王寶玥，孫曉林，王永福

（1.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫科，內(nèi)蒙古 包頭014010）

系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）是一種由遺傳、環(huán)境等多種因素引起的風濕性疾病［1］。目前尚未完全明確 SSc 的發(fā)病機制，但有大量研究表明免疫紊亂、內(nèi)皮功能障礙和促纖維化機制之間的相互作用是 SSc 發(fā)病的常見原因［2］。在 SSc 中，肌成纖維細胞活化會引起大量的細胞外基質沉積在皮膚、內(nèi)臟等器官，而肺纖維化的出現(xiàn)是導致其高死亡率的重要原因［3］。因此，尋找新的預測標志物探索SSc 的發(fā)生、發(fā)展，可能會成為治療SSc 的新方向。

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一種可調控基因表達的非編碼RNA，通過與靶mRNA 互補位點結合，促進mRNA 降解或抑制其表達［4］。成熟miRNA 由兩條鏈組成，是經(jīng)過miRNA 前體（pre?miRNA）的5′端臂和3′端臂加工后得來的，因此命名為“?5p”和“?3p”［5］。越來越多的證據(jù)表明，miR?155 可調控疾病的免疫紊亂、纖維化、炎癥等過程［6?8］。在SSc 真皮和肺成纖維細胞中，NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白 3（NOD?like receptor thermal protein domain associated protein 3， NL?RP3）可通過上調miR?155 的表達，誘導膠原蛋白的合成，促進SSc 纖維化［9］。此外，干擾 miR?155 的表達，可以抑制Wnt/β?catenin 連環(huán)蛋白和Akt 途徑，導致 SSc 小鼠模型皮膚纖維化程度減輕［10］。這些表明 miR?155 在SSc 中的作用十分重要，但是miR?155 能否作為 SSc 臨床診斷的生物標志物仍有待探索。

因此，本研究通過檢測hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 在SSc 患者與健康對照者PBMCs中的表達水平，分析其與SSc 臨床數(shù)據(jù)的相關性，探討其作為SSc 診斷標志物的可能性。此外，本研究還利用生物信息學方法分析了hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 的 靶 基 因 ，進 一 步 探 究hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 在SSc 中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

從內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫科和體檢科分別選取10 例SSc 患者和10例年齡性別相匹配的健康對照者的全血。納入標準：（1）年齡≥18 歲；（2）男性或者未妊娠女性；（3）確診系統(tǒng)性硬化癥疾??；（4）可完成基本的交流與溝通，自愿參加并簽署知情同意書。排除標準：（1）年齡＜18 歲；（2）合并嚴重感染的患者；（3）合并惡性腫瘤或既往有惡性腫瘤病史的患者；（4）具有其他各種研究者認為不能加入此臨床試驗的情況。

SSc 的診斷均符合2013 年美國風濕病學會（American college of rheumatology，ACR）／歐洲抗風濕病聯(lián)盟（European league against rheumatism，EULAR） SSc 分類標準［11］。對照組中男性3 例，女性7 例；年齡31～67 歲，平均（54.30±13.26）歲；體質量指數(shù)20～25 kg/m2，平均（21.26±0.77）kg/m2。SSc 組中男性3 例，女性7 例；年齡 33～70 歲，平均（56.20±12.09）歲；體質量指數(shù)20～25 kg/m2，平均（21.76±0.98） kg/m2。對照組和SSc 組的性別、年齡和體質量指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準，醫(yī)院倫理批號：包醫(yī)倫理2022 第 （106） 號。外周血標本的獲取經(jīng)過了所有患者的知情同意。

1.2 實驗材料

人外周血淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限公司）；Trizol （美國Themor Fisher 公司）；氯仿（上海西格瑪奧德里奇）；異丙醇（北京索萊寶）；70%乙醇（天津歐博凱）；RNase Free（北京索萊寶）；miRNA cDNA 第一鏈合成（莖環(huán)法）試劑盒（上海生工）；RT?PCR kit 試劑盒、SYBR Green Re?altime PCR Master Mix（日本東洋紡生物科技有限公司）；熒光定量PCR 儀（ABI 公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗室資料收集 包括高分辨率CT（HRCT）、肺活量占預計值百分比（VC%）、用力肺活量預計值百分比（FVC%）、第1 秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEVl%）、血沉（ESR）、淋巴細胞百分比（LYM%）、中性粒細胞百分比（NEUT%）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、白球比（ALB/GLB）等臨床指標。

1.3.2 PBMCs 及RNA 提取 收取全血2 mL，移入膠皮管中，并向管中加入2 mL 生理鹽水，緩慢混勻。抽取混勻的全血，放入盛有2 mL 淋巴細胞分離液的膠皮管中，2 000 r/min，離心22 min。抽取中間層PBMCs 之后，放置到盛有3 mL 的生理鹽水的膠皮管中混勻，1 500 r/min 離心7 min。將上清倒出，再加入3 mL 生理鹽水混勻，1 500 r/min 離心4 min。最后倒出上清，加入Trizol 1 mL 混勻，室溫放置5 min，加入0.2 mL 氯仿，劇烈搖蕩15 s，靜置5 min，12 000 r/min 離心5 min。取上清液放入一個新的離心管，加0.5 mL 異丙醇，劇烈搖蕩，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min。棄上清，加入1 mL 70%乙醇，4 ℃，7 500 r/min 離心5 min。棄上清，然后室溫干燥5～10 min，加入30 μL RNase Free 的水中，取2 μL 進行電泳檢測。

1.3.3 實時熒光定量PCR（Real?time Quantitative PCR， RT?qPCR）檢測miRNA 的表達水平 利用Trizol 試劑提取人PBMCs 中的總RNA，檢測人PBMCs 中的hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 的表達水平。使用 ReverTra Ace qPCR RT Kit 試劑盒將 1 μg 總 RNA 反轉錄為 cDNA，將制備好的cDNA 進行 PCR 擴增，反應條件為：95 ℃，1 min，1 cycle；95 ℃，15 s，40 cycles；60 ℃，30 s。通過2?△△Ct方法分析數(shù)據(jù)。本研究中使用的引物序列見表1。

表1 hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 引物序列Tab 1 Primer sequences of hsa?miR?155?3p and hsa?miR?155?5p

1.3.4 miRNA 與臨床數(shù)據(jù)的相關性分析 使用IBM SPSS 26.0 和GraphPad Prism8.0.2 分析miR?NA 與HRCT、VC% 、FVC% 、FEVl% 、ESR、LYM%、NEUT%、ALB、GLB、ALB/GLB 等臨床數(shù)據(jù)之間的相關性，然后繪制用于診斷SSc 的受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）。

1.3.5 miRNA 的靶基因預測 采用miRDIP（http：//ophid.utoronto.ca/mirDIP/） 、 miRDB（http：//www.mirdb.org/）和TargetScan（https：//www.targetscan.org/）3 個在線數(shù)據(jù)庫預測miR?155?3p 和 miR?155?5p 的靶基因，使用在線工具VENNY 2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）得到3 個數(shù)據(jù)庫預測結果的交集。

1.3.6 miRNA 的靶基因GO 功能注釋和KEGG Pathway 富集分析 通過David（https：//david.ncif?crf.gov/tools.jsp）和kobas（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php）在線網(wǎng)站對靶基因進行基因本體（geneontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encylopaedia of Genes and Ge?nomes，KEGG）Pathway 富集分析，并利用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO 和KEGG 通路圖。GO 分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellur component，CC）和分子功能（molecular function，MF），P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學意義。

1.3.7 蛋白質?蛋白質相互作用（protein?protein inter?action，PPI）網(wǎng)絡的構建以及核心（Hub）基因的篩選 在String 網(wǎng)站（https：//www.string?db.org/）構建miRNA 靶基因PPI 相互作用網(wǎng)絡，選擇基因相互作用置信度得分≥0.4 的數(shù)據(jù)，利用cyto?scape 軟件3.9.1 構建可視化的PPI 網(wǎng)絡。選擇cyto?scape 軟件中cytoHubba 插件最大團中心性 （maxi?mal clique centrality，MCC ）、最大鄰域分量 （maxi?mum neighborhood component，MNC ）、連通性（De?gree）篩選中心基因。

1.4 統(tǒng)計學處理

通過IBM SPSS 26.0 和GraphPad Prism8.0.2進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用（±s） 表示，兩組間比較采用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。當相關分析的數(shù)據(jù)為線性且符合正態(tài)分布時，使用Pearson 相關分析；否則，使用Spearman 相關性分析。診斷試驗ROC 判斷miR?NA 的診斷價值。P＜0.05 為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SSc 患者PBMCs 中hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 的表達上調

采用 RT?qPCR 檢測SSc 患者和健康對照人群PBMCs 中 hsa?miR?155?3p 和 hsa?miR?155?5p 的表 達水平，結果顯示：hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 在SSc 患者 PBMCs 中的表達水平顯著高于健康對照人群（P＜0.05），見圖1。

圖1 RT?qPCR 驗證SSc PBMCs 中hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 表達水平（n=10）Fig 1 RT?qPCR validation of hsa?miR?155?3p and hsa?miR?155?5p expression levels in SSc PBMCs（n=10）

2.2 hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 對SSc 的診斷價值

ROC 曲線顯示，hsa?miR?155?3p（AUC=1，P=0.000 2） 、hsa?miR?155?5p（AUC=1，P= 0.000 2），表明hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 可能在SSc 的臨床診斷中發(fā)揮重要作用，見圖2。

蒸散發(fā)（ET）是地球水文循環(huán)以及能量轉換中的一個重要環(huán)節(jié)（Shan et al.，2015；Wang et al.，2017），它聯(lián)系著陸地生態(tài)系統(tǒng)能量和水量平衡過程（Wever et al.，2002），在水資源管理以及有效利用等方面具有重要意義。然而，由于影響ET的變量較多且復雜，導致精準計算蒸散發(fā)仍存在較大難題。在研究中，?？紤]采用參考蒸散發(fā)作為衡量蒸散發(fā)的重要參數(shù)（ET0）（郝振純等，2013），Allen et al.（1998）將其定義為生長一致，水分充足，作物高度為0.12 m，灌層阻力為70 m·s-1，反照率為0.23，完全覆蓋地面的綠色草叢植被。

圖2 hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 獨立診斷SSc 的ROC 曲線分析Fig 2 ROC curve analysis of hsa?miR?155?3p and hsa?miR?155?5p independent diagnosis of SSc

2.3 hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 和臨床數(shù)據(jù)相關性分析

為了進一步明確 hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 能否作為SSc 診斷標志物，利用相關性分析分析了miRNA 與SSc 患者臨床數(shù)據(jù)的相關性。結果顯示：hsa?miR?155?3p 和高分辨率CT（HRCT）、中性粒細胞百分比（NEUT%）、紅細胞分布寬度標準差（RDW?SD）、血小板體積分布寬度（PDW）、球蛋白（GLB）正相關，和淋巴細胞百分比（LYM%）、血小板比積（PCT）、白球比（ALB/GLB）負相關（P＜0.05）。 hsa?miR?155?5p 和HRCT、NEUT% 、RDW?SD、紅細胞分布寬度變異系數(shù)（RDW?CV）、PDW、GLB 正相關，和肺活量占預計值百分比（VC%）、用力肺活量占預計值百分比（FVC%）、第1 秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEVl%）、淋巴細胞絕對值（LYM#）、LYM%、PCT、ALB/GLB 負相關（P＜0.05），見圖3。

圖3 hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 和 SSc 臨床數(shù)據(jù)相關性分析Fig 3 Correlation analysis of clinical data for hsa?miR?155?3p， hsa?miR?155?5p and SSc

2.4 hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 的靶基因預測結果

miRDIP、miRDB、TargetScan 3 個在線數(shù)據(jù)庫預測 hsa?miR?155?3p 的靶基因個數(shù)分別是724、422、2 956，取交集后得到預測靶基因309 個；預測hsa?miR?155?5p 的靶基因個數(shù)分別是977、234、556，取交集后得到預測靶基因121 個，見圖4。

圖4 hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 的靶基因預測結果Fig 4 Target gene prediction results for hsa?miR?155?3p and hsa?miR?155?5p

2.5 hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 的靶基因GO和KEGG 分析

將 hsa?miR?155?3p 預測的 309 個基因和hsa?miR?155?5p 預測的121 個基因進行GO 分析，BP 顯示靶基因主要富集在RNA 聚合酶 Ⅱ 啟動子的轉錄調控、DNA 觸發(fā)的轉錄調控、基因表達的調控等方面； CC 顯示靶基因主要富集在細胞核、細胞質、染色質等方面；MF 顯示靶基因主要富集在RNA 聚合酶Ⅱ轉錄調控區(qū)DNA 序列特異性結合、蛋白質結合、DNA 結合等方面，見圖5。KEGG 分析顯示，hsa?miR?155?3p 靶基因顯著富集的Wnt 信號通路、FoxO 信號通路、TRP 通道、P53 信號通路以及hsa?miR?155?5p 靶基因顯著富集的IL?17 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、T、B 細胞受體信號通路、Toll 樣受體信號通路、PI3K?AKT 信號通路、NF?κB 信號通路、NOD 樣受體信號通路、FoxO 信號通路和SSc 纖維化、免疫、炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，見圖6。

圖5 hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 的靶基因GO 分析條形圖Fig 5 Bar graph of GO analysis of target genes of hsa?miR?155?3p and hsa?miR?155?5p

圖6 hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 的靶基因KEGG Pathway 氣泡圖Fig 6 KEGG Pathway bubble map of target genes of hsa?miR?155?3p and hsa?miR?155?5p

2.6 PPI 網(wǎng)絡和Hub 基因的構建

通 過 String 在 線 網(wǎng) 站 分 別 建 立 了hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 靶基因的PPI 網(wǎng)絡，見圖7、8。然后利用Cytoscape 軟件中的cyto?Hubba 插件MCC、MNC、Degree 三種算法篩選前5個Hub 基因，并通過繪制韋恩圖選擇交集基因，結果顯示hsa?miR?155?3p 的關鍵靶基因為SMAD4、HSP90AA1、MAPK14，hsa?miR?155?5p的關鍵靶基因為FOS、SMARCA4、SMAD2、KRAS，這些靶基因可能在SSc 的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，見圖9。

圖7 hsa?miR?155?3p 靶基因的PPI 網(wǎng)絡Fig 7 PPI network of hsa?miR?155?3p target genes

圖8 hsa?miR?155?5p 靶基因的PPI 網(wǎng)絡Fig 8 PPI network of hsa?miR?155?5p target genes

圖9 hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 關鍵靶基因的篩選Fig 9 Screening of hsa?miR?155?3p and hsa?miR?155?5p key target genes

3 討論

SSc 是一種罕見的、多器官受累并且預后差的免疫異常疾病，該病的治療面臨著很大困難，而尋找有效的治療方法是目前需要解決的問題。最近關于疾病潛在生物標志物的研究越來越多，生物標志物的出現(xiàn)為疾病的診斷和治療帶來了新的突破口，不僅可在早期發(fā)現(xiàn)一些高風險人群，后期也可根據(jù)疾病嚴重程度指導治療，改善患者的預后。因此，探尋 SSc 中有價值的生物標志物是當前研究的一個熱點。

miRNAs 作為生物標志物的研究已經(jīng)多次報道，在自身抗體陽性但無癥狀的直系親屬和類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA） 患者中，miR?103a?3p 的表達水平明顯增加，這表明其可能作為高危個體中即將發(fā)生RA 的潛在生物標志物［12］。在抗拓撲異構酶（抗SCL70）抗體陽性的SSc患者中，miR?27a 的表達水平明顯低于抗體陰性患者，由于該抗體與疾病的嚴重程度具有相關性，表明 miR?27a 可能作為評估疾病進展的潛在標志物［13］。Niu 等［14］在探討 miR?155 對肝硬化的影響時發(fā)現(xiàn)，miR?155 的表達在肝功能Child?Pugh C 級的患者中顯著上調；同時，與miR?155 低表達的肝移植患者相比，高表達患者肝移植后的生存時間縮短，提示miR?155 與肝硬化的進展以及臨床預后密切相關。Wajda 等［15］研究證實，與健康對照人群相比，miR?155 在SSc 患者血清中的表達顯著上調，高表達的miR?155 可能與SSc 早期微血管病變有關。本研究中發(fā)現(xiàn)SSc 患者PBMCs 中hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 的表達水平明顯高于健康對照者，并且 ROC 診斷實驗發(fā)現(xiàn) hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 的曲線下面積（areaunderthecurve，AUC）均為1，表明高表達的hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 對SSc 的診斷和治療具有重要意義。

肺功能檢查同樣是診斷肺纖維化的一個必備項目，既可以了解肺通氣與彌散功能，其動態(tài)演變還能反映肺纖維化的進展和預后［20］。肺纖維化中的順應性降低導致肺容量偏低，表現(xiàn)為VC、FVC、FEV1 和肺總容量（TLC）的降低［21］。Christmann等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在 SSc 合并間質性肺病患者的PBMCs 中miR?155 表達與FVC%、肺一氧化碳彌散量占預計值百分比（DLCO%）呈負相關，提示miR?155 可能影響呼吸功能并加重肺纖維化的進展。本研究同樣發(fā)現(xiàn)hsa?miR?155?5p 的表達水平和肺功能指標中VC%、FVC%、FEV1%呈負相關，同時hsa?miR?155?5p 的表達水平也與HRCT 評分正相關，這些表明 hsa?miR?155?5p 可能作為監(jiān)測SSc合并間質性肺病以及評估疾病嚴重性的潛在生物標志物。

miR?155 已被證實是炎癥反應的主要調節(jié)因子，在煙霧吸入誘導的急性肺損傷中，miR?155 可促進中性粒細胞的活化及募集，導致肺部炎癥加重［23］。在動脈粥樣硬化的小鼠模型中，活化的中性粒細胞釋放的微囊泡中存在大量的miR?155，而含有miR?155 的微囊泡可粘附在疾病的易發(fā)區(qū)域，促進核因子κB（nuclear factor kappa?B，NF?κB）的表達，進而加劇動脈粥樣硬化的形成［24］。本研究中hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 的表達水平和NEUT%呈正相關，進一步說明hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 可能與中性粒細胞一樣，可作為反應SSc 炎癥情況的臨床指標。

淋巴細胞亞群異常是導致SSc 免疫紊亂的常見原因，Guo 等［25］研究表明，與健康對照者相比，SSc患者外周血中的 T 細胞總數(shù)明顯減低，并且外周T細胞、CD4+T 細胞、調節(jié)性T 細胞（regulatory cells，Tregs）和Th1/Th2 的比值均和CRP 呈負相關。Gernert 等［26］研究也證明，在未使用免疫抑制的 SSc患者中，外周血B 細胞和T 細胞數(shù)量同樣低于健康對照者。而Ma 等［27］研究指出，淋巴細胞數(shù)量的過度減少可引起SSc 疾病活動度加重，以及增加器官受累的風險。 本研究發(fā)現(xiàn)hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 的表達和LYM%呈負相關，說明hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 可作為監(jiān)測SSc淋巴細胞的臨床指標，評估SSc 的疾病進展。

RDW 是診斷貧血的一個常規(guī)指標，但有多項研究證實，RDW 還可作為影響疾病預后的獨立危險因素［28，29］。在結締組織病相關肺動脈高壓患者中，RDW 數(shù)值越高，患者的預后越差［30］。此外，RDW 可作為預測 SSc 合并肺動脈高壓的臨床指標［31］。及時發(fā)現(xiàn)危險因素和新的生物標志物，有助于SSc 進行早期治療，從而改善預后，而本研究中hsa?miR?155?3p、 hsa?miR?155?5p 的 表 達 和RDW?SD 呈正相關，表明SSc 的預后也可通過hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 表達水平反應。

有研究報道，血小板可以通過刺激促炎物質在炎癥中發(fā)揮重要作用［32］。PDW 可反應血小板的大小差異，并且和血小板的活化相關［33］。PCT 是指血小板在全血中所占容積的比例。Yu 等［34］研究表明PDW 可作為預測狼瘡性腎炎的標志物。Oral 等［35］發(fā)現(xiàn)PCT 可作為早期檢測非酒精性脂肪肝炎的有用生物標志物。 本研究中hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 的表達和PDW 呈正相關，和PCT呈 負 相 關 ，再 次 說 明 hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 是SSc 發(fā)生炎癥的影響因素。

ALB 是血漿中含量最多的蛋白，是評估營養(yǎng)不良的指標之一，而最近研究發(fā)現(xiàn)ALB 與炎癥反應呈負相關，可作為炎癥的潛在生物標志［36］。GLB 的升高同樣與炎癥相關，其中ALB/ GLB 是炎癥中有希望的生物標志物，較高水平的ALB/GLB 與心衰患者的良好預后顯著相關［37］。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 的表達和GLB 呈正相關，和ALB/GLB 呈負相關，說明高表達的hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 可作為監(jiān)測SSc 炎癥的潛在生物標志。

miRNA 可與其靶基因互作參與調控多種疾病的生物學過程。 通過預測hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 靶基因，并探索靶基因的功能，可以更清楚的理解miRNA 在SSc 中的具體作用機制，為后續(xù)的診斷和治療提供可靠的參考依據(jù)。本研究中依據(jù)hsa?miR?155?3p、hsa?miR?155?5p 靶基因GO 功能注釋結果，發(fā)現(xiàn)這些基因與基因表達的調控、蛋白質的合成等過程密切相關。KEGG 分析結果顯示hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 靶基因富集的信號通路廣泛參與免疫、炎癥、纖維化、腫瘤等生物過程。進一步分析hsa?miR?155?3p 關鍵靶基因，最終得到SMAD4、HSP90AA1、MAPK143 個中心基因，其中SMAD4是參與Wnt、 FoxO 信號通路的基因，MAPK14是參與FoxO 信號通路的基因。hsa?miR?155?5p 的關鍵靶基因為FOS、SMARCA4、SMAD2、KRAS，其中FOS是參與IL?17、 TNF、MAPK、Toll 樣受體、T、B 細胞信號通路的基因，KRAS是參與MAPK、T、B 細胞信通路的基因。

SMAD4 和SMAD2 是轉化生長因子?β（trans?forming growth factor?β，TGF?β）通路的信號轉導分子，TGF?β/SMAD 信號通路可引起細胞外基質過度沉積并導致疾病纖維化的形成［38］。在博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠中，銀杏酸可能通過抑制TGF?β1 誘導的 SMAD4 泛素化修飾，減少活性氧的 產(chǎn) 生 ，從 而 抑 制 上 皮?間 充 質 轉 化（epithelial?mesenchymal transition，EMT），最終改善肺纖維化［39］。Jiang 等［40］研究表明，果膠多糖通過抑制TGF?β /Smad2/3 信號傳導，減弱肌成纖維細胞活化，減少膠原蛋白的表達，改善SSc 模型小鼠肺纖維化。MAPK14 是p38MAPK 家族的一種亞型，在細胞增殖、凋亡、衰老和炎癥等多種過程中發(fā)揮作用［41］。有研究表明，LncRNA XIST 可通過調節(jié)miR?12?132p/MAPK14 軸促進脂多糖誘導的小鼠肺損傷［42］。據(jù)報道，F(xiàn)OS 與炎癥、血管病變、腫瘤等多種病理過程有關［43，44］。此外，F(xiàn)OS 在組織纖維化中同樣發(fā)揮重要作用，Xue 等［45］研究表明，miR?29b?3p 通過靶向FOS 抑制了TGF?β1 誘導的心臟成纖維細胞增殖、遷移和分化，從而減輕了心臟纖維化。KRAS 是一種癌癥相關的基因，但最近也有研究發(fā)現(xiàn)KRAS 與心衰患者纖維化的發(fā)生相關，并有可能作為診斷心力衰竭潛在生物標志物［46］。Yi 等［47］研究發(fā)現(xiàn)，CircRNA_30032 通過靶向miR?96?5p，促進KRAS 的表達，導致單側輸尿管梗阻模型小鼠的腎纖維化。上述這些靶基因參與了疾病纖維化的發(fā)展，因此hsa?miR?155?3p 和hsa?miR?155?5p 有可能通過調控上述靶基因，參與SSc 的發(fā)病過程。

綜上所述，hsa?miR?155?3p 及hsa?miR?155?5p可能參與了調節(jié)SSc 纖維化、免疫、炎癥的發(fā)生、發(fā)展，hsa?miR?155?3p 及hsa?miR?155?5p 有可能作為SSc 臨床診斷和治療的潛在生物標志物。但該研究樣本量較少，具有局限性，后續(xù)還需更多的樣本和臨床資料來支持這一觀點。

作者貢獻度說明：

王永福：實驗設計，文章修改；孫曉林：數(shù)據(jù)及圖片整理，文章修改；王寶玥：數(shù)據(jù)收集、分析、文章撰寫。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。