陳勁果，王之仕，黃衛(wèi)

0 引言

前列腺癌是發(fā)達(dá)國(guó)家男性最常見(jiàn)的實(shí)體惡性腫瘤，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，且發(fā)病率逐年增高。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，2022年美國(guó)新增268 490例前列腺癌患者，為新增人數(shù)最多的惡性腫瘤，而死亡人數(shù)居第二位，為34 500例[1]。前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)因素目前尚未十分明確，一些研究顯示肥胖、吸煙、年齡、種族、家族史、基因變異等可能與前列腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)[2]。近年來(lái)，一些研究發(fā)現(xiàn)飲食及營(yíng)養(yǎng)可能參與促進(jìn)或抑制前列腺癌[3]，其中咖啡受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注[4]。

咖啡是世界上最受歡迎和消費(fèi)最廣泛的飲料之一，其對(duì)個(gè)人健康的微小影響都可能會(huì)對(duì)公共健康造成巨大影響。研究顯示，咖啡含有咖啡因、綠原酸、天然二萜等多種活性成分，可通過(guò)下調(diào)胰島素樣生長(zhǎng)因子1表達(dá)、減少氧化應(yīng)激等多種機(jī)制影響癌癥的發(fā)生發(fā)展[5-7]。一項(xiàng)隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，攝入咖啡可使前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)降低53%，同時(shí)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)咖啡因可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。英國(guó)一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究對(duì)6 017例男性進(jìn)行隨訪(fǎng)，結(jié)果顯示攝入咖啡可使前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)降低55%（HR=0.45, 95%CI: 0.23～0.90,P＜0.01）[9]。然而也有研究并未發(fā)現(xiàn)飲用咖啡與前列腺癌存在關(guān)聯(lián)。歐洲一項(xiàng)研究對(duì)142 196例男性進(jìn)行14年的隨訪(fǎng)，發(fā)現(xiàn)攝入咖啡與前列腺癌不存在因果關(guān)系（HR=1.02, 95%CI: 0.94～1.09）[10]。這些均為觀察性研究，較易受到混雜因素的影響，結(jié)論可能存在較大偏倚。鑒于咖啡在人類(lèi)飲食中的廣泛性，需要進(jìn)一步明確攝入咖啡與前列腺癌的關(guān)聯(lián)。

孟德?tīng)栯S機(jī)化（Mendelian randomization,MR）分析是近年來(lái)流行病學(xué)十分常用的一種研究設(shè)計(jì)，通過(guò)引入經(jīng)濟(jì)學(xué)中的工具變量（instrumental variable, IV）的概念，將基因變異作為暴露因素的工具變量，研究暴露因素與疾病的因果關(guān)系，是一種采用遺傳數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)價(jià)可變化的非遺傳暴露因素的因果效應(yīng)的技術(shù)。相較于傳統(tǒng)的觀察性流行病學(xué)研究，MR基于親代等位基因隨機(jī)分配給子代的孟德?tīng)栠z傳定律，相當(dāng)于在人群中開(kāi)展隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，還具備避免耗費(fèi)大量人力物力以及倫理容易通過(guò)的優(yōu)點(diǎn)。目前尚缺乏探索攝入咖啡與前列腺癌關(guān)聯(lián)的孟德?tīng)栯S機(jī)化研究?；诖耍狙芯繑M采用兩樣本孟德?tīng)栯S機(jī)化方法研究攝入咖啡與前列腺癌的因果關(guān)系。

孟德?tīng)栯S機(jī)化研究中的工具變量必須滿(mǎn)足三個(gè)核心條件[11]：工具變量與暴露因素強(qiáng)相關(guān)（關(guān)聯(lián)性假設(shè)）；工具變量與混雜因素不相關(guān)（獨(dú)立性假設(shè)）；工具變量只能通過(guò)暴露因素影響結(jié)局（排他性假設(shè)）。本研究擬篩選與前列腺癌相關(guān)的核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點(diǎn)作為工具變量，評(píng)估攝入咖啡與前列腺癌的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

本研究采用兩樣本孟德?tīng)栯S機(jī)化方法研究攝入咖啡與前列腺癌的關(guān)聯(lián)。本研究暴露變量為攝入咖啡，結(jié)局變量為前列腺癌，暴露與結(jié)局的全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome wide association study,GWAS）數(shù)據(jù)均來(lái)源于英國(guó)生物樣本庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://gwas.mrcieu.ac.uk/）。

1.2 數(shù)據(jù)整理

以P＜5×10-8為標(biāo)準(zhǔn)篩選出與暴露相關(guān)（攝入咖啡）的工具變量，然后根據(jù)r2=0.001和kb=10 000這兩個(gè)參數(shù)篩掉10 MB范圍內(nèi)r2＞0.001中P值較大的SNP，去除存在連鎖不平衡的SNP，保證篩選出的工具變量互相獨(dú)立。然后進(jìn)行二次篩選，以P＜5×10-8為標(biāo)準(zhǔn)剔除與前列腺癌相關(guān)的IVs。最后，計(jì)算F統(tǒng)計(jì)量，F(xiàn)＞10則表明IVs不太可能存在弱工具變量偏倚。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.3.1 多效性檢驗(yàn) 孟德?tīng)栯S機(jī)化研究還需滿(mǎn)足的一條假設(shè)是工具變量只能通過(guò)暴露因素影響結(jié)局，因此需排除工具變量通過(guò)其他途徑對(duì)結(jié)局造成影響，需要進(jìn)行多效性檢驗(yàn)。MR-Egger回歸效應(yīng)模型通常用來(lái)評(píng)估多效性是否存在，回歸模型中的截距與0不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)，表明IV不存在多效性，反之則存在。

1.3.2 因果效應(yīng)估計(jì) 計(jì)算篩選出的IV與攝入咖啡、IV與前列腺癌的Beta值和SE值，利用逆方差加權(quán)法[12]（inverse-variance weighting, IVW）進(jìn)行整合，評(píng)估攝入咖啡與前列腺癌的關(guān)聯(lián)。另外，為了評(píng)估結(jié)果的穩(wěn)定性，使用MR-Egger回歸[13]、加權(quán)中位數(shù)[14]（weighted median estimator, WME）法進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證。

1.3.3 異質(zhì)性檢驗(yàn) 孟德?tīng)栯S機(jī)化的異質(zhì)性檢驗(yàn)是對(duì)基于單個(gè)遺傳變量的工具變量估計(jì)的兼容性的統(tǒng)計(jì)評(píng)估。如果IV之間不存在異質(zhì)性，則可使用固定效應(yīng)模型對(duì)結(jié)果進(jìn)行合并分析，反之需分析存在異質(zhì)性的原因及進(jìn)行處理，若無(wú)法消除則使用隨機(jī)效應(yīng)模型。本研究使用MR-Egger方法評(píng)估工具變量之間是否存在異質(zhì)性，P＞0.05代表篩選出的IV之間不存在異質(zhì)性。

1.3.4 敏感性分析 為提高結(jié)果的穩(wěn)健性，需要對(duì)IV篩選納入過(guò)程中產(chǎn)生的隨機(jī)誤差進(jìn)行分析并進(jìn)行敏感性分析。留一法（leave-one-out）是孟德?tīng)栯S機(jī)化研究中最常用于敏感性分析的方法，通過(guò)逐步剔除每個(gè)SNP，評(píng)估剩余SNP的Meta效應(yīng)，觀察剔除每個(gè)SNP前后結(jié)果是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如果剔除某個(gè)SNP后的MR估計(jì)結(jié)果與總結(jié)果的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則表明該SNP不會(huì)對(duì)結(jié)果造成非特異性影響，結(jié)果是穩(wěn)定的[15]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析軟件和技術(shù)路線(xiàn)

本研究使用R4.2.2軟件及“TwoSampleMR”軟件包[16]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。技術(shù)路線(xiàn)圖見(jiàn)圖1。

圖1 孟德?tīng)栯S機(jī)化研究流程圖Figure 1 Flowchart of Mendelian randomization study

2 結(jié)果

2.1 GWAS數(shù)據(jù)基本信息

攝入咖啡的GWAS數(shù)據(jù)來(lái)源于一項(xiàng)2018年實(shí)施的GWAS研究，樣本量為428 860例，包含9 851 867個(gè)SNP。前列腺癌的GWAS數(shù)據(jù)來(lái)源于一項(xiàng)2017年實(shí)施的研究，該研究樣本量為337 199例，均為歐洲人，包含334 926例健康對(duì)照者和2 273例患者，10 894 596個(gè)SNP，見(jiàn)表1。

表1 兩樣本孟德?tīng)栯S機(jī)化研究GWAS數(shù)據(jù)信息Table 1 Information of GWAS data for two-sample Mendel randomization

2.2 工具變量篩選結(jié)果

從攝入咖啡的GWAS數(shù)據(jù)中以P＜5×10-8為標(biāo)準(zhǔn)篩選并進(jìn)一步以r2=0.001和kb=10 000這兩個(gè)參數(shù)去除存在連鎖不平衡的SNP，得到40個(gè)與暴露相關(guān)的SNP。接著在前列腺癌GWAS數(shù)據(jù)中以P＜5×10-8為標(biāo)準(zhǔn)剔除與前列腺癌相關(guān)的SNP，最終篩選得到38個(gè)SNP。F統(tǒng)計(jì)量為115.38，表明工具變量不太可能存在弱工具變量偏倚，見(jiàn)表2。

表2 孟德?tīng)栯S機(jī)化工具變量信息Table 2 Information on instrumental variables for Mendelian randomization

2.3 多效性檢驗(yàn)

本研究通過(guò)MR-Egger回歸驗(yàn)證篩選出的IV是否獨(dú)立于咖啡-前列腺癌關(guān)聯(lián)的混雜因素，結(jié)果顯示Egger intercept=4.2E-5，P=0.581，說(shuō)明研究結(jié)果未受基因多效性的顯著影響。此外，漏斗圖也顯示本研究不太可能受到潛在偏倚的影響，見(jiàn)圖2。

圖2 孟德?tīng)栯S機(jī)化結(jié)果漏斗圖Figure 2 Funnel plot of Mendelian randomization results

2.4 因果效應(yīng)估計(jì)結(jié)果

本研究最終納入了38個(gè)SNP，每個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)前列腺癌的影響見(jiàn)圖3、4。逆方差加權(quán)法顯示攝入咖啡可能降低前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=0.994, 95%CI: 0.990～0.999,P=0.009）。采用加權(quán)中位數(shù)方法得到一致的結(jié)論（OR=0.991,95%CI: 0.985～0.999,P=0.018），不過(guò)MR-Egger回歸未發(fā)現(xiàn)兩者存在關(guān)聯(lián)（OR=0.992, 95%CI:0.983～1.000,P=0.084）。

圖3 孟德?tīng)栯S機(jī)化結(jié)果森林圖Figure 3 Forest plot of Mendelian randomization results

圖4 孟德?tīng)栯S機(jī)化結(jié)果散點(diǎn)圖Figure 4 Scatter plot of Mendelian randomization results

2.5 異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果

由于暴露和結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)源于兩個(gè)獨(dú)立的隊(duì)列研究，工具變量之間可能存在異質(zhì)性。采用MREgger法進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，得到的結(jié)果為Q=27.20,P=0.854，表明IV之間不存在異質(zhì)性。

2.6 敏感性分析

采用逐一剔除IV（留一法）對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行敏感性分析，見(jiàn)圖5，剔除任意一個(gè)IV后，IVW方法計(jì)算余下IV的效應(yīng)值與總IV效應(yīng)值均無(wú)顯著變化（P＜0.05），表明不存在對(duì)研究結(jié)果造成顯著影響的IV，結(jié)論穩(wěn)健，即攝入咖啡可能降低前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)（OR: 0.994, 95%CI: 0.990～0.999,P=0.009）。

圖5 “留一法”敏感性分析結(jié)果Figure 5 Sensitivity analysis results of the “l(fā)eaveone-out” method

3 討論

探索前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)因素對(duì)于其防治具有重要意義?？Х仁侨藗?nèi)粘Ｉ钪幸环N十分常見(jiàn)的飲品，本研究利用兩樣本孟德?tīng)栯S機(jī)化方法評(píng)估攝入咖啡和前列腺癌的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示攝入咖啡可能降低前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，異質(zhì)性檢驗(yàn)及敏感性分析進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)論的可靠性。

先前一些觀察性研究支持本結(jié)論。日本學(xué)者對(duì)18 853名40～79歲的男性進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)11年的隨訪(fǎng)，發(fā)現(xiàn)攝入咖啡可顯著降低前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)，且咖啡攝入量與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[17]。一項(xiàng)納入多項(xiàng)隊(duì)列研究的Meta分析結(jié)果證實(shí)攝入咖啡可降低前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)（OR=0.91, 95%CI: 0.84～0.98）[18]。攝入咖啡降低前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制尚未十分明確，目前一些研究顯示可能與以下機(jī)制有關(guān)：咖啡中的咖啡因具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能減少活性氧產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡及防止細(xì)胞基因突變[19]；咖啡能夠抑制細(xì)胞炎性反應(yīng)，下調(diào)炎性反應(yīng)因子諸如IL-6[20]、TNF-α[21]、CRP[22]的表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)因子對(duì)DNA的損傷及細(xì)胞上皮屏障的破壞[23]；咖啡還可促進(jìn)DNA修復(fù)蛋白O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，對(duì)受損的DNA進(jìn)行修復(fù)，防止細(xì)胞發(fā)生癌變[24]；另有研究發(fā)現(xiàn)咖啡可阻滯細(xì)胞周期，下調(diào)BCL-2表達(dá)，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡[25]；雄激素受體（androgen receptor, AR）是前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中一個(gè)至關(guān)重要的靶點(diǎn)，Iwamoto等[26]證實(shí)咖啡醇可顯著下調(diào)AR表達(dá)，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲及誘導(dǎo)凋亡。

本研究為攝入咖啡降低前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供了更高等級(jí)的證據(jù)。首先，傳統(tǒng)的觀察性研究往往無(wú)法排除混雜因素以及受到回憶偏倚等諸多因素的影響，研究結(jié)論可信度較低。而孟德?tīng)栯S機(jī)化方法基于等位基因隨機(jī)分配給子代的原理，且需滿(mǎn)足三個(gè)核心假設(shè)，類(lèi)似于隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，因此能夠最大程度避免受到混雜因素及選擇偏倚、回憶偏倚的干擾。其次，基因變異先于疾病結(jié)局發(fā)生，不易產(chǎn)生反向因果關(guān)系。另外，孟德?tīng)栯S機(jī)化研究是根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)發(fā)布的GWAS匯總數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，樣本量極大，顯著增加了檢驗(yàn)效能。

本研究仍然存在一些不足。第一，研究采用歐洲人群數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)論可能無(wú)法適用于其他種族，尚需納入更多國(guó)家及種族的人群進(jìn)行研究。第二，研究獲取的GWAS數(shù)據(jù)只包含了人群SNP等基本信息，缺乏咖啡攝入量、前列腺癌分期的詳細(xì)信息，無(wú)法進(jìn)行亞組分析。第三，研究雖然樣本量較大，且經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制，但仍可能受到潛在未知的混雜因素影響研究結(jié)果，需更多獨(dú)立的大樣本研究來(lái)排除結(jié)論的偶然性。

綜上所述，本研究通過(guò)兩樣本孟德?tīng)栯S機(jī)化方法研究攝入咖啡與前列腺癌的因果關(guān)系，發(fā)現(xiàn)攝入咖啡可能降低前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。