劉鼎++++++劉建生

[摘要] 目的 檢測Rab27A與Rab27B在3種人肝癌細(xì)胞系及1種永生化肝細(xì)胞系中的表達(dá)情況，初步研究Rab27A與Rab27B表達(dá)對肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。 方法 采用RT-PCR及Western blot技術(shù)，檢測Rab27A與Rab27B mRNA在3種人肝癌癌細(xì)胞HepG2、Huh-7、Li-7及1種永生化肝細(xì)胞系HL-7702中的表達(dá)。 結(jié)果 Rab27A與Rab27B在肝癌細(xì)胞系及原發(fā)性肝癌組織中存在差異性表達(dá)。Rab27A mRNA在3種人肝癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯強(qiáng)于1種人永生化肝細(xì)胞系；Rab27B mRNA在3種人肝癌及1種人永生化肝細(xì)胞系中均明顯表達(dá)但無顯著差異。 結(jié)論 Rab27A與Rab27B與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)，可以為臨床采取合理診斷措施提供有效的參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] Rab27A；Rab27B；肝細(xì)胞癌；RT-PCR；Western blot

[中圖分類號] R735 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）06（a）-0004-04

Expression of Rab27A and Rab27B in the four different hepatocellular carcinoma

LIU Ding LIU Jian-sheng▲

The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of Rab27A and Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line and its effect on biology characteristics of the cells. Methods The mRNA expression of Rab27A and Rab27B was detected by RT-PCR，and Western-blot in 3 human HCC lines of HepG2，Huh-7，Li-7 and the immortalized hepatic cell line of HL-7702. Results Rab27A and Rab27B were differentially expressed in cell lines and primary HCC tumors.The expression of Rab27A in 3 human HCC line was significantly better than that expressed in the immortalized hepatic cell line；the mRNA of Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line were significantly expression but there was no significantly difference. Conclusion Rab27A and Rab27B expression are closely correlated HCC，it can provide the clinical reasonable diagnostic measures as valuable effective reference basis.

[Key words] Rab27A；Rab27B；Hepatocellular carcinoma；RT-PCR；Western blot

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，具有極高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，出現(xiàn)典型癥狀時，往往已經(jīng)為晚期。目前與HCC進(jìn)展相關(guān)的因子包括癌胚抗原（CEA）、糖類抗原（CA199）、異常凝血酶原（DCP）等，同時Rab家族被證實(shí)與腫瘤密切相關(guān)。本文采用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測了Rab27A與Rab27B在3種人肝癌細(xì)胞系及1種永生化肝細(xì)胞系中的表達(dá)情況，以期進(jìn)一步研究其對肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為原發(fā)性肝癌的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

3種人肝癌細(xì)胞HepG2、Huh-7、Li-7及1種永生化肝細(xì)胞系HL-7702均采購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，并按照其建議的方法進(jìn)行培養(yǎng)。20%胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)液購自GIBCO公司，DEPC購自Sigma公司，ECL顯色試劑盒購自Thermo-fisher公司，NC膜購自Amersham公司，引物、Rab27A兔多抗、Rab27B羊多抗、HRP標(biāo)記驢抗兔IgG、β-actin購自生工生物工程公司，Trizol、Taq PCR試劑盒購自TaKara公司，PCR反應(yīng)儀采用Thermocycler（Biometra Germany公司），Alphaimager 2200分析儀（Alpha Innotech，San Leandro，CA公司），其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 各種細(xì)胞均按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)，傳代時用2.5 g/L的胰蛋白酶消化， 按1∶3的比例傳代。取生長狀態(tài)良好、密度80%～90%的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR Rab27A基因引物F：5′-AACCGCCACAGTCTTCAATC-3′，R：5′-TCCCTGACCCTTCAAT-CAAC-3′；Rab27B基因引物F：5′-CCCTAAAAATCCCAGTCCATC-3′，R：5′-GAGCATCCCAGAGGAAACAC-3′。反應(yīng)過程如下：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，最后72℃終延伸5 min，β-actin作為內(nèi)參，擴(kuò)增30個循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。隨后對細(xì)胞系中的Rab27A與Rab27B mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行全定量PCR。

1.2.3 Western blot SDS-PAGE分離蛋白，每個樣品的上樣量為50 μg，電轉(zhuǎn)至NC膜。5%脫脂牛奶4℃封閉1 h，孵育一抗Rab27A（1∶1000稀釋）或Rab27B（1∶1200稀釋），4℃過夜。倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10 min。加入相應(yīng)種屬的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液（1∶10 000稀釋），搖床上緩慢搖動，37℃ 2 h。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液濾膜3次，每次10 min。最后采用ECL試劑盒顯影，定影，觀察雜交信號。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過采用RT-PCR、Western blot分析了3種人肝癌及1種人永生化肝細(xì)胞系中Rab27A及Rab27B mRNA及蛋白表達(dá)情況。β-actin內(nèi)參條帶在205 bp處皆顯現(xiàn)明亮且無明顯差異，Rab27A mRNA在357 bp處3種人肝癌細(xì)胞系中明顯亮于1種人永生化肝細(xì)胞系；Rab27B mRNA在302 bp處均出現(xiàn)目的條帶，且條帶清晰；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明Rab27A mRNA在3種人肝癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯強(qiáng)于1種人永生化肝細(xì)胞系；Rab27B mRNA在3種人肝癌及1種人永生化肝細(xì)胞系中均明顯表達(dá)但無顯著差異（圖1）。其中，β-actin作為內(nèi)參。

A

3 討論

HCC是一種嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤，發(fā)生率位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第5位，死亡率位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第3位，全球每年死于HCC患者人數(shù)高達(dá)69.6萬，其中超過50%的肝癌新發(fā)患者與死亡患者來自中國[1-2]。HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移過程涉及到腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲等過程，而這一過程正是通過多種因子間的相互協(xié)調(diào)來實(shí)現(xiàn)。2013年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎表彰詹姆斯·羅思曼等人發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制，表明細(xì)胞膜的分裂與囊泡運(yùn)輸時細(xì)胞膜裂解是一致的。細(xì)胞的生命活動依賴于細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸體系的精細(xì)結(jié)構(gòu)和控制結(jié)構(gòu)，通過與目標(biāo)細(xì)胞膜融合，在神經(jīng)細(xì)胞指令下可精確控制激素、生物酶、神經(jīng)遞質(zhì)等分子傳遞的恰當(dāng)時間與位置。RabGTP酶類作為機(jī)體內(nèi)一組與內(nèi)膜運(yùn)輸相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，可以作為囊泡運(yùn)輸?shù)姆肿娱_關(guān)，與GTP結(jié)合則有活性，與GDP結(jié)合則無活性，通過與上游調(diào)控因子和下游特異效應(yīng)因子相互作用，影響細(xì)胞的分泌、胞吞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及發(fā)育，并可以控制膜結(jié)構(gòu)的一致性和囊泡的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附、錨定、融合等過程，從而發(fā)揮重要的作用[3-4]。

人類Rab蛋白廣泛分布于各種生物細(xì)胞內(nèi)不同的膜結(jié)構(gòu)上，是小分子GTP結(jié)合蛋白家族中最大的亞家族，包括超過60個成員組成，可以通過不同的可變剪切形式而產(chǎn)生各種功能特異的亞型[5-6]。Rab家族可以通過特異性地定位于胞質(zhì)中某些亞細(xì)胞器從而發(fā)揮特殊的功能，而抑制其中一些蛋白的表達(dá)，細(xì)胞膜的裂解次數(shù)可明顯減少[7]。Rab27亞家族包括Rab27A與Rab27B，兩者是具有71%同源性的小GTP 酶（20～29 kD），可以通過影響囊泡運(yùn)輸物質(zhì)來抑制機(jī)體免疫監(jiān)視功能，并為腫瘤細(xì)胞提供理想的生存環(huán)境，促進(jìn)血管生成及腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移[8]。Rab27A在人類染色體位點(diǎn)15q15-21.1，調(diào)節(jié)因子有3種：Rab親和蛋白，Slac2和Muncl3-4，功能主要為特異性地調(diào)節(jié)囊泡出胞過程，促進(jìn)囊泡與細(xì)胞膜融合，并且激活溶酶體，促進(jìn)細(xì)胞膜裂解[9]。Rab27A參與細(xì)胞色素顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)，若表達(dá)缺失會導(dǎo)致色素沉著消失和黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)功能缺陷，從而導(dǎo)致一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病——格里塞利綜合征（GS）[10-11]。Rab27A通過與Melanophilin和肌漿球蛋白Ⅴa共同形成一個三元復(fù)合體，參與粗細(xì)肌絲的滑行運(yùn)動，因此有學(xué)者認(rèn)為Rab27A具有肌球蛋白受體的全部或部分功能[12]。研究表明Rab27A可以通過調(diào)節(jié)VEGF、cyclin D1、IGF-2、MMP-9、MMP-7和p16蛋白的表達(dá)，從而在腫瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮促進(jìn)作用[13]。Rab27B位于18號染色體上，調(diào)節(jié)因子有3種：突出結(jié)合蛋白4（Slp4），Slac2b和Noc2，功能主要為參與大多數(shù)分泌性細(xì)胞的胞吐作用及運(yùn)輸過程，促進(jìn)囊泡物質(zhì)由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜區(qū)域運(yùn)動，在腦垂體、腮腺腺泡細(xì)胞、胰腺腺泡細(xì)胞的胞吐作用及血小板致密核心顆粒的分泌中有重要的調(diào)節(jié)作用[14-16]。有研究表明，抑制uPA和HGF的胞外水平的表達(dá)，HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移能力均顯著下降。

近來研究發(fā)現(xiàn)，Rab27A與乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；Rab27B表達(dá)于乳腺、肝臟、胃、大腸、脾、眼、心臟、腎臟等多種腫瘤細(xì)胞[16-20]。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR及Western blot技術(shù)，檢測Rab27A與Rab27B mRNA在3種人肝癌細(xì)胞HepG2、Huh-7、Li-7及1種永生化肝細(xì)胞系HL-7702中的表達(dá)，筆者發(fā)現(xiàn)，Rab27A與Rab27B在肝癌細(xì)胞系及原發(fā)性肝癌組織中存在差異性表達(dá)，Rab27A mRNA在3種人肝癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯強(qiáng)于1種人永生化肝細(xì)胞系；Rab27B mRNA在3種人肝癌及1種人永生化肝細(xì)胞系中均明顯表達(dá)但無顯著差別。因此，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Rab27A與Rab27B與HCC密切相關(guān)，可以為臨床采取合理診斷措施提供有效的參考依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（4）：212-236.

[2] Seabra MC，Mules EH，Hume AN.Rab GTPases，intracellular traffic and disease[J].Trends Mole Med，2002，8（1）：23-30.

[3] Crighton D，Wilkinson S，O′fPrey J，et al.DRAM，a p53-induced modulator of autophagy，is critical for apoptesis[J].J Cell，2006，126（1）：121-134.

[4] Stenmark H.Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic[J].Mole Cell Biol，2009，10（8）：513-525.

[5] Schwartz SL，Cao C，Pylypenko O，et al.Rab GTPases at a glance[J].Cell Sci，2007，120（22）：3905-3910.

[6] Zerial M，McBride H.Rab proteins as membrane organizers[J].Mole Cell Biol，2001，2（2）：107-117.

[7] Ostrowski M，Carmo NB，Krumeich S，et al.Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretion pathway[J].Nat Cell Biol，2010，12（1）：19-30.

[8] Pereira-Leal JB，Seabra MC.Evolution of the Rab family of small GTP-binding proteins[J].J Mole Biol，2001，313（4）：889-901.

[9] Raposo G，Tenza D，Murphy DM，et al.Distinct protein sorting and localization to premelanosomes，melanosomes，and lysosomes in pigmented melanocytic cell[J].J Cell Biol，2001，152（4）：809-824.

[10] Menasche G，Pastural E，F(xiàn)eldmann J，et al.Mutations in RAB27A cause griscelli syndrome associated with haemo-phagocytic syndrome[J].Nat Gene，2000，25（2）：173-176.

[11] Tolmachova T，Ramalho JS，Anant JS，et al.Cloning，mapping and characterization of the human RAB27A gene[J].J Gene，1999，239（1）：109-116.

[12] Hayasaka S，Terada Y，Suzuki K，et al.Intramanchette transport during primate spermiogenesis：expression of dynein，myosin Ⅴa，motor recruiter myosin Ⅴa，Ⅶa-Rab27a/b interacting protein，and Rab27b in the manchette during human and monkey spermiogenesis[J].Asian J Androl，2008， 10（4）：561-568.

[13] 龐達(dá)，王勁松，張國強(qiáng)，等.Rab27A促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2008， 18（4），305-308.

[14] 齊菲菲，賀福初，姜穎.腫瘤轉(zhuǎn)移的研究現(xiàn)狀與趨勢[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36（10）：1244-1251.

[15] Chen Y，Guo X，Deng FM，et al.Rab27b is associated with fusiform vesicles and may be involved in targeting uroplakins to urothelial apical membranes[J].Proce Nat Acad Sci，2003，100（24）：14012-14017.

[16] Shirakawa R，Higashi T，Tabuchi A，et al. Munc13-4 is a GTP-Rab27-binding protein regulating dense core granule secretion in platelets[J].J Biol Chem，2004，279（11）：10730-10737.

[17] Wang JS，Wang FB，Zhang QG，et al. Enhanced expression of Rab27A gene by breast cancer cells promoting invasiveness and the metastasis potential by secretion of insulin-like growth factor-Ⅱ[J].Mole Cancer Res，2008， 6（3）：372-382.

[18] Wu X，Hu A，Zhang M，et al. Effects of Rab27a on proliferation，invasion，and anti-apoptosis in human glioma cell[J].Tumor Biol，2013，34（4）：2195-2203.

[19] Johnson JL，Brzezinska AA，Tolmachova T，et al.Rab27a and Rab27b regulate neutrophil azurophilic granule exocytosis and NADPH oxidase activity by independent mechanisms[J].Traffic，2010，11（4）：533-547.

[20] Li W，Mu D，Tian F，et al. Exosomes derived from RAB27A-overexpressing tumor cells elicit efficient induction of antitumor immunity[J].Mole Med Rep，2013，8（6）：1876-1882.

（收稿日期：2015-01-30 本文編輯：衛(wèi) 軻）