史晉宇，邢琳，劉世佳，呂文豪，張冰琰，徐立君，張亞芬

0 引言

范可尼貧血（fanconi anemia, FA）是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，涉及多種類型的血細胞減少、先天性畸形和腫瘤性疾病[1]。目前對這一臨床和生物學(xué)上復(fù)雜的癌癥易感綜合征的認(rèn)識取得了顯著進展。在主要通過細胞周期S期激活的FA通路中，DNA損傷修復(fù)受到大量蛋白之間相互作用的調(diào)節(jié)，包括22種FA相關(guān)蛋白。編碼FA蛋白的基因中任何一個基因的遺傳變異都會導(dǎo)致不同亞型的FA。當(dāng)外源DNA損傷如順鉑等交聯(lián)劑損傷導(dǎo)致復(fù)制受阻時，復(fù)制叉失活，從而激活FA通路（也稱為FA-BRCA通路），通過磷酸化、泛素化等多種修飾募集FA相關(guān)蛋白。其中，F(xiàn)A核心復(fù)合物對FANCD2-FANCI異源二聚體的單泛素化促進DNA修復(fù)效應(yīng)物募集到染色質(zhì)損傷，以解決DNA損傷和有絲分裂[2]。此外，由于FA通路與癌癥易感性有關(guān)，BRCA1和BRCA2等一些FA基因的單個等位基因胚系失活會導(dǎo)致常見的家族性乳腺癌易感綜合征[3]。因此，更好地了解該通路的機制和作用將有助于開發(fā)更具針對性的癌癥治療藥物。

1 鏈間交聯(lián)與范可尼貧血通路的作用機制

范可尼貧血是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，涉及多種類型的血細胞減少、先天性畸形和腫瘤性疾病[3]。FA患者的細胞表現(xiàn)出自發(fā)性基因組不穩(wěn)定性，并且對DNA鏈間交聯(lián)劑（如MMC和內(nèi)源性醛類）敏感，也可能誘導(dǎo)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)[4]。DNA鏈間交聯(lián)（interstrand crosslinks, ICL）是由各種內(nèi)源性代謝物、環(huán)境暴露和癌癥化療藥物引起的一種病理變化，其共同特征是在兩個核苷酸上形成共價連接，從而阻礙DNA的分離，使包括DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄在內(nèi)的基本細胞過程受到阻礙。ICL主要在DNA復(fù)制分叉停滯時的S階段被檢測到。范可尼貧血途徑、DNA修復(fù)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白的大量翻譯后修飾促進了ICL的損傷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和修復(fù)。未修復(fù)的ICL會導(dǎo)致DNA斷裂和染色體重排，這解釋了范可尼貧血的骨髓衰竭特征以及為什么交聯(lián)劑在癌癥治療中有效。目前已知22種FA基因（FANCA-W）的突變將會導(dǎo)致該疾病的發(fā)生[5-6]。這22個FA基因產(chǎn)物可分為四個功能組：第一組是FANCM復(fù)合體，即損傷傳感模塊；第二組是E3泛素連接酶，又稱為FA核心復(fù)合物；第三組是FANCI-FANCD2（I-D2）異二聚體復(fù)合物，是FA通路和E3連接酶底物的關(guān)鍵效應(yīng)物；第四組是下游FA蛋白，包括其他DNA修復(fù)/損傷耐受因子[7]。FA通路的一個關(guān)鍵功能是通過I-D2異二聚體的單泛素化和染色質(zhì)靶向來協(xié)調(diào)DNA損傷反應(yīng)（DNA damage response, DDR）。下文將對FA通路對ICLs的修復(fù)進行概述，見圖1。

圖1 FA通路所涉及的步驟示意圖F i g u r e 1 S c h e m a t i c diagram of steps involved in the FA pathway

1.1 損傷信號的識別與FA通路的激活

損傷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)始于將FANCM、FAAP24和MHF募集到復(fù)制叉中，與未纏繞的DNA結(jié)合[8]。FANCM對復(fù)制叉的重塑導(dǎo)致ssDNA結(jié)合蛋白，即復(fù)制蛋白A（replication protein A, RPA）的募集。RPA定位到DNA是ATR激活所必需的[9]。FANCM一旦與染色質(zhì)結(jié)合，就可以作為FA核心復(fù)合物的著陸平臺。FA核心復(fù)合物蛋白被招募到DNA損傷位點，與多種蛋白質(zhì)相互作用，并作為范可尼貧血蛋白FANCD2和FANCI的泛素連接酶（E3泛素化連接酶）發(fā)揮作用[9]。

1.2 I-D2在FA通路中的重要作用

I-D2的激活至少涉及兩種翻譯后修飾。首先，在FA核心復(fù)合物募集到ICLs時，I-D2的磷酸化被激活[10]。FANCI和FANCD2隨后以相互依賴的方式單泛素化。該單泛素化步驟由FA核心復(fù)合物通過其泛素連接酶亞基FANCL和相應(yīng)的E2泛素結(jié)合酶UBE2T（又稱FANCT）催化完成[11-13]。泛素化的FANCD2定位于ICL區(qū)，在ICL區(qū)充當(dāng)SLX4和FA相關(guān)核酸酶1（Fanconi anemia-associated nuclease 1, FAN1）募集因子的著陸點[14-15]。同時，F(xiàn)ANCD2協(xié)調(diào)DNA內(nèi)切酶MUS81、SLX1和XPF/ERCC4/FANCQ的作用[16-17]。這些內(nèi)切酶切割I(lǐng)CL附近的DNA鏈，產(chǎn)生DNA加合物和ICL的雙鏈斷裂[1]。DNA加合物由跨損傷合成聚合酶如REV1或DNA聚合酶ζ（即REV3-REV7）繞過，而ICL來源的雙鏈斷裂則通過HR修復(fù)[18]。在這個高度保守的途徑中，DNA切口產(chǎn)生DSB，進一步DNA外切酶如CtBP相互作用蛋白（CtBP-interacting protein, CtIP）、MRN（MRE11-RAD50-NBS1）和核酸外切酶1（exonuclease 1, EXO1）切除雙鏈斷裂，從而產(chǎn)生3'單鏈DNA懸垂[19-20]。DNA懸垂最初被RPA包被，一旦RAD51/FANCR重組酶識別R PA 覆蓋的s s D N A，在B R C A 2/FANCD1、FANCN/PALB2、RAD51C/FANCO、BRIP1/BACH1/FANCJ和XRCC1/FANCU蛋白的協(xié)助下，RAD51/FANCR重組酶促進RPA從3'懸垂中移除并刺激重組絲的形成。重組絲對最終的修復(fù)過程進行同源搜索并催化同源配對和DNA鏈侵襲和交換[21-22]。值得注意的是，ICLs的識別不僅導(dǎo)致FA通路修復(fù)過程，還導(dǎo)致ATR-CHK1細胞周期檢查點的激活，從而減緩DNA復(fù)制并允許修復(fù)發(fā)生。

1.3 修復(fù)后FA通路的關(guān)閉

完成DNA損傷修復(fù)后需要關(guān)閉FA通路，以防止細胞周期阻滯延長和細胞死亡。進一步翻譯和修飾FA蛋白可以促進終止FA通路反應(yīng)。在DNA修復(fù)完成后，F(xiàn)ANCD2-FANCI單泛素化被泛素羧基末端水解酶1（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 1, USP1）- USP1相關(guān)因子1（USP1-associated factor 1, UAF1；又稱WDR48）去泛素化酶復(fù)合物逆轉(zhuǎn)[13,23]。剩余的加合物通過核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair, NER）去除，以完成ICL修復(fù)[24]。此外，通過SUMO靶向泛素E2連接酶RNF3和ATPase p97及時從染色質(zhì)中提取FANCD2，在調(diào)節(jié)DNA修復(fù)位點活性和FANCD2水平的平衡中起著重要作用。修復(fù)后關(guān)閉FA通路對于限制核酸酶活性以及促使ID復(fù)合物在DNA修復(fù)的多個步驟中發(fā)揮作用是必要的[25]。

2 范可尼貧血通路與癌癥的相關(guān)性

2.1 FA患者的患癌風(fēng)險增加

FA患者往往會出現(xiàn)造血功能衰竭，這與進行性全血細胞減少癥有關(guān)。這導(dǎo)致缺乏功能性的骨髓干細胞，而骨髓干細胞是細胞周轉(zhuǎn)過程中補充血細胞數(shù)量的必要條件。嚴(yán)重的FA患者會發(fā)展成急性骨髓性白血病，但隨著造血干細胞移植的不斷發(fā)展，F(xiàn)A患者的生存狀況已明顯改善，生育能力的降低和腫瘤發(fā)病率的增加已經(jīng)成為年輕FA患者的嚴(yán)重問題[26]。造血干細胞移植增加了實體瘤的形成傾向，這與造血干細胞移植前的化療方案（環(huán)磷酰胺和放療）有關(guān)。環(huán)磷酰胺和放療可促使ICL的發(fā)生，而由于FA患者FA修復(fù)通路的缺乏使癌癥發(fā)病率增長迅速[1]。

基因組不穩(wěn)定是癌細胞的一個重要特征，該特征可能源于DNA修復(fù)機制的失敗，該機制基本上是作為一個腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)來維護基因組的完整性和防止惡性腫瘤。FA與癌癥易感性之間的聯(lián)系已被充分證實，F(xiàn)A患者群體往往會表現(xiàn)出各種各樣的癌癥[27]。有研究表明近25%的FA患者會發(fā)生惡性腫瘤[27]，最常見的是血液病，如骨髓增生異常綜合征和急性髓細胞白血病[28]。在實體瘤中，鱗狀細胞癌對FA患者構(gòu)成了最高的風(fēng)險，主要發(fā)生在頭、頸和食管[1]，可能是由于這些組織的復(fù)制潛力增加，促進了癌癥的生長。除此之外，F(xiàn)A相關(guān)的癌癥通常發(fā)生在乳腺、肝臟、胰腺、外陰、肛門和卵巢組織[1,29]。

2.2 FA相關(guān)基因突變與癌癥的相關(guān)性

FA相關(guān)基因尤其是FA核心復(fù)合物任何成分的基因突變，都會導(dǎo)致FANCI-FANCD2單泛素化缺陷和DNA損傷敏感性、出生缺陷、早發(fā)性骨髓衰竭和癌癥傾向。最近FA蛋白的突變在FA患者群體之外的家族性和散發(fā)性癌癥中也有報道。

Del Valle等通過下一代定制測序組合分析了總共1 021例遺傳性癌癥患者和194例對照，研究發(fā)現(xiàn)最常突變的基因是FANCA、FANCL和FANCM[30]，其中與Figlioli研究的南歐隊列一致的是，F(xiàn)ANCM中c.5791C＞T突變與雌激素受體ER陰性乳腺癌風(fēng)險相關(guān)[31]。Gulnur等通過對來自哈薩克斯坦的125例（年齡17～50歲）早發(fā)性CRC患者的外周血DNA基因組進行二代測序，識別出FANCA、FANCD2和FANCI突變可能與結(jié)直腸癌有關(guān)[32]。同時，在對包含573例腸癌患者的中國隊列測序中，發(fā)現(xiàn)FANCD2、FANCA、FANCG、FANCL和SLX4的突變是癌癥的易感因素[33]。除此之外，F(xiàn)ANCA突變攜帶者與乳腺癌和卵巢癌的患病風(fēng)險有顯著關(guān)聯(lián)[30]，F(xiàn)ANCD1突變與卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌和胰腺癌有關(guān)[34-36]。FANCL突變與乳腺癌和白血病有關(guān)[30,37]。FANCD2突變與乳腺癌、肺腺癌等多種癌癥相關(guān)[38-39]。FANCC和FANCG與胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌有關(guān)[40-41]。

2.3 FA相關(guān)基因的過表達與癌癥的相關(guān)性

如上所述，F(xiàn)A基因的獲得性突變發(fā)生在非FA的個體散發(fā)性癌癥中，并且FA基因突變相關(guān)的易癌表型支持FA蛋白的腫瘤抑制功能。除了基因突變外，F(xiàn)A基因的拷貝數(shù)變化也常見于多種癌癥中。Liu等分別使用TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的腫瘤和組織對單個FA基因的差異表達分析也同樣表明，大多數(shù)FA基因在各類癌癥中過表達[42]。

以FANCD2為例，研究表明，在肺腺癌中FANCD2的高表達水平與較高的TNM分期、高腫瘤負荷、低化療敏感性、低免疫評分、低生存率有關(guān)[43]。Zheng等發(fā)現(xiàn)FANCD2在子宮內(nèi)膜癌中高表達，且較高的FANCD2表達與更深的肌層浸潤和更多的錯配修復(fù)狀態(tài)相關(guān)。敲低癌細胞系中FANCD2表達抑制了惡性增殖和遷移能力，并賦予EC細胞對鏈間交聯(lián)劑的敏感性[44]。在散發(fā)性乳腺癌中FANCD2的過表達與激素受體陰性、HER2擴增、p53表達升高、高級別和高增殖相關(guān)，且FANCD2/Ki-67免疫熒光雙染的結(jié)果表明，F(xiàn)ANCD2與Ki-67在浸潤性乳腺癌細胞中共表達，并且二者呈顯著正相關(guān)[38]。另外一項研究評估了50例結(jié)直腸癌活檢中的FANCT/UBE2T蛋白水平與手術(shù)前未接受放療或化療患者的配對非癌性黏膜的比較，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌標(biāo)本中FANCT蛋白水平高于配對的非癌組織。同樣，與UBE2T蛋白表達低的標(biāo)本相比，具有高FANCT蛋白表達的腫瘤組織樣本與較晚期的TNM分期和更差的總生存期相關(guān)[45]。由此可見，多項研究表明FA相關(guān)基因的過表達與較強的癌細胞遷移、增殖能力、較差的臨床分期、較差的預(yù)后相關(guān)[29,42,46]。

綜上所述，一方面，缺乏FA通路和損傷修復(fù)通路的重定向造成基因組的不穩(wěn)定，導(dǎo)致突變、缺失和易位的積累，構(gòu)成腫瘤克隆選擇的起始點。另一方面，F(xiàn)A基因表達的升高和DNA損傷修復(fù)能力的提高有利于減輕伴隨癌細胞快速增殖帶來的過量DNA損傷和染色體異常[42]。FA通路的雙相需求模型在癌癥發(fā)生和發(fā)展的整個過程中發(fā)揮著重要作用。

3 靶向范可尼貧血通路在癌癥治療中的作用

3.1 FA途徑與耐藥性的關(guān)系

一系列誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥物，如順鉑，是卵巢癌、睪丸癌和其他缺乏有效靶向藥物治療疾病的標(biāo)準(zhǔn)臨床療法[47]。耐藥性是限制其應(yīng)用的主要因素之一[42]。FA通路是修復(fù)順鉑導(dǎo)致的聯(lián)檢交聯(lián)所需的DNA損傷反應(yīng)通路，該通路的再激活可能是癌癥治療中獲得性順鉑耐藥的原因之一。研究表明，具有FANCF甲基化的卵巢癌細胞系對順鉑敏感，而這些細胞中的FANCF脫甲基化可恢復(fù)其耐藥性[48]，在攜帶FANCF基因異常去甲基化的細胞系亞群中也發(fā)現(xiàn)了類似的耐藥性[48]。近期研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑耐藥的非小細胞肺癌中觀察到FA相關(guān)基因FANCL和RAD18的上調(diào)，通過下調(diào)這些基因同樣恢復(fù)了對順鉑的敏感性。類似的方法顯示，siRNA介導(dǎo)的FA相關(guān)基因FANCL和RAD18以及HR相關(guān)基因BRCA1和BRCA2的沉默，通過抑制FA通路顯著增強了A549/DR細胞對順鉑的敏感性[49]。同時，增強的FA通路激活也被證明與多發(fā)性骨髓瘤和胰腺癌中對馬法蘭的耐藥性有關(guān)[42]。這些實驗數(shù)據(jù)均提示了FA通路在化療耐藥中的重要作用以及開發(fā)FA靶向藥物的必要性。

3.2 靶向FA通路的特異性抑制劑

近年來有關(guān)DNA損傷化療藥物的耐藥性研究在廣泛開展，其中針對FA通路的靶向藥物可作為增敏劑克服腫瘤細胞的耐藥性，從而增強化療藥物的抗腫瘤活性。SERPINB3是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，在多種鱗狀細胞癌中高表達，并表現(xiàn)出顯著的抗凋亡特性。Huang等基于HPV陽性頭頸鱗癌順鉑敏感反應(yīng)的RNA測序鑒定了SERPINB3，發(fā)現(xiàn)SERPINB3可以被HPV癌蛋白E6下調(diào)，并通過抑制DNA損傷修復(fù)來促進HPV陽性HNSCC中的順鉑敏感性，并基于此構(gòu)建了內(nèi)體PH響應(yīng)納米顆粒系統(tǒng)靶向敲低SERPINB3，通過抑制USP1表達抑制FA途徑中的FANCD2-FANCI去泛素化，打斷順鉑誘導(dǎo)的ICL修復(fù)通路，最終引發(fā)細胞凋亡[50]。Yuan等通過JC-1染色、碘化丙啶染色和蛋白質(zhì)印跡實驗證實，雙硫侖可以抑制FA修復(fù)途徑使鉑類化療藥物在內(nèi)的DNA損傷劑產(chǎn)生致敏作用，從而增強腫瘤細胞的凋亡[51]。有研究報道復(fù)制體蛋白And-1可以通過感知ICL并將FANCM/FAAP24復(fù)合物募集到停滯的復(fù)制叉中，其與FANCM復(fù)合物協(xié)調(diào)進行ICL修復(fù)。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)抑制And-1的活化可以抑制卵巢癌的順鉑耐藥性[52]。

除此之外，目前已報道多種藥物通過抑制FANCD2增強癌細胞對順鉑的敏感性。Singh等研究表明，planispine A通過抑制FANCD2單泛素化和FANCD2復(fù)合體的形成，因此與順鉑聯(lián)合作用時增加癌細胞的凋亡[53]。小梭菌乙醇提取物聯(lián)合順鉑用于非小細胞肺癌、exportin 1 inhibitors（XPO1i）聯(lián)合melphalan用于多發(fā)性骨髓瘤等，也均是通過類似的機制增強癌細胞對化療藥物的敏感性，成為聯(lián)合化療的新型抗癌藥物[54-55]。

4 結(jié)語與展望

范可尼貧血是一種隱性遺傳性疾病，除了骨髓衰竭和先天性異常的病理表現(xiàn)外，F(xiàn)A還與染色體異常和基因組不穩(wěn)定有關(guān)，因此代表了癌癥易感性的遺傳易感特性。隨著癌癥中FA基因改變的普遍發(fā)生和FA通路激活相關(guān)化療耐藥性的觀察，F(xiàn)A通路與癌癥的相關(guān)性進一步確立。因此，明確FA通路修復(fù)ICLs并保護基因組完整性的詳細機制具有重要意義，通過了解與FA相關(guān)的致癌機制，有望促進有效預(yù)防、治療和早期檢測范可尼貧血相關(guān)癌癥的發(fā)展研究，并進一步開發(fā)針對FA和家族性或散發(fā)性癌癥的個體化靶向治療方案。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。