田恒金，汪非凡，高培垚，陳阿敏，王 娜，張 強

（1.蚌埠醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，安徽 蚌埠 233004；2.海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院輸血科，安徽 蚌埠 233004；3.蚌埠醫(yī)科大學腫瘤基礎研究與臨床檢驗診斷重點實驗室，安徽 蚌埠 233004）

胃癌（gastric cancer，GC）是嚴重危及人類健康的惡性腫瘤，胃癌的發(fā)病率和死亡率居世界惡性腫瘤的第五位和第四位［1］。目前，胃癌仍是我國第三大癌癥死亡原因［2］。隨著腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）理論的快速發(fā)展，人們逐漸認識到具有高致瘤性的CSCs 是腫瘤（包括GC）發(fā)展、復發(fā)、轉移和耐藥性的來源。CSCs 具有無限增殖和自我更新的能力，能促進腫瘤的快速生長［3］。有研究者認為GCSCs 由胃組織中正常干細胞或祖細胞轉化而來［4，5］。此外，也有研究者通過無血清培養(yǎng)出一種球形的細胞，它具有自我更新能力和多向分化能力，經鑒定推測可能是腫瘤干細胞［6］。本課題組前期通過無血清培養(yǎng)技術分離并鑒定出GCSCs 和AGSGCSCs［5，7］，而 無 血 清 懸 浮 培 養(yǎng) 技 術 被 認 為 是 獲 取GCSCs 最 便 捷 的 方 式［8］，并 可 用 于 后 續(xù) 實 驗。PGD2 是一種脂質激素類信號配體，衍生自花生四烯酸具有生理活性的脂質化合物［6］，PGD2 合成酶（L-PTGDS）是PGD2 合成的關鍵酶。L-PTGDS 的表達可以間接反映PGD2 的分泌，同時它在一定程度上能夠限制PGD2 的合成［9］。有研究報道PGD2可抑制胃癌細胞的生長和遷移能力［9，10］，但目前關于PGD2 抑制GCSCs 干性的具體機制并無報道。

自噬可以通過去除受損或老化的細胞器，以及恢復錯誤折疊和受損的蛋白質來維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定性，它是哺乳動物中一種高度保守的自我防御機制［11-13］。此外，自噬在腫瘤細胞代謝應激，藥物治療或輻射損傷中維持細胞完整性的重要機制［14］，因此自噬在腫瘤中起重要作用。在自噬途徑中Beclin-1 起著關鍵作用，通過降解自噬相關蛋白Beclin-1，可以抑制自噬，促進體內外腫瘤的發(fā)生和增殖［15］。在本研究中發(fā)現(xiàn)PGD2 可以促進胃癌細胞Beclin-1 蛋白上調，激活自噬。因此本研究通過探究PGD2 激活自噬，從而影響GCSCs 的干性，以期為胃癌的臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人胃癌細胞系SGC-7901 由上海中科院細胞庫提供，前列腺素D2（PGD2 批號：23Z293-D1，上海甄準公司），氯喹（Chloroquine，CQ，批號：159402，上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司），青-鏈霉素雙抗（100×）（中國Biosharp 公司），一抗OCT4、CD44、Beclin-1、GAPDH、LC3、二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）。RPMI-1640 培養(yǎng)基（批號：8123209）、DMED/F12 培 養(yǎng) 基（批 號：8122453）、B27（美 國Gibco 公司），CD44 流式抗體（美國BD Biosciences公司），RIPA 裂解液，PMSF（100 mmol/L），胎牛血清（杭州天杭生物科技公司），BCA 蛋白定量試劑盒（批號：020123230413，上海碧云天生物技術有限公司），堿性成纖維細胞生長因子（basic fibrolast growth factor，bFGF）和表皮細胞生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）（美國Pepro Tech 公司），超低吸附6 孔板（美國Corning 公司）。

1.2 胃癌細胞及GCSCs 的培養(yǎng)

將胃癌細胞SGC-7901 用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱內孵育。培養(yǎng)2～3 d 進行傳代或進行后續(xù)實驗。將對數(shù)生長期的SGC-7901 細胞用胰酶消化，收集到離心管并加入無血清培養(yǎng)基后，以每孔計數(shù)1×104個細胞接種到超低吸附6 孔板中，其中無血清培養(yǎng)基中含有10 μL/mL B27，10 ng/mL bFGF，20 ng/mL EGF，培養(yǎng)體系為2 mL/孔。培養(yǎng)7～10 d，富集7901-GCSCs 進行后續(xù)實驗。

1.3 流式細胞術檢測干細胞標志物CD44 的陽性率

采用流式細胞術對無血清懸浮培養(yǎng)的7901-GCSCs 干細胞干性標志物CD44 的陽性率進行檢測。分別收集貼壁培養(yǎng)的胃癌細胞SGC-7901 以及無血清培養(yǎng)的7901-GCSCs，分別計數(shù)20×104個細胞，隨后轉移至流式管再加入1.5 μL 的CD44 流式抗體，在冰上孵育15～30 min，最后每管加入500 μL的PBS 混勻后上機檢測。

1.4 干細胞成球實驗

將DMSO 組、PGD2 組細胞用胰酶消化后計數(shù)，在超低吸附6 孔板中以每孔200 個細胞密度培養(yǎng)，每孔加2 mL 培養(yǎng)基，7 d 后觀察各組7901-GCSCs 的大小和數(shù)量并計數(shù)（直徑＞40 μm 的細胞球）。

1.5 實驗分組

將SGC-7901 進行無血清懸浮培養(yǎng)，先將富集的7901-GCSCs 分為：DMSO 組、PGD2 組（2.5、5、10） μg/mL。再 將 富 集 的7901-GCSCs 分 為：（1）DMSO 組、PGD2 組（2.5、5、10） μg/mL；（2）DMSO組、CQ 組（2.5、5、10） μM；（3）DMSO 組、PGD2 組、PGD2+CQ 組，PGD2 組 中PGD2 的 濃 度 為5 μg/mL，PGD2+CQ 組 中PGD2 和CQ 的 濃 度 分 別 為5 μg/mL 和5 μmol/L。

1.6 Western blot 檢測OCT4、CD44、LC3、Beclin-1等相關蛋白表達量

采用Western blot 技術檢測DMSO 組和PGD2組中OCT4、CD44 干性標志物和LC3、Beclin-1 相關自噬蛋白的表達。檢測DMSO 組、PGD2 組、PGD2+CQ 組中OCT4、CD44 干性標志物和LC3、Beclin-1 相關自噬蛋白的表達。用裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）裂解并提取各組總蛋白，進行BCA蛋白定量，利用SDS-PAGE 膠進行電泳，隨后將蛋白條帶轉移到PVDF 膜上。用脫脂牛奶封閉1～2 h，一 抗 比 例Beclin-1、LC3、OCT4、CD44（1∶2 000），GAPDH （1∶3 000）。在4 ℃冰箱搖床過夜。TBST洗膜3 次，每次10 min，隨后加入二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次之后ECL 顯影，檢測蛋白質條帶。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用Graphpad prism 8 進行統(tǒng)計分析和作圖，各實驗均重復3 次以上。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 7901-GCSCs 的培養(yǎng)及鑒定

正常培養(yǎng)的胃癌細胞SGC-7901 和無血清懸浮培養(yǎng)的7901-GCSCs 生長形態(tài)，如圖1A、B。采用流式細胞術檢測SGC-7901 和7901-GCSCs CD44 的陽性率，結果顯示，與正常SGC-7901 相比，7901-GCSCs 中干性標志物CD44 的陽性率明顯增加（P＜0.05），如圖2A～C。表明成功富集了帶有干細胞特性的7901-GCSCs。

圖1 SGC-7901 和7901-GCSCs 生長形態(tài)Fig 1 SGC-7901 and 7901-GCSCs growth forms

2.2 PGD2 抑 制7901-GCSCs 的 干 性

采用倒置顯微鏡觀察加入不同濃度的PGD2（2.5、5、10） μg/mL 刺激7901-GCSCs 細胞的成球形態(tài)。實驗結果表明，與DMSO 組相比，5 μg/mL、10 μg/mL 濃度的PGD2 刺激的7901-GCSCS 細胞，細胞球數(shù)量明顯減少（P＜0.05），并呈濃度依賴性，如圖3A、B。此外，Western blot 結果顯示，與DMSO組相比，PGD2 組中干性標志物（CD44、OCT4）蛋白也呈濃度依賴性表達下調（P＜0.05），如圖4A～C。上述實驗結果表明PGD2 抑制了7901-GCSCs 的干性。

圖3 PGD2 刺激后7901-GCSCs 的成球能力減弱Fig 3 Ball-forming ability of 7901-GCSCs is diminished after PGD2 stimulation

圖4 PGD2 刺激后7901-GCSCs 中CD44、OCT4 的表達降低Fig 4 Decreased expression of CD44， OCT4 in 7901-GCSCs after PGD2 stimulation

2.3 PGD2 促進7901-GCSCs 自 噬的活 化

采用Western blot 檢測加入不同濃度的PGD2（2.5、5、10） μg/mL 刺激7901-GCSCs 細胞的蛋白表達，結果顯示，與DMSO 組相比，PGD2 組中自噬相關標志物（LC3、Beclin-1）的蛋白表達上調（P＜0.05），并呈濃度依賴性，結果表明PGD2 能夠激活自噬，如圖5A～C。

圖5 PGD2 刺激后7901-GCSCs 中LC3、Beclin-1 的蛋白表達增加Fig 5 Increased protein expression of LC3 and Beclin-1 in 7901-GCSCs after PGD2stimulation

2.4 CQ 抑 制7901-GCSCs 自 噬 的活化

采用Western blot 檢測加入不同濃度的CQ（2.5、5、10）μmol/L 刺激7901-GCSCs 細胞的蛋白表達，結果顯示，與DMSO 組相比，CQ 組的自噬相關標志物（LC3、Beclin-1）蛋白表達下調（P＜0.05），結果表明CQ 能夠抑制自噬，如圖6A～C。

2.5 PGD2 對7901-GCSCs 自噬水平和干性的影響能被CQ 所抑制

采用Western blot 檢測加入5 μg/mL 的PGD2和5 μmol/L 的CQ 刺激7901-GCSCs 細胞的蛋白表達，結果顯示，與DMSO 組相比，PGD2 組中干性標志物（CD44、OCT4）蛋白表達明顯下調，自噬相關蛋白（LC3、Beclin-1）的蛋白表達上調（P＜0.05），如圖7A、B。而與DMSO 組相比，PGD2+CQ 組中細胞自噬相關蛋白以及干性標志物表達并無明顯變化。（ns：差異不顯著）如圖7A、B，上述實驗結果表明CQ 可阻斷PGD2 對7901-GCSCs 的干性抑制作用。

圖7 CQ 阻斷PGD2 對7901-GCSCs 的干性抑制作用Fig 7 CQ blocks the stemness inhibition of 7901-GCSCs by PGD2

3 討論

胃癌仍然是目前全球最常見的腫瘤之一，據報道2020 年全球胃癌新發(fā)病例100 多萬例，死亡近80萬例［1］。而CSCs 被又稱為腫瘤的“起始細胞”，極少數(shù)的CSCs 即可誘導腫瘤的發(fā)生［16］，腫瘤干細胞與腫瘤的血管生成、耐藥性、侵襲性等密切相關［17］。同時CSCs 的存在也是腫瘤耐受放化療的重要機制［18］。有研究者認為GCSCs 是胃干細胞（Gastric stem cells，GSCs）的突變，引起正常胃癌組織從萎縮性胃炎、腸化生、不典型增生，最后發(fā)展到胃癌［19］。也有研究表明在GCSCs 形成過程中，往往伴有細胞的上皮-間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）發(fā)生和干細胞特異性基因的高表達［20，21］，因此，分離和鑒定出干細胞特異性基因對靶向治療GCSCs 至關重要。目前，靶向藥物針對GCSCs 的調控機制尚不明確，還需要進一步的探究。PGD2 是由花生四烯酸的通過一系列酶促反應，隨后在環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）的作用下，分解成中間產物前列腺素H2，最后在L-PTGDS 作用下轉化PGD2［22］。目前國內外針對PGD2 的研究主要集中在對炎癥和哮喘等免疫系統(tǒng)疾病的研究，而對腫瘤方面的研究較少。Kim 等［23］發(fā)現(xiàn)腫瘤間質細胞來源的PGD2 可以抑制前列腺癌細胞的生長。肥大細胞來源PGD2 能抑制肺癌組織血管生成和腸炎誘導的腫瘤發(fā)生［22，24］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PGD2影響GCSCs 生物學功能［6］。因此，本研究進一步探究PGD2 影響GCSCs 干性的分子機制，以期為臨床胃癌的診療提供新的思路和靶點。

自噬一般被認為是一種細胞自食的過程，它是將細胞質內的成分通過隔離并封閉在囊泡（自噬體）內，隨后與溶酶體結合成為自噬-溶酶體并降解其中包含的物質［25］。在腫瘤發(fā)展過程中，自噬具有雙重作用：一方面，它通過誘導腫瘤細胞的自噬性死亡來實現(xiàn)對腫瘤抑制作用；另一方面，它可以有助于腫瘤轉化和增強其化學抗性［26］。最近的研究表明，干細胞的自我更新和分化依賴于自噬的激活［27，28］。而激活自噬能夠促進CSCs 的增殖和耐藥，對CSCs 的惡性生物學功能是必不可少的［29］。然而，在本研究中通過PGD2 的刺激后，Western blot結果顯示，與DMSO 組相比，自噬相關蛋白LC3、Beclin-1 蛋白表達成濃度依賴性增加，而干性指標OCT4、CD44 的蛋白表達也是成濃度依賴性降低，表明PGD2 能夠激活自噬，同時抑制GCSCs 的干性。

有研究報道PGD2 和L-PTGDS 可能通過PPARγ 信號通路抑制胃癌的發(fā)生、轉移、侵襲和增殖［30］。本實驗通過干細胞成球和Western blot 實驗結果表明，PGD2 對干細胞成球能力的抑制作用成濃度依賴性，隨著PGD2 濃度越高，成球能力越弱，并且PGD2 抑制干性相關蛋白的表達。CQ 是一種自噬抑制劑，它能抑制自噬體與溶酶體的融合［31］。Zhao 等［32］通過使用CQ 阻斷AQP5 對自噬的激活作用，從而進一步說明AQP5 可能是通過自噬調控GCSCs 的生物學功能。而在本研究中通過CQ 能否阻斷PGD2 對自噬的激活，探究PGD2 可能通過自噬影響胃癌干細胞的干性。因此在本研究發(fā)現(xiàn)PGD2 能促進7901-GCSCs 自噬相關蛋白的表達的同時，PGD2 對7901-GCSCs 干性抑制作用能被自噬抑制劑CQ 所阻斷。說明PGD2 可能是通過調控自噬影響GCSCs 的干性。然而，在本實驗中只是說明了PGD2 可能是通過自噬影響GCSCs 的干性，但具體調控自噬的分子機制需要進一步探究。

簡而言之，外源性的PGD2 能夠抑制7901-GCSCs 的 成 球 能 力，PGD2 對7901-GCSCs 干 性 的 抑 制作用能被自噬抑制劑CQ 所阻斷，表明PGD2 可能通過自噬來抑制GCSCs 的干性。

作者貢獻度說明：

張強：研究指導及文章審核；汪非凡：負責相關實驗、分析數(shù)據以及論文修改；高培垚：實驗指導以及論文修改；田恒金：撰寫論文； 陳阿敏、王娜：文獻收集分析。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。