fā)現(xiàn)為將來的臨床決策提供了新的選擇，為高選擇性、低耐藥性、低不良反應(yīng)的治療手段提供了新的思路。

作者貢獻(xiàn)度說明：

楊叢語：文章設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、手稿撰寫、文獻(xiàn)搜索與整理；阿茹娜、劉嘉銘：文章設(shè)計、提供整改思路和意見。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。