張楠楠 周伊帆 朱燚 安明宇 鄧穎 李軍

摘要：探究銅死亡相關(guān)基因?qū)Ω渭?xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）的影響，并挖掘治療HCC的活性成分。通過GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE84402數(shù)據(jù)集，獲取肝癌差異表達(dá)基因，通過文獻(xiàn)檢索銅死亡相關(guān)基因，兩者取交集獲得肝癌相關(guān)銅死亡基因。進(jìn)一步分析交集基因，使用UALCAN分析其差異表達(dá)，R語言分析其表達(dá)水平與臨床的相關(guān)性，Kaplan-Meier Plortter分析其預(yù)后價(jià)值，HCMDB分析其與肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并使用THPA分析其與肝癌的病理關(guān)系。最后進(jìn)行化合物預(yù)測(cè)與分子對(duì)接。結(jié)果表明，與正常組相比，銅死亡關(guān)鍵基因SLC31A1、DBT在腫瘤中表達(dá)水平下調(diào)，病理分析顯示其蛋白在HCC組織中表達(dá)增加，且與臨床相關(guān)性變量性別、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，其高表達(dá)與肝癌預(yù)后良好相關(guān)，其中SLC31A1低表達(dá)與肝癌向腎上腺、肺部轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。最后篩選出可能與SLC31A1、DBT結(jié)合的活性化合物，其中白藜蘆醇、葉酸對(duì)接分?jǐn)?shù)高。研究認(rèn)為銅死亡相關(guān)基因SLC31A1、DBT在HCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，為HCC的診斷及治療藥物研究提供了新思路。

關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞癌；銅死亡；SLC31A1；DBT

中圖分類號(hào)：R965.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1002-4026（2024）01-0039-12

Identification and compound screening of copper-induced cell death-related genes SLC31A1 and ‘DBT in hepatocellular carcinoma

Abstract∶This study aimed to investigate the effect of copper-induced cell death-related genes on hepatocellular carcinoma （HCC） and to explore active components for treating HCC. The GSE84402 dataset was downloaded from the Gene Expression Omnibus （GEO） database to obtain the differentially expressed genes associated with HCC， and copper-induced cell death-related genes were retrieved from past literature; the commonalities between the two were considered to obtain HCC-related copper-induced cell death genes. The genes in common were further analyzed for differential expression using the UALCAN （University of Alabama at Birmingham Cancer Data Analysis） portal， the correlation between their expression levels and clinical levels was analyzed using the R language， prognostic value was determined using the Kaplan-Meier plotter， their relationship with HCC metastasis was examined using the Human Cancer Metastasis Database （HCMDB）， and their pathological relationship with HCC was explored using the ‘Treponema pallidum hemagglutination test. Lastly， compound prediction and molecular docking were performed. The results showed that compared with the normal group， expression levels of the key copper-induced cell death genes SLC31A1 and ‘DBT were downregulated in tumors， and pathological analysis showed that their proteins were increased in HCC tissues. In addition， these genes were significantly correlated with the clinical correlation variables of sex， tumor stage， and lymph node metastasis. Their high expression was correlated with a good HCC prognosis， whereas low expression of SLC31A1 was significantly correlated with the metastasis of HCC to the adrenal glands and lungs. Finally， the active compounds that may bind to ‘SLC31A1 ‘a(chǎn)nd ‘DBT ‘were screened， of which resveratrol and folic acid exhibited high docking scores. Hence， it could be concluded that copper-induced cell death-related genes SLC31A1 and ‘DBT play an important role in the development of HCC， and this study provides new theories for the diagnosis of HCC and therapeutic drug research.

Key words∶hepatocellular carcinoma; cuproptosis;SLC31A1; ‘DBT

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)新發(fā)HCC病例約占全球50%以上[1]。目前，HCC以其18% 的5年生存率成為僅次于胰腺癌的第二大致死癌癥[2]。HCC具有異質(zhì)性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、預(yù)后差等特點(diǎn)，早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療、抗轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、精準(zhǔn)施治是改善患者生存率的關(guān)鍵。

銅死亡是一種新型的細(xì)胞死亡方式，由蛋白質(zhì)脂?；閷?dǎo)且與線粒體代謝高度相關(guān)[3]。銅通過單獨(dú)或與配體結(jié)合促進(jìn)血管生成，而銅螯合則抑制這一過程，這是腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移必不可少的因素[4-6]。銅直接與三羧酸循環(huán)（TCA）的脂?；煞纸Y(jié)合，導(dǎo)致毒性蛋白質(zhì)應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。細(xì)胞死亡是腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，是癌癥起源和發(fā)展的基礎(chǔ)。

本研究通過聯(lián)合癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）中HCC的基因芯片數(shù)據(jù)，篩選HCC組織與周圍正常組之間的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），對(duì)關(guān)鍵基因的差異表達(dá)、臨床相關(guān)性、生存分析及腫瘤轉(zhuǎn)移分析以及免疫組化等進(jìn)行綜合驗(yàn)證，從而對(duì)HCC的治療及預(yù)后尋找潛在靶標(biāo)，并進(jìn)一步發(fā)掘治療HCC的化合物活性成分并進(jìn)行分子對(duì)接。本研究旨在為HCC的發(fā)病機(jī)制研究和治療提供新思路和方法，為抗癌新藥及其靶點(diǎn)的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從文獻(xiàn)中收集獲得銅死亡基因。通過下載GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（htpp： //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中來自于分析平臺(tái)GPL570，樣本數(shù)為28個(gè)的基因表達(dá)譜芯片GSE84402數(shù)據(jù)和HCC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其相應(yīng)患者的臨床信息[8-9]。使用UCSC Xena 網(wǎng)站（https：//xena.ucsc.edu/）下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)其余的32種腫瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)行基因差異表達(dá)分析、臨床相關(guān)性分析、腫瘤轉(zhuǎn)移分析及生存分析。

1.2 分析差異基因

使用R語言（3.6.3版本）limma包中的izeBetweenArrays函數(shù)，對(duì)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的GSE84402數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)均一化處理，繪制箱式圖。以p<0.05， fold change （|log2 ‘FC|） >1作為篩選條件。利用limma包對(duì)正常組和癌癥組進(jìn)行差異分析，所獲得的DEGs使用ggplot2包和ComplexHeatmap包分別繪制火山圖和聚類熱圖。運(yùn)用Venny 2.1.0在線工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/venn/），獲得并保留與銅死亡相關(guān)的交集基因，并將其定為關(guān)鍵基因做進(jìn)一步分析。

1.3 關(guān)鍵基因差異表達(dá)分析

以TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)為來源，使用UALCAN在線工具（http：//ualcan.path.uab.edu/）分析關(guān)鍵基因表達(dá)量在HCC組織與非癌組織中的差異并探究其臨床研究意義[10]。篩選條件：（1）TCGA分析 ；（2）檢索基因DBT、SLC31A1 ；（3）TCGA數(shù)據(jù)集HCC；（4）分析索引為表達(dá)分析；（5）統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p<0.05。

1.4 ROC（receiver operating characteristic）分析

以TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)為來源，通過R語言（3.6.3版本）中pROC包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，ggplot2包繪圖，ROC曲線下的面積值在0.5～1.0之間，在模型評(píng)估指標(biāo)area under the curve（SAUC）>0.5的情況下，SAUC值越接近1，說明診斷效果越好，通過ROC曲線分析以評(píng)估SLC31A1、DBT在HCC診斷上的可行性。

1.5 關(guān)鍵基因與臨床相關(guān)性分析

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載格式為HTSeq-FPKM的HCC（肝細(xì)胞HCC）RNAseq數(shù)據(jù)和患者的臨床信息數(shù)據(jù)，將其轉(zhuǎn)化為TPM格式進(jìn)行以2為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后，使用R語言（3.6.3版本）中g(shù)gplot2包對(duì)關(guān)鍵基因在HCC中的表達(dá)量進(jìn)行臨床相關(guān)性可視化和統(tǒng)計(jì)分析。p<0.05則結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 生存分析

使用Kaplan-Meier Plortter在線工具（https：//kmplot.com/）進(jìn)行Kaplan-Meier曲線和log rank檢驗(yàn)分析，探索其表達(dá)量與HCC患者生存時(shí)間的關(guān)系[8]。p<0.05，風(fēng)險(xiǎn)率RH>0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 腫瘤轉(zhuǎn)移分析

使用HCMDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//hcmdb.i-sanger.com/）對(duì)關(guān)鍵基因在HCC轉(zhuǎn)移中的沉積量進(jìn)行分析，探索關(guān)鍵基因沉積量在腫瘤轉(zhuǎn)移中的變化[11]。p<0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8 免疫組織化學(xué)分析

通過THPA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.proteinatlas.org/）獲取含有關(guān)鍵基因的正常組織與病理組織圖譜，分析對(duì)比正常組織與癌癥組織的差異[12]。

1.9 活性化合物篩選

通過內(nèi)置于 CTD 數(shù)據(jù)庫(kù) （http：//ctdbase.org/）的 PTS 網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，分析與靶基因相互作用的分子結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步檢索與關(guān)鍵基因相互作用的活性化合物[9]。

1.10 分子對(duì)接

根據(jù)CTD數(shù)據(jù)庫(kù)獲得關(guān)鍵基因的活性化合物成分，通過PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.pdbus.org/）查找獲得人源蛋白的3D結(jié)構(gòu)，聯(lián)合TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph）和PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 獲取關(guān)鍵基因相對(duì)應(yīng)活性化合物的分子3D結(jié)構(gòu)[13]，將蛋白及化合物的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入BIOVIA Discovery Studio （DS） 2016軟件進(jìn)行分子對(duì)接，檢驗(yàn)蛋白與活性成分的親和性。

1.11 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞（HepG2，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，編號(hào)SCSP-510），在含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素混合物的低糖DMEM培養(yǎng)液（gibico，批號(hào)8123299）中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，分別以0、50、100、200 μmol/L的葉酸（MedChemExpress，貨號(hào)HY-6637）處理細(xì)胞24 h后，每孔加入60 μL含PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（Solarbio，貨號(hào)R000）提取細(xì)胞中的蛋白。

1.12 蛋白免疫印跡

提取HepG2細(xì)胞中的蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡（western blot，WB）分析。使用 BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（Solarbio， 貨號(hào)PC0020，規(guī)格500微孔）定量后，用SDS-PAGE 凝膠（Solarbio，貨號(hào)P1200-1/P1200-2）分離出等量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶阻斷膜2 h，DBT抗體（Bioswamp，#PAB48456）和Anti-beta Actin Rabbit mAb（PTM BIO，#PTM-5436）孵育過夜，再用山羊抗兔IgG（H&L）-HRP（Bioworld，#bs13278）孵育2 h，而后使用ECL試劑盒（Millipore，批號(hào)2201215）進(jìn)行顯影，最后通過Image Lab軟件分析WB條帶的灰度值，將目標(biāo)蛋白與β-actin的灰度值比對(duì)進(jìn)行蛋白的定性及半定量分析。

1.13 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)來自3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析和圖片制作通過 SPSS 25.0 和 GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)以x[TX-*4]±s表示，多組間比較當(dāng)滿足正態(tài)及方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD；兩組間比較當(dāng)滿足正態(tài)時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC相關(guān)銅死亡差異基因篩選

通過limma包的數(shù)據(jù)處理分析結(jié)果顯示，26個(gè)樣本數(shù)據(jù)的中位數(shù)基本處于一條直線上，表明數(shù)據(jù)集質(zhì)量可靠、樣本歸一化程度好，如圖1（a）所示，可對(duì)HCC組和相應(yīng)的非癌組中的DEGs進(jìn)行下一步分析。將GSE84402芯片中的14例HCC組設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，14例非癌組織設(shè)為對(duì)照組，對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以閾值為|log2 ‘FC|>1和p<0.05作為初步篩選條件，通過火山圖可直觀地觀察到總體差異基因的分布情況，其中紅色小點(diǎn)代表上調(diào)基因，藍(lán)色小點(diǎn)代表下調(diào)基因（圖1（b））；再對(duì)其進(jìn)行聚類分析（圖1（d））；圖中藍(lán)色小塊代表下調(diào)基因，紅色小塊代表上調(diào)基因，方塊顏色越深表示差異表達(dá)的倍數(shù)越高。運(yùn)用Venny 2.1.0在線工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/venn/），獲得2個(gè)交集基因（圖1（c）），分別為SLC31A1、DBT。

2.2 關(guān)鍵基因差異表達(dá)分析

使用UALCAN在線工具以交集基因SLC31A1和DBT為關(guān)鍵基因，進(jìn)行差異表達(dá)分析。其結(jié)果見圖2，與正常組相比，關(guān)鍵基因SLC31A1和DBT在HCC腫瘤中均顯著下調(diào)。

2.3 ROC分析

使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，用R語言中的pROC包進(jìn)行ROC分析，ROC曲線下的面積值在0.5～1.0之間，在SAUC＞0.5的情況下，SAUC越接近于1，說明診斷效果越好。SAUC在 0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，SAUC在0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，SAUC在0.9以上時(shí)有較高準(zhǔn)確性。SAUC＝0.5時(shí)，說明診斷方法無診斷價(jià)值。根據(jù)圖3可知，SLC31A1對(duì)應(yīng)的SAUC=0.685，DBT對(duì)應(yīng)的SAUC=0.694，SAUC值均高于0.5，說明SLC31A1、DBT對(duì)HCC的診斷價(jià)值有準(zhǔn)確性。

2.4 臨床相關(guān)性分析

使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)探索SLC31A1、DBT在HCC患者不同亞型中的表達(dá)與性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)和癌癥分期間的關(guān)聯(lián)，性別分析如圖4（a）所示，與正常組相比，SLC31A1和DBT在男性和女性患者腫瘤中表達(dá)均顯著下調(diào)；N分期是腫瘤-結(jié)節(jié)-轉(zhuǎn)移（TNM）分期系統(tǒng)中的重點(diǎn)分期，N分期系統(tǒng)有5個(gè)階段，包括NX、N0、N1、N2和N3。N的后綴代表淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的程度。NX表示不能評(píng)估區(qū)域淋巴結(jié)；N0表示沒有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N1～N3表示區(qū)域淋巴結(jié)受累程度逐漸遞增。淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移分析如圖4（b）所示，SLC31A1和DBT與正常組相比，N0組顯著降低（p<0.001），N1組顯著降低不明顯，表明SLC31A1、DBT和局部淋巴結(jié)受累關(guān)系均不明顯。腫瘤分期分析如圖4（c）所示，與正常組相比，SLC31A1和DBT在I、II、III期患者腫瘤中的表達(dá)均顯著下調(diào)。

2.5 預(yù)后分析

將2個(gè)關(guān)鍵基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行5年生存預(yù)后分析，紅色線條代表基因高表達(dá)的生存情況，黑色線條代表低表達(dá)的生存情況，縱坐標(biāo)根據(jù)基因表達(dá)的高低，分為高、低表達(dá)組，數(shù)值代表隨時(shí)間變化存活的患者例數(shù)，為風(fēng)險(xiǎn)數(shù)字表，橫坐標(biāo)代表生存時(shí)間，OS表示總生存期，PFS表示無進(jìn)展生存期，其結(jié)果如圖5所示，關(guān)鍵基因p值均小于 0.05，RH>0.05表示統(tǒng)計(jì)值具有意義，SLC31A1、DBT高表達(dá)說明HCC預(yù)后良好。

2.6 腫瘤轉(zhuǎn)移分析

通過HCMDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析在HCC腫瘤轉(zhuǎn)移中關(guān)鍵基因SLC31A1、DBT沉積量的表達(dá)，觀察到SLC31A1的沉積量在腎上腺和肺部的轉(zhuǎn)移中表達(dá)量均具有統(tǒng)計(jì)意義，見圖6（a），但DBT轉(zhuǎn)錄物在腎上腺、肺部、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中統(tǒng)計(jì)差異不顯著，見圖6（b）。

2.7 病理分析

通過The human protein atlas project數(shù)據(jù)庫(kù)比較人類正常組織和癌癥組織之間不同蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明SLC31A1在肝癌組織中的表達(dá)低于正常肝組織。但DBT未在正常肝組織中探測(cè)到，在肝癌組織中表達(dá)量低。

2.8 分子對(duì)接和活性化合物篩選

根據(jù)CTD數(shù)據(jù)庫(kù)獲得SLC31A1、DBT相對(duì)應(yīng)的活性化合物成分，所獲化合物主要成分見表1，全表見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1。聯(lián)合TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)篩選并獲得SLC31A1、DBT相對(duì)應(yīng)化合物的2D結(jié)構(gòu)，并從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載上述關(guān)鍵基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)，再使用BIOVIA Discovery Studio （DS） 2016進(jìn)行分子對(duì)接，SLC31A1與所篩選藥物無法對(duì)接，DBT與葉酸和白藜蘆醇均能對(duì)接，結(jié)果見表2，其中對(duì)接效果最好的小分子化合物為葉酸（對(duì)接分?jǐn)?shù)134.542，圖8）。

2.9 Western Blot

采用 WB 檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。與未給藥干預(yù)組相比，HepG2細(xì)胞在50和100 μmol/L葉酸的干預(yù)下，DBT蛋白表達(dá)無明顯變化，但在200 μmol/L葉酸干預(yù)下，DBT蛋白表達(dá)升高（p＜0.005）。

3 討論

據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)估計(jì)，2018年HCC患者超過841 080例[1]?；颊叩幕疾÷逝c發(fā)病率密切相關(guān)，這反映其具有典型的晚期表現(xiàn)、有限的治療選擇、侵襲性和極差的總體生存率[14]。癌癥治療成本較高，治療費(fèi)用可能隨著越來越多的病人接受肝移植而上升[14-15]。因此，探索診斷HCC的腫瘤標(biāo)志物與治療HCC的藥物靶標(biāo)關(guān)重要。

銅死亡取決于細(xì)胞中銅的積累，是一種獨(dú)特的細(xì)胞死亡途徑。研究表明[4-6]，與正常組相比，許多惡性腫瘤中的銅含量更高，尤其在乳腺癌、肺癌、胃癌等不同癌癥患者的血清和腫瘤中，都發(fā)現(xiàn)了銅水平的高表達(dá)。同時(shí)，銅的積累與增殖和生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移有關(guān)[16]。銅離子載體（如Elesclomol）是銅離子的小分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以探索銅離子細(xì)胞毒性機(jī)制。銅水平的穩(wěn)定在各生理過程中至關(guān)重要，細(xì)胞內(nèi)銅的生物利用度失調(diào)可誘發(fā)氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒性[17]。因?yàn)槟[瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移對(duì)這種金屬營(yíng)養(yǎng)的要求更高。除此之外，銅除了作為活動(dòng)性位點(diǎn)代謝輔助因子外，也是一種動(dòng)態(tài)信號(hào)金屬和金屬變異體調(diào)節(jié)因子[18]，其在脂肪分解中依賴銅的磷酸二酯酶3B（PDE3B），在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中依賴絲裂原激活蛋白激酶激酶1（MEK1）和MEK2以及在自噬中依賴激酶ULK1和ULK2。

本研究首先通過 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得HCC及周圍正常組基因芯片數(shù)據(jù)集 GSE84402，對(duì)非癌組織和HCC組織進(jìn)行 DEGs 分析。將DEGs與已知的銅死亡基因取交集，獲得兩個(gè)重疊基因SLC31A1、DBT，并將其鎖定為進(jìn)一步研究的關(guān)鍵基因。為了進(jìn)一步明確SLC31A1、DBT在HCC中的臨床意義，本研究對(duì)SLC31A1、DBT在HCC中的差異表達(dá)水平與臨床分期、ROC、預(yù)后、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫組化的相關(guān)性進(jìn)行分析，并進(jìn)一步挖掘SLC31A1、DBT相對(duì)應(yīng)的活性化合物。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明，SLC31A1和DBT基因在HCC中顯著低表達(dá)，這提示SLC31A1、DBT的低表達(dá)可能促進(jìn)HCC的發(fā)展進(jìn)程。ROC分析結(jié)果表明， SLC31A1和DBT對(duì)HCC的診斷具有一定的準(zhǔn)確性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SLC31A1和DBT與HCC的相關(guān)性，進(jìn)行了臨床相關(guān)性分析，性別和癌癥分期分析結(jié)果表明， SLC31A1和DBT的表達(dá)下調(diào)可能是HCC發(fā)生進(jìn)展的重要影響因素；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分析表明，SLC31A1和DBT與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性不顯著。Kaplan-Meier Plortter數(shù)據(jù)庫(kù)mRNA RNA-seq預(yù)后分析結(jié)果顯示，SLC31A1和DBT的擴(kuò)增狀態(tài)影響HCC的預(yù)后狀態(tài)。HCMDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明，SLC31A1轉(zhuǎn)錄物在肝腫瘤轉(zhuǎn)移至腎上腺、肺臟中存在差異表達(dá)，但DBT在肝腫瘤至腎上腺、肺部、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中表達(dá)量無顯著差異，這提示在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中SLC31A1的差異表達(dá)有作為預(yù)測(cè)因子的潛在可能。THPA數(shù)據(jù)庫(kù)免疫組化分析結(jié)果顯示SLC31A1在HCC病理組織中低表達(dá)，提示其在HCC中的表達(dá)下調(diào)可能標(biāo)志著HCC的發(fā)生。

通過上述分析，驗(yàn)證銅死亡基因SLC31A1和DBT是影響肝癌進(jìn)展的重要因子，進(jìn)一步通過CTD數(shù)據(jù)、TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和PubChem挖掘SLC31A1和DBT相對(duì)應(yīng)的活性化合物，其中分子對(duì)接最佳化合物為葉酸和白藜蘆醇，對(duì)接分?jǐn)?shù)分別為134.542和79.635 5。WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，200 μmol/L葉酸干預(yù)下的HepG2細(xì)胞中DBT的蛋白表達(dá)量增加，其在HCC中表達(dá)的下調(diào)可能標(biāo)志著HCC的發(fā)生，這提示DBT有作為HCC預(yù)測(cè)因子及治療靶標(biāo)的潛在可能。白藜蘆醇是一種多酚有機(jī)化合物，不僅可抑制HEPG2細(xì)胞增殖，還通過抑制G1期和G2/M期的細(xì)胞周期從而抑制肝細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。此外，白藜蘆醇通過抑制活性氧的產(chǎn)生，并增加NOS的活性和NO生產(chǎn)來調(diào)節(jié)NO/NOS系統(tǒng)[18]。已有研究表明，白藜蘆醇可以通過激活p53，而抑制PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而導(dǎo)致beclin 1表達(dá)并抑制HCC細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移[20]。白藜蘆醇使有氧糖酵解的HCC細(xì)胞凋亡，糖酵解抑制劑可減輕這種效應(yīng)[21]。白藜蘆醇誘導(dǎo)線粒體凋亡與HCC細(xì)胞HK2表達(dá)的降低有關(guān)[21]。此外，白藜蘆醇增強(qiáng)了索拉非尼誘導(dǎo)的有氧糖酵解HCC細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。這兩種試劑聯(lián)合治療可抑制HCC小鼠的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡[21]。研究表明，葉酸在HCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，葉酸修飾的TPGS-FA可作為NCet等藥物的有效載體，并有望成為治療HCC的一種有效、安全的藥物[22-23]。實(shí)驗(yàn)研究表明，將葉酸摻入HKUST-1可使銅離子緩慢釋放，從而降低細(xì)胞毒性，增強(qiáng)細(xì)胞體外遷移[24]。

SLC31A1、DBT是與銅死亡相關(guān)的基因，研究發(fā)現(xiàn)銅可通過單獨(dú)或與配體結(jié)合促進(jìn)血管生成從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移[16]。銅參與多種細(xì)胞過程，包括線粒體呼吸、抗氧化劑防御、氧化還原信號(hào)、激酶信號(hào)、自噬和蛋白質(zhì)質(zhì)量控制[17]。銅過量易導(dǎo)致細(xì)胞毒性，在生理濃度下細(xì)胞對(duì)銅離子的敏感性更高，各種金屬離子能以獨(dú)立的凋亡方式引發(fā)細(xì)胞死亡，如磷脂過氧化引發(fā)的鐵中毒[14，17]。銅可被溶質(zhì)載體家族31號(hào)成員1基因跨膜銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC31A1吸收，再由超氧化物歧化酶（CCS）的銅伴侶傳遞給SOD1，發(fā)揮抗氧化作用[17，25]。SLC31A1是主要的銅流入轉(zhuǎn)運(yùn)體，其表達(dá)的變化能夠誘發(fā)細(xì)胞銅積累的改變，而降低SLC31A1的表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞的增殖[26-28]。因此，SLC31A1是癌癥診斷和治療值得注意的基因。DBT是哺乳動(dòng)物激酶CKIε和CKIδ的同源激酶[29]，也是時(shí)鐘基因之一，參與許多不同的功能，包括晝夜節(jié)律、平面細(xì)胞極性、程序性細(xì)胞死亡和生長(zhǎng)等。DBT通過阻滯G2/M期細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡來抑制HepG2細(xì)胞的增殖[30]。因此，葉酸與白藜蘆醇可能通過促進(jìn)DBT的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的銅離子的釋放，降低SLC31A1的表達(dá)抑制癌細(xì)胞的增殖。

本研究為進(jìn)一步了解銅死亡相關(guān)基因SLC31A1、DBT與HCC進(jìn)程的相關(guān)性提供了初步依據(jù)，同時(shí)進(jìn)行了與之對(duì)應(yīng)的活性成分篩選，為HCC提供了新的診療思路，但其具體的生物學(xué)作用及機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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