張春青，唐坤鵬，閆麗萍，文 壇，王海軍

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種以腸道炎癥反復(fù)發(fā)作為特征的衰弱性疾?。?］，臨床中可分為急性發(fā)病和慢性緩解兩個(gè)時(shí)期，治愈難度較大［2］。尤其是在急性期會產(chǎn)生大量的促炎因子，在持續(xù)無菌性炎癥反應(yīng)的刺激下，加速向克羅恩?。╟rohn，s disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ul?cerative colitis，UC）轉(zhuǎn)化［3］。近年來其發(fā)病率在我國迅速上升［4］，目前，西醫(yī)對急性結(jié)腸炎的治療較為局限，多以激素類、免疫抑制劑等為主［5］，但停藥后病情容易反復(fù)，長時(shí)間服用會造成藥物依賴性，同時(shí)也會出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)［6，7］。因此，有效抑制炎癥細(xì)胞的浸潤，改善炎癥微環(huán)境，有助于減輕急性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展。

酪氨酸蛋白激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activa?tor of transcription 3，STAT3）/細(xì)胞因子信號抑制物1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）信號通路屬于經(jīng)典的炎性反應(yīng)信號通路，可通過激活下游促炎細(xì)胞因子，產(chǎn)生炎性級聯(lián)反應(yīng)及致使結(jié)腸黏膜損傷［8，9］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針“天樞”、“大腸俞”、“足三里”、“上巨虛”穴治療慢性期結(jié)腸炎的療效顯著，且上巨虛穴效最優(yōu)［10］。因此，本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，擬以結(jié)腸炎的急性期為研究對象，通過檢測JAK2/STAT3/SOCS1 信號通路相關(guān)的蛋白含量表達(dá)及大鼠血清中白介素的含量，探討電針不同腧穴對急性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，選出最優(yōu)穴，為臨床治療上提供組方依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

SPF 級SD 大鼠36 只，雌雄各18 只，體質(zhì)量（180±20）g，于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司購買，許可證號［SCXK（京）2019?0010］。所有大鼠自由飲食，自然光照，動物房溫度（23±2）℃、濕度（50±5）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為6 組，正常組、模型組、天樞組、大腸俞組、足三里組、上巨虛組，每組6 只。實(shí)驗(yàn)已通過山西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審查（倫理審批號：2021 DW211）。

1.2 試劑和儀器

主要試劑：BCA 蛋白濃度測定試劑盒（AB0146，武漢BOSTER 工程有限公司）；蛋白酶抑制劑cocktail（HY?K0010，美國MCE 生物科技公司）；IL?4、IL?8 試劑盒（MM?0191R1、MM?0175R1，山西仁安生物科技有限公司）；JAK2 抗體、STAT3抗體、SOCS1 抗體、羊抗兔 IgG?HRP（AF1489、AF1492、AF8022、AS014，武漢BOSTER 工程有限公司）；飛克特超敏ECL 發(fā)光液（MA0186，大連美侖）。

主要儀器：電泳儀（DYY?6D，北京六一）；高速冷凍離心機(jī)（3K15，曦瑪離心機(jī)有限公司）；酶標(biāo)儀（2108251C，美國BioTek）；Tanon5200 化學(xué)發(fā)光成像儀（Tanon?5200 Multi，美國BioTek 公司）；脫色搖床（DS?2H200，武漢Servicebio 生物科技有限公司）；石蠟包埋機(jī)（YB?6LF，湖北省亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）。

1.3 模型制備

參考課題組前期造模的方法［11］，急性結(jié)腸炎大鼠模型采用6%的冰乙酸溶液灌腸進(jìn)行制備。造模時(shí)，除正常組之外，其余各組將涂抹有石蠟油的聚氯乙烯管從大鼠的肛門處緩慢插入至肛門內(nèi)8 cm處，將1 mL 的6%冰乙酸溶液緩慢的推入，15 s 后抽取5 mL 的生理鹽水對其進(jìn)行沖洗，在此過程中各組大鼠均不需要麻醉。正常組用生理鹽水替換6%冰乙酸溶液，余處理不變。

1.4 穴位選取及干預(yù)治療

腧穴具體定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［12］選取“天樞”、“大腸俞”、“足三里”、“上巨虛”作為電針雙側(cè)穴位。

造模后，選用無菌毫針、華佗牌SDZ?Ⅱ型電子針療儀給予各腧穴（雙側(cè)）電針刺激，頻率為2～50 Hz，強(qiáng)度2 mA，20 min/次，1 次/d，連續(xù)3 d。其中正常組和模型組于同時(shí)間段僅固定不針刺。

末次治療結(jié)束后，各組大鼠禁食、不禁水，12 h后進(jìn)行麻醉、取血，在4 ℃環(huán)境下進(jìn)行離心，收集上清液，置于?20 ℃冰箱保存待檢。將截取的大鼠結(jié)腸組織（肛門及以上12 cm）置于無菌凍存管中，隨后立即放入?80 ℃冰箱進(jìn)行保存，待其檢測。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

（1）觀察大鼠一般情況：各組大鼠的毛色光亮如何、反應(yīng)是否靈敏度、是否活躍、精神是否萎靡及體質(zhì)量是否下降等進(jìn)行密切觀察。

（2）HE 染色法觀察結(jié)腸組織粘膜變化：取結(jié)腸組織（約為2 mm×2 mm×2 mm）用于HE 染色，之后將結(jié)腸組織開始進(jìn)行固定、脫水、透明等，制成蠟塊。蠟塊切片厚約5 μm，脫蠟，脫水，浸泡，分化，洗滌等。然后滴加伊紅染液，隨后清洗、封片。于光學(xué)顯微鏡（200×）下采集圖像。

（3）ELISA 法檢測血清IL?4、IL?8 的含量：將收集好的上清液取出，冰上進(jìn)行解凍。以ELISA 試劑盒的解釋說明為指導(dǎo)進(jìn)行操作，對大鼠血清中IL?4和IL?8 的含量進(jìn)行檢測。

（4）Western blot 檢測結(jié)腸組織中蛋白表達(dá)量：取100 mg 的結(jié)腸組織進(jìn)行研磨、取上清，隨后BCA法測其蛋白濃度，蛋白變性后保存待用。檢漏結(jié)束后開始制膠、上樣，上樣結(jié)束后開始電泳、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后脫脂牛奶進(jìn)行封閉，封閉完成之后孵育一抗JAK2 抗體、STAT3 抗體、SOCS1 抗體（比例為1∶2 000、1∶1 000、1∶2 000），孵育完成后4 ℃冰箱封閉過夜，第二日，T?BST 洗膜3 次后孵育山羊抗兔IgG（1∶5 000），2 h 后T?BST 洗膜，然后使用超敏ECL 發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光顯影，保存蛋白條帶圖，之后用ImageJ 軟件對蛋白條帶灰度值開始進(jìn)行分析。

（5）Real?timePCR 法檢測結(jié)腸組織中JAK2、STAT3、SOCS1 mRNA 的表達(dá)：稱取大鼠結(jié)腸組織約50 mg，提取總RNA，合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，以總mRNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)40 次。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。其引物設(shè)計(jì)及合成均由山西仁安生物科技有限公司完成。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，所有樣本數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)，組間比較采用單因素方差分析和LSD 法檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

造模前，各組大鼠精神飽滿，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)有光澤，大便正常；造模后，各組大鼠毛發(fā)暗淡無光，精神萎靡、懶散，出現(xiàn)稀水便，嚴(yán)重者則出現(xiàn)血便，體重減輕；干預(yù)后，各腧穴組毛色較模型組有明顯改善，體重和活動量有所增加，血便減少，便形逐漸恢復(fù)正常形狀，總體情況較模型組有明顯的改善，其中足三里穴組狀況改善較其他腧穴組最為顯著。

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)的比較

正常組腺體排列有序，隱窩表面規(guī)則，黏膜層和肌層無充血、水腫，結(jié)構(gòu)完整；模型組腺體排列嚴(yán)重紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤，充血、水腫，黏膜層和肌層受損嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)明顯異常；各腧穴組與模型組相比病變明顯得到改善，炎癥反應(yīng)明顯減輕，但黏膜層和肌層還有缺損，腺體排列部分異常；其中，足三里穴組較其他各腧穴組黏膜層、肌層和腺體結(jié)構(gòu)明顯改善。見圖1。

圖1 結(jié)腸組織病理變化比較（HE，×200）Fig 1 Comparison of pathological changes of colon tissue （HE，×200 ）

2.3 各組大鼠血清IL?4、IL?8 含量的比較

正常組與模型組相比較，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中IL?4 水平明顯降低，IL?8 水平明顯升高（P＜0.01）；各腧穴電針干預(yù)組與模型組相比較，發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)后大鼠血清中IL?4 水平均明顯升高，IL?8 水平均明顯降低（P＜0.01）；其中，足三里組與天樞、大腸俞、上巨虛組相比較，發(fā)現(xiàn)大鼠血清中IL?4 水平顯著升高，IL?8 水平顯著降低（P＜0.05）；天樞組、大腸俞組、上巨虛組三組間相比較，發(fā)現(xiàn)大鼠血清中IL?4、IL?8 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清IL?4、IL?8 含量的比較（pg/mL，n=6，±s）Tab 2 Comparison of serum IL?4 and IL?8 levels in each group of rats （pg/mL，n=6，±s）

表2 各組大鼠血清IL?4、IL?8 含量的比較（pg/mL，n=6，±s）Tab 2 Comparison of serum IL?4 and IL?8 levels in each group of rats （pg/mL，n=6，±s）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與足三里組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01。

IL?8 53.18±7.03 140.39±7.90＊＊95.55±7.61##△98.62±6.91##△△83.65±8.62##102.16±8.83##△△77.861＜0.0001組別正常組模型組天樞組大腸俞組足三里組上巨虛組FP IL?4 96.00±4.68 43.54±6.39＊＊70.88±7.46##△66.86±7.45##△△78.78±5.01##65.78±5.66##△△46.164＜0.0001

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織中JAK2、STAT3、SOCS1蛋白表達(dá)的比較

正常組與模型組相比較，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠結(jié)腸組織中JAK2、STAT3 蛋白含量明顯升高，SOCS1蛋白含量明顯降低（P＜0.01）；各腧穴電針干預(yù)組與模型組相比較，發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)后結(jié)腸組織中JAK2、STAT3 蛋白含量明顯降低，SOCS1 蛋白含量明顯升高（P＜0.05）；其中，足三里組與天樞、大腸俞、上巨虛組相比較，發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)腸組織中JAK2、STAT3蛋白含量顯著下降，SOCS1 蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；天樞組、大腸俞組、上巨虛組三組間相比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織中JAK2、STAT3、SOCS1 蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織JAK2、STAT3、SOCS1 蛋白表達(dá)Fig 2 Expression of JAK2， STAT3 and SOCS1 protein in colon tissue of rats in each group

表3 各組大鼠結(jié)腸組織中JAK2、STAT3、SOCS1 蛋白表達(dá)量的比較（n=6，±s）Tab 3 Comparison of JAK2， STAT3 and SOCS1 protein ex?pression in colon tissue of rats in each group（n=6，±s）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織中JAK2、STAT3、SOCS1 蛋白表達(dá)量的比較（n=6，±s）Tab 3 Comparison of JAK2， STAT3 and SOCS1 protein ex?pression in colon tissue of rats in each group（n=6，±s）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05,##P＜0.01；與足三里組比較，△P＜0.05。

SOCS1 1.69±0.26 0.23±0.09＊＊0.89±0.09#△0.89±0.17#△1.45±0.34##0.86±0.06#△20.38＜0.0001組別正常組模型組天樞組大腸俞組足三里組上巨虛組FP JAK2 0.24±0.11 1.40±0.46＊＊0.78±0.10#△0.78±0.09#△0.22±0.09##0.83±0.05#△14.04＜0.0001 STAT3 0.29±0.05 1.69±0.29＊＊0.91±0.12##△0.92±0.20##△0.36±0.07##0.92±0.29##△19.72＜0.0001

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織中JAK2、STAT3、SOCS1 mRNA 表達(dá)的比較

正常組與模型組相比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)明顯上升，SOCS1 mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；各腧穴電針干預(yù)組與模型組相比較，電針干預(yù)后大鼠結(jié)腸組織中JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜0.05），SOCS1 mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；其中，足三里組與天樞、大腸俞、上巨虛組相比較，發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)腸組織中JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)顯著下降，SOCS1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；天樞組、大腸俞組、上巨虛組三組間相比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織中JAK2、STAT3、SOCS1 mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織JAK2、STAT3、SOCS1mRNA 相對表達(dá)量比較（n=6，±s）Tab 4 Comparison of relative expression of JAK2， STAT3 and SOCS1 mRNA in colon tissue of rats in each group（n=6，±s）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織JAK2、STAT3、SOCS1mRNA 相對表達(dá)量比較（n=6，±s）Tab 4 Comparison of relative expression of JAK2， STAT3 and SOCS1 mRNA in colon tissue of rats in each group（n=6，±s）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05,##P＜0.01；與足三里組比較，△P＜0.05,△△P＜0.01。

SOCS1 mRNA 1.00±0.02 0.25±0.04＊＊0.62±0.10##△0.60±0.10##△△0.87±0.08##0.60±0.05##△△36.92＜0.000 1組別正常組模型組天樞組大腸俞組足三里組上巨虛組FP JAK2 mRNA 1.00±0.07 2.06±0.12＊＊1.72±0.18#△△1.66±0.08##△1.29±0.02##1.63±0.11##△33.58＜0.000 1 STAT3 mRNA 1.00±0.02 1.96±0.07＊＊1.62±0.06#△1.65±0.16##△△1.29±0.05##1.62±0.09##△△42.74＜0.000 1

3 討論

結(jié)腸炎在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“腸澼”、“泄瀉”、“腹痛”、“痢疾”等范疇，病位在腸，主要責(zé)之于脾胃［13］。正如《素問·陰陽應(yīng)象大論》提到：“夫腸胃者，水谷之道也，五味入胃……下輸于腎，別而為清濁”。近年來，大量文獻(xiàn)研究表明針灸在臨床治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，對結(jié)腸炎也具有明顯的治療作用，可以有效的抑制腸道炎癥反應(yīng)［14?17］。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)電針“天樞、大腸俞、足三里、上巨虛”四組腧穴對其治療療效顯著，并對腧穴的特異性進(jìn)行了更深一步的研究，發(fā)現(xiàn)電針上巨虛穴治療慢性結(jié)腸炎療效顯著［10］。基于此，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)以結(jié)腸炎為研究對象，以急性期開展基礎(chǔ)研究，沿用“天樞、大腸俞、足三里、上巨虛”四組特定穴，觀察其治療作用，并進(jìn)一步分析其特異性。天樞穴屬陽明胃經(jīng)，為大腸的募穴，具有理氣、通調(diào)腸腑的之效。大腸俞屬足太陽膀胱經(jīng)，為大腸經(jīng)的背俞穴，具有調(diào)暢腸腑、理氣化滯的功效。足三里為足陽明胃經(jīng)的合穴，根據(jù)“合治內(nèi)腑”理論，足三里不僅可以治療脾胃相關(guān)病癥，還可治療六腑相關(guān)疾病，是人體強(qiáng)壯保健要穴。上巨虛屬于為大腸經(jīng)的下合穴，具有調(diào)理氣機(jī)、通經(jīng)活絡(luò)的作用。有研究發(fā)現(xiàn)電針“天樞”、“足三里”通過調(diào)控血清中相關(guān)炎癥因子的含量，減輕炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)結(jié)腸粘膜的作用［11］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)電針治療后，各腧穴組大鼠一般情況明顯好轉(zhuǎn)，血便減少，體重和活動量有所增加，其中足三里穴組改善狀況較其他腧穴組最為顯著。

促炎和抗炎細(xì)胞因子的失衡與急性結(jié)腸炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［18］。IL?4 和IL?8 作為兩種重要的炎癥因子，在炎癥性腸病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。IL?4 是由Th2 產(chǎn)生的抑炎細(xì)胞因子，主要作用于免疫活性細(xì)胞，并誘導(dǎo)活化的成熟T 細(xì)胞增值，能夠抑制炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞的浸潤［19，20］。IL?8 是一種促炎因子，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)可以起直接介導(dǎo)的作用，也是一種很強(qiáng)的中性粒細(xì)胞趨化因子和活化因子［21］。當(dāng)結(jié)腸炎急性期發(fā)作時(shí)，IL?4 和IL?8含量的分泌不足與太過都會導(dǎo)致腸道黏膜屏障的破壞和炎癥反應(yīng)的加劇。由此可以看出，IL?4 和IL?8 在急性結(jié)腸炎中的作用機(jī)制主要是通過促進(jìn)和抑制炎癥反應(yīng)及免疫細(xì)胞的浸潤，導(dǎo)致腸道黏膜屏障的破壞和炎癥反應(yīng)的加劇。因此，有效控制炎癥因子IL?4、IL?8 的分泌，有助于減輕急性結(jié)腸炎的癥狀和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，急性期結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子IL?4 的分泌含量減少、IL?8 的分泌含量增高。經(jīng)電針治療后可增加炎癥細(xì)胞因子IL?4 的分泌含量、減少IL?8 的分泌含量，表明電針通過增加IL?4、減少IL?8 的含量，避免炎癥細(xì)胞的浸潤，從而維持炎癥微環(huán)境的穩(wěn)定來改善結(jié)腸黏膜的癥狀，保護(hù)結(jié)腸黏膜，其中足三里穴組IL?4 的含量較其他腧穴組高，IL?8 的含量則低于其它腧穴組。

JAK2/STAT3/SOCS1 信號通路作為一種經(jīng)典的促炎信號通路，其可通過介導(dǎo)細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo)，將多種刺激信號進(jìn)行傳導(dǎo)，還可以通過靶基因來調(diào)節(jié)其相應(yīng)的細(xì)胞反應(yīng)［22，23］。其中JAK2 是一種酪氨酸激酶，當(dāng)JAK2 的活性升高，能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［24］。STAT3 是一種轉(zhuǎn)錄因子，其主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化［25］。在炎癥微環(huán)境中，STAT3 的活性通常會升高，從而加劇炎癥反應(yīng)的發(fā)生［26］。SOCS1 是一種負(fù)免疫調(diào)節(jié)因子，它對調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號的JAK/STAT 途徑提供負(fù)反饋［27］。當(dāng)SOCS1 的表達(dá)水平升高，就會抑制JAK/STAT 信號通路的活性，減少炎癥細(xì)胞的浸潤。本研究結(jié)果顯示，大鼠腹腔注射6%的冰乙酸溶液灌腸后，結(jié)腸組織明顯出現(xiàn)損傷癥狀，JAK2、STAT3的表達(dá)顯著升高；SOCS1 的表達(dá)顯著降低。而電針各腧穴可減少JAK2、STAT3 的表達(dá)，增加SOCS1的表達(dá)。因此，通過抑制JAK2/STAT3/SOCS1 信號通路的活性，可以減輕炎癥反應(yīng)，改善急性結(jié)腸炎的癥狀。因此，該信號通路可能成為治療急性結(jié)腸炎的新靶點(diǎn)。

綜上，電針各腧穴均能改善急性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織黏膜的損傷，減輕炎癥反應(yīng)。其中足三里穴治療效應(yīng)總體優(yōu)于天樞、大腸俞、上巨虛穴，其作用機(jī)制可能通過抑制JAK2/STAT3/SOCS1 信號通路相關(guān)蛋白，增加炎性細(xì)胞因子IL?4、減少IL?8 的分泌有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張春青：完成實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行指標(biāo)檢測，分析、整理數(shù)據(jù)，撰寫論文；唐坤鵬、文壇：協(xié)助完成實(shí)驗(yàn)，在指標(biāo)檢測、數(shù)據(jù)分析方面給予相應(yīng)的指導(dǎo)；閆麗萍：通訊作者，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、指導(dǎo)及文章修改；王海軍：對實(shí)驗(yàn)的順利完成給予支持和幫助。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。