李耀利,徐風,葉敏,喬雪

北京大學藥學院 (北京 100191)

生藥學是應用植物學、植物化學、藥物分析學、藥理學等學科理論知識和現(xiàn)代技術來研究生藥的基原鑒定、采收加工、活性成分、藥理作用、品質評價及資源利用等問題的一門學科[1-2]。生藥學實驗課程主要內容包括藥材或飲片的性狀觀察、顯微鑒定和顯微化學反應、生藥理化鑒定和生藥分子鑒定等部分,是培養(yǎng)學生掌握生藥學基本方法和實驗操作技能、鞏固和加深理解理論知識的重要實踐教學環(huán)節(jié)。

近年來,不少院校建立了生藥學顯微數(shù)碼互動實驗室。教學組在設立生藥學顯微數(shù)碼互動實驗室基礎上,改進了實驗教學方法,優(yōu)化了教學內容,提高了實驗教學質量,提升了學生的綜合實驗能力[3]。筆者通過實驗教學實例,介紹近幾年來在實際教學工作引入冷凍切片和數(shù)字切片的經(jīng)驗,以期能夠拋磚引玉,促進高校生藥學實驗教學的發(fā)展。

1 冷凍切片在生藥學實驗課程中的應用

顯微鑒定部分是生藥學實驗課程主要內容之一。顯微鑒定是利用顯微鏡來觀察生藥的組織構造、細胞形態(tài)及其后含物等特征進行生藥真實性鑒定的方法。顯微鑒定的第一步是根據(jù)觀察對象和目的的不同制作合適的顯微標本片,可分為粉末標本片、切片標本片、表面標本片和解離組織標本片等。

切片標本片的制作是將生藥切成極薄的橫切片或縱切片。藥檢部門實際工作中多用徒手切片法,即直接手拿刀片將材料切成薄片的一種方法。徒手切片法操作簡便迅速,但在實驗課程中由于學生缺乏經(jīng)驗,切片不易完整、薄厚不夠均勻,并且存在安全隱患。

冷凍切片法是在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度,然后使用切片機進行切片的一種方法,多用于醫(yī)療和科學研究,尤其臨床手術中快速病理診斷多用此法。該法只需在切片前使用OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)或膠水等將組織包埋在樣品托上,較傳統(tǒng)的石蠟切片法更加簡便和快捷。近年來,冷凍切片法越來越多地用于植物和生藥材料,特別適用于柔軟、含多量薄壁組織、含水量多的材料。

小茴香為傘形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥成熟果實。小茴香藥食同源,一直作為果實類生藥的代表被選入本校生藥學實驗課。實驗目的主要是讓學生掌握小茴香的性狀和顯微特征,包括橫切面組織構造特征、粉末特征和油管解離特征、顯微化學反應等,尤其是來源于傘形科植物的果實類生藥的顯微特征。小茴香外果皮外被角質層,棱脊部位有維管束柱(由2個外韌型維管束及纖維束連接而成),木質部有少數(shù)細小導管,維管束柱內外側有多個木化網(wǎng)紋細胞;胚乳細胞含多數(shù)細小的糊粉粒和脂肪油滴。學校從教具公司購買的石蠟切片常常由于切片材料幼嫩,導管和網(wǎng)紋細胞未被染色或染色較淺,不利于學生觀察。為了讓學生對果實和種子類生藥胚乳細胞及其內含物脂肪油滴產(chǎn)生深刻印象,教學組設計了讓學生徒手切片并進行顯微化學染色反應的實驗。但學生缺乏徒手切片經(jīng)驗,徒手切片較厚或薄厚不均,且氣泡多,染色效果很不理想,甚至在切片時發(fā)生劃傷手的情況,導致實驗效果不甚理想。

鑒于此,近幾年來教學組在生藥學實驗課上嘗試使用冷凍切片機進行切片。冷凍切片機型號為Leica CM1950。實驗教師通過預實驗,設置冷凍箱溫度為-20℃左右,樣品頭溫度為-12℃左右,切片厚度可達30～50μm左右,即可獲得滿意的小茴香橫切片。實驗時學生按常規(guī)操作,包埋已經(jīng)軟化的小茴香,切取小茴香橫切片,分別用稀甘油、間苯三酚硫酸試液、蘇丹Ⅲ試液封藏,觀察現(xiàn)象。教師和學生通過對比可觀察到下列現(xiàn)象:導管和網(wǎng)紋細胞因細胞壁木化,被間苯三酚硫酸試液染成紅色;油滴和外果皮細胞外角質層被蘇丹Ⅲ試液染成紅色(圖1)。經(jīng)過4年的教學實踐,多位助教和多數(shù)學生反映冷凍切片操作簡單、切片完整,細胞界限和維管束清楚,染色效果明顯,實驗效果較徒手切片大大提升。

A:網(wǎng)紋細胞和木質部,B:油滴,C:角質層

冷凍切片適用于柔軟、含多量薄壁組織、含水量較多的材料。全草類生藥如麻黃、薄荷和石斛,根和根莖類生藥如細辛和麥冬,大部分葉類和花類生藥,果實類生藥如枸杞子等生藥樣品均適合,也適用于新鮮的藥用植物材料。需要注意的是,為了得到質優(yōu)的切片,對于不同的材料,教師需要摸索合適的切片厚度、適宜的冷凍箱溫度和樣品頭溫度等[4]。由于冷凍切片機已在科研中廣泛使用,本次實驗也為學生今后的科研工作打下了良好的基礎。

2 數(shù)字切片在生藥學實驗課中的應用

目前的生藥學實驗課中,多使用石蠟永久切片展示生藥的組織構造顯微特征。石蠟切片制作過程費時費力,每張切片的質量參差不齊,學生觀察的效果也會有所不同,并且玻璃材質的石蠟切片容易褪色和破損[5]。教師在準備PPT時,需要拍攝永久石蠟切片。而為了全面和清楚地顯示某種生藥的組織構造,尤其是藥材樣品較大時,需要拍攝多張圖片合并處理成一張扇形或方形的構造圖,此法比較費時費力。

數(shù)字切片掃描儀可以對整個石蠟切片進行全信息、全方位和高分辨率地掃描和智能拼接,高保真顯現(xiàn)顯微鏡下景象,并將整張切片轉化為數(shù)字化顯微圖像保存,即數(shù)字(虛擬)切片。此切片圖像可以在計算機上進行動畫式放大及縮小、裁切、復制和粘貼等,具有容易保存、觀察方便和利于教學等優(yōu)點[6]。近年來,數(shù)字切片越來越多地被應用于醫(yī)學形態(tài)學科,包括人體解剖學、病理學、組織學與胚胎學等,提高了實驗課的教學質量,提升了學生的學習效果[5,7]。但在生藥學課程中的實際應用報道很少。

教學組采用數(shù)字切片掃描儀(型號:濱松NanoZoomer-SQ)掃描了番瀉葉、大黃、甘草、肉桂、小茴香等質優(yōu)的石蠟切片,保存為數(shù)字切片。教師在課堂講授時,首先展示完整的番瀉葉、大黃根莖、甘草根、肉桂枝皮和小茴香果實橫切面(圖2),再放大和移動數(shù)字切片,重點展示和講解典型特征,如大黃的星點、黏液腔和蛇形導管,番瀉葉的氣孔和簇晶等細微特征。通過近兩年的實驗報告比較和學生訪談,筆者了解到學生普遍認為數(shù)字切片能夠清楚地展示藥材的顯微特征,數(shù)字切片能夠促進學生對藥材組織顯微特征的掌握,動畫式放大及縮小展示方式提高了學生的學習興趣,提高了教學效果。

圖2 番瀉葉橫切面(A)和大黃根莖橫切面(B)數(shù)字切片

教師在生藥學實驗課中可繼續(xù)推廣數(shù)字切片技術:一方面可以構建數(shù)字切片數(shù)據(jù)庫,為網(wǎng)絡教學提供豐富的電子資源;另一方面,可將數(shù)字切片與其他軟件結合進行相關的分析,如掃描葉類生藥的表面片,使用軟件統(tǒng)計分析圖像中的氣孔、表皮細胞和毛茸等,為生藥鑒定和質量評價研究等提供基礎。還可設計一個綜合性實驗,內容包括手繪組織構造圖、顯微數(shù)碼相機拍攝及數(shù)字切片三部分(圖3)。通過這個實驗,學生可以深刻體會手繪組織構造圖、拍攝顯微特征圖和數(shù)字切片三種顯微鑒別圖呈現(xiàn)形式的優(yōu)缺點,體會生藥學實驗課堂條件的改善歷程,了解生藥顯微鑒定的發(fā)展過程。目前,數(shù)字切片技術在生藥學實驗課的應用中還存在不足。如本教學組曾嘗試使用數(shù)字切片掃描儀掃描生藥粉末片,但因粉末片中組織、細胞和內含物種類多,大小和形態(tài)不一,重疊交織現(xiàn)象嚴重,所以掃描圖像很不清楚,難以達到觀察辨識的實驗目的。

圖3 手繪、拍攝和數(shù)字切片顯示大黃根莖組織構造特征

冷凍切片技術和數(shù)字切片技術均可被應用于生藥學實驗課教學。前者具有簡便、高效和易操作的優(yōu)點,可以部分替代目前生藥學實驗課教學中的徒手切片和石蠟切片;后者具有容易保存和觀察方便等優(yōu)點,目前生藥學實驗課中數(shù)字切片技術多用于對石蠟永久切片進行掃描和保存。相關教師可以嘗試掃描染色效果佳、質優(yōu)的冷凍切片,將數(shù)字切片和冷凍切片技術結合,充分發(fā)揮其優(yōu)勢,合理利用教學資源,以不斷提高生藥學教學質量。

致謝:感謝王寶榮老師審閱全文,并給出了很好的建議。感謝陸艷老師準備實驗。感謝教學組和儀器平臺多位老師的幫助。感謝多位研究生助教的幫助。