吳永昊 謝和兵 侯海榮 王榮春 陳錫強(qiáng)

摘要：探討藏藥復(fù)方肺熱普清散對(duì)低氧環(huán)境下斑馬魚(yú)模型的保護(hù)作用及其對(duì)低氧誘導(dǎo)因子1α（Hif1α）的影響。建立斑馬魚(yú)低氧運(yùn)動(dòng)損傷模型，分別檢測(cè)低氧條件下斑馬魚(yú)行為學(xué)和整體乳酸水平，以受精后72 h AB型斑馬魚(yú)幼魚(yú)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，空白對(duì)照組采用正常溶氧100%（8.4 mg/L），低氧組采用純氮?dú)庵脫Q獲得溶氧50%（4.2 mg/L）培養(yǎng)水，50%低氧水加不同濃度肺熱普清散處理胚胎24 h。采用斑馬魚(yú)行為學(xué)分析儀記錄30 min游泳軌跡，使用Zeblab軟件導(dǎo)出30 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間；分別對(duì)實(shí)驗(yàn)后各組斑馬魚(yú)進(jìn)行整體勻漿并測(cè)定組織乳酸含量和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）活力；利用蛋白印跡（western blot， WB）分析各組斑馬魚(yú)Hif1α的表達(dá)水平變化；使用免疫組織化學(xué)方法對(duì)各組魚(yú)尾鰭部Hif1α表達(dá)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，與低氧對(duì)照組比較，肺熱普清散 10～30 mg/L劑量組可顯著增加低氧誘導(dǎo)引起的運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間（p＜0.05），并且相對(duì)于低氧引起的乳酸升高（p＜0.001）， 10～30 mg/L組的乳酸含量明顯降低（p＜0.05）；同時(shí)LDH與低氧組活力比較，肺熱普清散30 mg/L組可顯著降低LDH活力（p＜0.05）；WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與低氧組比較，肺熱普清散可抑制Hif1α表達(dá)（p＜0.05）；同時(shí)免疫組化結(jié)果顯示10 mg/L 肺熱普清散可減少Hif1α表達(dá)。由此肺熱普清散對(duì)急性斑馬魚(yú)低氧損傷模型引起的運(yùn)動(dòng)損傷有保護(hù)作用，其耐低氧機(jī)制與Hif1α表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肺熱普清散；斑馬魚(yú)；低氧；運(yùn)動(dòng)損傷；低氧誘導(dǎo)因子1α

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1002-4026（2024）01-0032-07

Protective effect of Feirepuqing Powder on hypoxia-induced sports injury in zebrafish model by inhibiting Hif1α

Abstract∶This study aimed to investigate the protective effects of the Tibetan medicinal compound Feirepuqing Powder on a zebrafish model in a hypoxic environment and its effect on the hypoxia-inducible factor 1α （Hif1α）. Through establishing a zebrafish hypoxic injury model， behavioral and overall lactate changes under hypoxic conditions were investigated. Experiments were conducted using AB zebrafish larvae 72 h after fertilization. In the control group， 100% standard dissolved oxygen （8.4 mg/L） was used， while in the hypoxia group， pure nitrogen （N2） gas replacement was used to obtain 50% dissolved oxygen （4.2 mg/L） culture water， and the embryos were treated with 50% hypoxic water add different concentrations of Feirepuqing Powder for 24 h. The zebrafish behavioral analyzer was used to record the swimming trajectory for 30 min， and the Zeblab software was used to derive the movement distance and time during the 30 min. Following the experiment， all the zebrafish from both the groups were homogenized and the lactic acid and lactate dehydrogenase （LDH） content in their tissue were determined. The changes in the Hif1α expression level of the zebrafish in each group were analyzed via western blot （WB） analysis， and the expression of Hif1α in the caudal fin of each group of fish was compared using immunohistochemistry. The results revealed that compared with the hypoxic control group， 10 to 30 mg/L Feirepuqing Powder group significantly increased the hypoxia-induced exercise distance and exercise time （‘p<0.05）， and relative to the hypoxia-induced lactic acid increase （‘p<0.001）， the lactic acid content of the 30 mg/L Feirepuqing Powder group significantly reduced. When LDH activity was compared with that of the hypoxic group， LDH activity was significantly reduced in the 30 mg/L Feirepuqing Powder group （‘p<0.05）. The WB results revealed that when compared with the hypoxia group， Feirepuqing Powder inhibited the expression of Hif1α （‘p<0.05）. Finally， the immunohistochemical results showed that 10 mg/L of Feirepuqing Powder reduced the expression of Hif1α. The results of this study show that Feirepuqing Powder exhibits a protective effect on induced exercise injuries in an acute zebrafish hypoxic injury model and that its hypoxia-tolerance mechanism is related to the expression of Hif1α.

Key words∶Feirepuqing Powder; zebrafish; hypoxia; exercise injuries; hypoxia-inducible factor 1α

高原病又稱(chēng)高山病，是在高海拔地區(qū)活動(dòng)引發(fā)的主要以缺氧為主的一組疾病，病變涉及呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)等。該類(lèi)疾病具有廣泛性和突發(fā)性的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人們的生命健康，因此針對(duì)急、慢性高原病的致病機(jī)理研究和藥物研發(fā)亟待開(kāi)展。高原病的發(fā)生與低氧條件下糖代謝異常密切相關(guān)，始于糖酵解的啟動(dòng)，此過(guò)程組織中會(huì)積累大量乳酸，除了會(huì)影響運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)功能外，還會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生多種活性氧（reactive oxygen species，ROS），過(guò)量的ROS損害機(jī)體細(xì)胞和功能，引起炎癥因子并促進(jìn)其釋放，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子家族（hypoxia inducible factor，Hif）受到刺激開(kāi)始表達(dá)[1-3]，其中Hif1α是低氧誘導(dǎo)損傷引起的低氧調(diào)控的關(guān)鍵因子[4-5]。斑馬魚(yú)模型是近年藥物篩選應(yīng)用中常用的動(dòng)物模型，基于遺傳學(xué)和器官發(fā)育的研究成果，該模型在藥物低氧的保護(hù)作用評(píng)價(jià)中也有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，利用低含氧的培養(yǎng)水可以復(fù)制魚(yú)缺氧反應(yīng)，低氧刺激在行為學(xué)和分子機(jī)制方面都與哺乳動(dòng)物類(lèi)似，近年來(lái)借助斑馬魚(yú)低氧模型針對(duì)相關(guān)疾病機(jī)理和信號(hào)通路的研究已有報(bào)道[6-7]。

高原病屬于疑難病之一，對(duì)癥治療是目前的首選治療手段，針對(duì)高原病的特效藥物仍然處于空白，因而針對(duì)高原病的藥物研發(fā)是大健康的重要議題。藏藥是我國(guó)民族醫(yī)藥重要的組成部分，在臨床上有百年的應(yīng)用歷史，在高原地區(qū)患者中得到廣泛認(rèn)可，但針對(duì)藏藥復(fù)方的現(xiàn)代藥學(xué)系統(tǒng)性研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，其作用機(jī)制和相關(guān)的藥效學(xué)研究尚處于起步階段。肺熱普清散是收錄于藏醫(yī)學(xué)《四部醫(yī)典》中的效驗(yàn)方，在小兒難治性肺炎的治療中有較佳效果[8]。肺熱普清散具有經(jīng)典藏藥組方特點(diǎn)，主藥包含多種芳香性中藥，其中紅花、檀香、丁香、降香、木香等為主要成分，共同發(fā)揮清肺泄熱的功效，較早的研究發(fā)現(xiàn)該復(fù)方具有較強(qiáng)的抗炎作用[9]。臨床報(bào)道證明其對(duì)高原地區(qū)的支氣管和肺部感染有明確療效[10]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)該復(fù)方中多個(gè)成分具有抗ROS活性：紅花黃色素、檀香油、降香黃酮具有顯著的抗氧化應(yīng)激和抗炎的活性[11-13]；而丁香的主要成分丁香酚不僅具有抗菌的作用，而且有較強(qiáng)抗氧化和抗炎的活性；木香的水提物研究發(fā)現(xiàn)可顯著恢復(fù)心肌乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性，復(fù)方整體顯示出較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激作用[14]。

本研究利用斑馬魚(yú)低氧損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢?duì)肺熱普清散在低氧損害保護(hù)中的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，并考察其對(duì)低氧誘導(dǎo)Hif1α的表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

肺熱普清散由西藏神猴藥業(yè)有限公司提供（國(guó)藥準(zhǔn)字Z54020045， 批號(hào)20210601），取原藥粉末制成100 g/L母液，有微量沉淀，置于4 ℃保存，用前混勻。

鏈霉蛋白酶E（Pronase E，脫膜劑）和胚胎麻醉劑MS222購(gòu)自北京索萊寶公司，Multiskan FC型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Hif1α 一抗和GAPDH一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司，乳酸ELISA法試劑盒（D799851）和LDH測(cè)定試劑盒（BL853B）分別購(gòu)自碧云天公司和賽國(guó)生物科技公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰凈化消毒設(shè)備廠， IX51倒置顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯（日本），DYY-6D電泳儀和DYZC-24C轉(zhuǎn)印電泳儀購(gòu)自北京六一公司，LiCOR-odyssey 400化學(xué)成像儀購(gòu)自美國(guó)Genetech 公司，Zebrabox斑馬魚(yú)行為分析儀購(gòu)自法國(guó)Viewpoint公司，斑馬魚(yú)養(yǎng)殖飼養(yǎng)系統(tǒng)購(gòu)自北京愛(ài)生科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所選斑馬魚(yú)野生型AB系由山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選平臺(tái)提供，培養(yǎng)方法按照《斑馬魚(yú)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》操作[15]， 實(shí)驗(yàn)所用為斑馬魚(yú)受精后72 h胚胎，受精24 h使用1.0 g/L Pronase E溶液脫去卵膜。在體視顯微鏡下挑選正常的斑馬魚(yú)胚胎，移入24孔培養(yǎng)板中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)山東省科學(xué)院生物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查，審查批件號(hào)為SDSW20220606。

1.3 藥物處理和行為學(xué)方法

挑選健康A(chǔ)B系斑馬魚(yú)幼魚(yú)，隨機(jī)分為6組，每組60條，分為常氧組、低氧組、低氧加肺熱普清散多劑量組。常氧組為非密閉容器處理（8.4 mg/L）；低氧組的低氧水用純氮?dú)馔ㄟ^(guò)管道持續(xù)輸入常規(guī)培養(yǎng)水中制得，使用溶氧儀監(jiān)控水中氧含量達(dá)到50%（4.2 mg/L），低氧組將低氧水和幼魚(yú)置于密封瓶中；將肺熱普清散樣品（質(zhì)量濃度分為1、3、10、30 mg/L等4組）與[JP2]斑馬魚(yú)幼魚(yú)置于密封瓶中，28 ℃處理24 h。行為學(xué)分析采用低氧水幼魚(yú)于24孔板中，每孔1條，放入斑馬魚(yú)行為學(xué)分析系統(tǒng)的暗箱中，使用Zeblab軟件分別采集30 min內(nèi)各組幼魚(yú)的運(yùn)動(dòng)軌跡，利用軟件導(dǎo)出游行距離和時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.4 斑馬魚(yú)整體乳酸和LDH測(cè)定方法

乳酸測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法按照?qǐng)?bào)道的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行[16]，將實(shí)驗(yàn)后的幼魚(yú)，按照每組6個(gè)樣本，每個(gè)樣本取自10條幼魚(yú)，每個(gè)樣本麻醉后冰上進(jìn)行勻漿，乳酸測(cè)定方法按照試劑盒要求按步驟進(jìn)行，勻漿后收集上清液，依次制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，利用酶標(biāo)儀在570 nm條件下通過(guò)吸光度測(cè)定樣品乳酸濃度。LDH測(cè)定方法按照各組取得30 mg幼魚(yú)組織，冰上勻漿，8 000 r/min離心，取上清，按照測(cè)定試劑盒步驟操作，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算LDH的活性。

1.5 蛋白印跡（western blot， WB）分析實(shí)驗(yàn)

WB的實(shí)驗(yàn)操作流程按照已報(bào)道方法進(jìn)行[17]，簡(jiǎn)略過(guò)程如下：實(shí)驗(yàn)后每組30條斑馬魚(yú)幼魚(yú)麻醉后進(jìn)行冰上勻漿，用冷組織裂解液提取蛋白，使用SDS-PAGE電泳技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)樣本分離，隨后濕法轉(zhuǎn)膜至NC膜，一級(jí)抗體（Hif1α）和二級(jí)抗體分別進(jìn)行1：1 000和1：10 000的稀釋孵育，化學(xué)發(fā)光成像選用LiCOR-odyssey 400化學(xué)成像儀（美國(guó)基因公司）顯影，利用機(jī)帶軟件Image studio1.0進(jìn)行灰度分析。

1.6 免疫組化實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)后斑馬魚(yú)胚胎用PBS清洗2次，麻醉后放置于冰上處死，加入4%多聚甲醛過(guò)夜，用常規(guī)PBST-乙醇梯度脫水，然后用冷丙酮處理20 min，清洗后加3%馬血清封閉2 h，更換封閉液，加入Hif1α一抗（1：200），置于4 ℃過(guò)夜，換為熒光二抗（Alexa Fluor@488）4 ℃過(guò)夜， 熒光顯微鏡下觀察拍照，利用Image J軟件將照片改為灰色背景。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行組間ｔ檢驗(yàn)， 多個(gè)樣本均值比較采用單因素方差（anova）分析，各組數(shù)據(jù)以均值 ‘x±s表示，p＜0.05為顯著性差異，p＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 肺熱普清散對(duì)低氧斑馬魚(yú)模型行為學(xué)的影響

本實(shí)驗(yàn)共6組，按照每組8條置于24孔板中，每孔1條，同時(shí)進(jìn)行軌跡記錄見(jiàn)圖1。低氧處理后行為學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：30 min內(nèi)常氧對(duì)照組的運(yùn)動(dòng)不受影響，運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間均值分別達(dá)到了13.08 cm和11.97 min；低氧組的運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間均顯著下降， 均值分別為2.14 cm和3.78 min，與常氧組比較具有顯著性差異（p＜0.001）；低劑量肺熱普清散組與低氧組比較無(wú)顯著性差異；30 mg/L 肺熱普清散組較低氧組運(yùn)動(dòng)時(shí)間有明顯增強(qiáng)，運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間均值分別達(dá)到了6.47 cm和7.86 min（p＜0.05）（表1）。

2.2 肺熱普清散對(duì)低氧誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)損傷后斑馬魚(yú)整體乳酸水平和LDH活性的影響

本實(shí)驗(yàn)包含6個(gè)組，每組6個(gè)樣本，單一樣本取自10條幼魚(yú)。以受精后72 h的斑馬魚(yú)幼魚(yú)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，常氧組乳酸均值為0.35 μmol/L，用低氧培養(yǎng)水造模處理后，可以造成斑馬魚(yú)幼魚(yú)活動(dòng)減少，乳酸的濃度會(huì)顯著增高，達(dá)到0.89 μmol/L 左右，與常氧組比較具有顯著性差異（p＜0.001）；同時(shí)LDH活性也呈現(xiàn)同樣的升高變化，常氧組與低氧組比較具有顯著性差異（p＜0.005）。用藥組結(jié)果表明：處理24 h后，用藥組乳酸均值均有降低，與低氧組相比，經(jīng)肺熱普清散10 mg/L和30 mg/L處理后，整體乳酸水平明顯下降且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），具有劑量依賴(lài)性的傾向（數(shù)據(jù)見(jiàn)表2）。LDH活力的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示高濃度肺熱普清散與低氧組比較具有顯著性差異（p＜0.05），如圖2所示。

2.3 肺熱普清散對(duì)斑馬魚(yú)Hif1α蛋白表達(dá)水平的影響

斑馬魚(yú)整體WB結(jié)果顯示，低氧處理后Hif1α蛋白水平與常氧對(duì)照組比較呈現(xiàn)增高現(xiàn)象，肺熱普清散低劑量組（1、3 mg/L）Hif1α未出現(xiàn)明顯變化，而高劑量組（10、30 mg/L）可有效降低Hif1α表達(dá)水平，其中10 mg/L組抑制Hif1α表達(dá)具有極顯著意義（p＜0.01），說(shuō)明肺熱普清散對(duì)該模型的Hif1α表達(dá)水平有抑制作用（圖3）。

2.4 肺熱普清散對(duì)斑馬魚(yú)Hif1α免疫組化結(jié)果

免疫組化處理后的斑馬魚(yú)全身都有熒光點(diǎn)分布，本研究以魚(yú)尾部位作為觀察部位，對(duì)照組僅能見(jiàn)到少量白色熒光小點(diǎn)，而低氧處理后無(wú)論是軀干部位還是魚(yú)鰭白色熒光點(diǎn)明顯增加（圖4白色箭頭指示）；經(jīng)過(guò)10 mg/L 肺熱普清散處理后的相同部位熒光點(diǎn)減少，表明經(jīng)過(guò)肺熱普清散處理可減少低氧條件下的Hif1α表達(dá)水平（圖4）。

3 討論與結(jié)論

普通人在高原地區(qū)活動(dòng)都會(huì)受到高原低氧的影響，運(yùn)動(dòng)能力下降是低氧環(huán)境下的機(jī)體反應(yīng)，同時(shí)低氧因素和糖酵解過(guò)程共同作用產(chǎn)生的乳酸在肌肉組織中積累，加重了運(yùn)動(dòng)障礙。本研究中低氧組的斑馬魚(yú)普遍出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)距離和運(yùn)動(dòng)時(shí)間縮短的情況，提示其運(yùn)動(dòng)能力顯著性下降，同時(shí)伴隨組織乳酸水平和LDH活性的升高?；诒緦?shí)驗(yàn)中低氧誘導(dǎo)下斑馬魚(yú)行為學(xué)的典型變化，利用該模型運(yùn)動(dòng)能力（時(shí)間和距離）可量化的優(yōu)勢(shì)，評(píng)價(jià)肺熱普清散的耐低氧能力，結(jié)果表明肺熱普清散不僅能夠提升低氧處理后的運(yùn)動(dòng)能力，同時(shí)對(duì)低氧引起的乳酸水平和LDH活性增加均有顯著性的逆轉(zhuǎn)作用，提示肺熱普清散對(duì)于低氧引起的運(yùn)動(dòng)損傷具有提高缺氧耐受的作用，對(duì)于急性低氧損害引起的運(yùn)動(dòng)障礙有明顯的改善作用。

低氧環(huán)境不僅引起機(jī)體血氧含量降低和糖代謝紊亂，以低氧-乳酸軸激活為特征的廣泛繼發(fā)反應(yīng)更為有害，同時(shí)低氧參與到了包括腫瘤、感染、局部缺血和炎癥等多個(gè)疾病過(guò)程中[18-19]。Hif1α是感知低氧和維持細(xì)胞氧內(nèi)環(huán)境平衡的核心調(diào)節(jié)因子，常氧時(shí)會(huì)與VHL（Von Hippel-Lindau）蛋白結(jié)合并降解，幾乎檢測(cè)不到[20]；低氧條件下其高表達(dá)，作為最重要低氧耐受的關(guān)鍵樞紐性因子，其會(huì)調(diào)控下游的多個(gè)靶基因的表達(dá)水平，同時(shí)伴行病理性變化[21-22]。研究表明低氧刺激斑馬魚(yú)模型的通路多個(gè)基因具有較高保守性，與哺乳動(dòng)物的表型相近[4， 23-24]。在本研究中經(jīng)過(guò)低氧聯(lián)合肺熱普清散處理后，Hif1α的表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明減少Hif1α表達(dá)是肺熱普清散的耐缺氧調(diào)節(jié)的作用靶點(diǎn)之一，這種作用是直接作用還是間接影響尚需要深入的研究。動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)氧氣的感知和反應(yīng)是能量代謝中的基礎(chǔ)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程，低氧因子的升高并不是高原病的專(zhuān)屬現(xiàn)象，低氧相關(guān)因子也參與了包括癌癥、炎癥以及血細(xì)胞發(fā)生等過(guò)程[25]，本研究揭示肺熱普清散的低氧保護(hù)作用與抑制Hif1α的表達(dá)有關(guān)，并且可以推測(cè)該復(fù)方在癌癥和炎癥等疾病中可能的應(yīng)用前景。

本研究首次對(duì)傳統(tǒng)藏藥名方肺熱普清散進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，提示其具有顯著的低氧運(yùn)動(dòng)損傷保護(hù)作用，并對(duì)相關(guān)的Hif1α具有顯著的抑制作用。同時(shí)對(duì)肺熱普清散的藥用機(jī)制進(jìn)行了初步探索，也為該類(lèi)復(fù)方二次開(kāi)發(fā)積累了必需的藥理學(xué)數(shù)據(jù)。

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