周志蓮 周彤 周秀娟 龍坤蘭 陳駿 張傳濤 高培陽

摘要：抗生素的過度使用導致了“超級細菌”的出現，銅綠假單胞菌是引起醫(yī)療相關感染的機會致病菌之一。銅綠假單胞菌臨床分離株對常用抗菌藥物的耐藥性已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。銅綠假單胞菌的致病性和耐藥性被一種稱為“群體感應”的復雜機制調節(jié)，其調節(jié)毒力因子的產生、生物膜形成、細菌對抗生素的耐藥性、細菌運動等等，并可減弱宿主的免疫應答。群體感應抑制劑（quorum sensing inhibitors， QSIs）可以在不影響細菌生長的情況下降低細菌毒性，并可抑制和消除生物膜，增加抗生素對細菌的敏感性。這些特性使QSIs成為目前研發(fā)抗感染和輔助抗感染藥物的熱點，本文就銅綠假單胞菌的群體感應系統和銅綠假單胞菌QSIs的研究進展進行了綜述。

關鍵詞：群體感應系統；銅綠假單胞菌；群體感應抑制劑

中圖分類號：R978.1 ?文獻標志碼：A

Study on quorum sensing system and its inhibitors of Pseudomonas aeruginosa

Zhou Zhilian， Zhou Tong， Zhou Xiujuan， Long Kunlan， Chen Jun， Zhang Chuantao， and Gao Peiyang

（Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610072）

Abstract The overuse of antibiotics has led to the emergence of "superbacteria". Pseudomonas aeruginosa is one of the opportunistic pathogens that causes medical-related infections. The resistance of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa to commonly used antibiotics has become a serious public health problem. The pathogenicity and drug resistance of Pseudomonas aeruginosa are regulated by a complex mechanism called “quorum sensing”. Quorum sensing regulates the production of virulence factors， biofilm formation， bacterial resistance to antibiotics， bacterial movement and so on， and can weaken the immune response of the host. Quorum sensing inhibitors （QSIs） can reduce bacterial toxicity without affecting bacterial growth， as well as inhibiting and eliminating biofilm， thus increasing the sensitivity of antibiotics to bacteria. These characteristics make QSIs a key focus in research into the development of anti-infective and adjuvant anti-infective drugs. This paper reviews the quorum sensing system of Pseudomonas aeruginosa and summarises progress in research into Pseudomonas aeruginosa QSIs.

Key words Quorum sensing system; Pseudomonas aeruginosa; Quorum sensing inhibitors

抗生素濫用導致的抗生素耐藥性（antimicrobial resistance， AMR）已成為全球公共衛(wèi)生問題。最近的一項評估估計，如果全球繼續(xù)忽視AMR問題，到2050年，由此導致的人類死亡將達到1000萬[1]，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa， PA）是一種運動型、帶有單極鞭毛、需氧的芽胞桿菌[2]，是醫(yī)院常見的機會致病菌之一，可引起多系統感染，包括消化系統、呼吸系統等。由于抗生素的濫用，多重甚至泛耐藥銅綠假單胞菌的出現給臨床治療帶來了巨大挑戰(zhàn)[3-4]。研究顯示，銅綠假單胞菌的致病性和耐藥性與群體感應（quorum sensing， QS）有關。QS是廣泛存在于細菌群體中的一種依賴細菌密度的信號系統[5]，可調節(jié)多種生物學特性，包括毒力基因的表達、細菌的運動及生物膜的形成[6]。最近，QS過程的抑制劑，群體猝滅（quorum quenching，QQ）酶和群體感應抑制劑（quorum sensing inhibitors，QSIs），已被開發(fā)用于降低細菌的毒力，從而在不干擾細菌生長的情況下抑制細菌毒力因子[7]，降低細菌耐藥性[8]。本綜述總結了銅綠假單胞菌的QS系統及其在生物膜形成過程中的作用。同時，還總結了QSIs和QQ酶的最新發(fā)展，作為設計新抗菌劑的可能策略。

1 群體感應系統與PA的群體感應系統

1.1 群體感應系統

群體感應是細胞與細胞之間的通訊方式[9]，廣泛存在于自然界的微生物中，是一個依賴于細菌密度的基因調控系統[5]。細菌在生長過程中會產生和釋放一種稱為自誘導分子（auto inducers， AIs）的化學信號分子，其濃度隨著細菌種群密度的增加而增加，當自誘導分子達到閾值后，就會與QS受體結合，調控多種基因的表達[10]，從而調節(jié)毒力因子的生成、生物膜形成和胞外多糖等，使細菌作為一個能夠共同應對周圍環(huán)境變化的群體，產生耐藥性和毒力等不良后果[11]。通過QS系統表達致病性和耐藥性包括以下步驟：①合成QS信號分子；②向環(huán)境釋放信號分子；③高密度的信號分子與膜受體的感應和結合；④從細胞中提取受體信號復合物及其與啟動子區(qū)的結合；⑤致病相關基因的轉錄[12]。大量研究發(fā)現，不同的微生物通過不同的化學信號進行群體感應：N-?；呓z氨酸內酯類（acylhomoserine lactones， AHLs）及其衍生物主要作用于革蘭陰性菌；氨基酸和短肽類（autoinducing peptides， AIPs）主要作用于革蘭陽性菌；除這兩大類AIs外，還報道了各種微生物對多種信號分子的使用，如銅綠假單胞菌以假單胞菌喹諾酮類信號（Pseudomonas quinolone signal，PQS）為信號分子等[13]。

1.2 銅綠假單胞菌的群體感應系統

銅綠假單胞菌主要通過las系統、rhl系統和pqs系統介導群體感應，詳見圖1，其中l(wèi)as系統和rhl系統屬于AHLs介導的系統，這類系統由LuxI合成酶和LuxR受體蛋白組成。具體來說，las系統由LasI合成酶和LasR受體蛋白組成，rhl系統由RhlI合成酶和RhlR受體蛋白組成。在las系統中，LasI合成3-氧十二烷酰高絲氨酸內酯（N-（3-oxododecanoyl）-L-homoserine lactone， 3-oxo-C12-HSL）作為該系統的AIs，當其達到閾值時，與LasR結合后激活LasR受體蛋白并形成復合物LasR-3OC12-HSL，直接或間接調控基因的表達。rhl系統和las系統的區(qū)別是其AIs為丁基高絲氨酸內酯（N-Butanoylhomo Serine lactone， C4-HSL），其形成的復合物是RhlR-C4-HSL。第三個pqs系統是僅在銅綠假單胞菌中發(fā)現的，它使用烷基-4-（1H） 喹諾酮類化合物（alkyl-4-（1H）-Quinolones， AQS）作為信號分子，AQS包括2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮（PQS）及其前體2-庚基-4-羥基喹啉（HHQ）。pqsABCD操縱子產生HHQ，HHQ經PqsH催化轉化為PQS，而PqsR作為受體蛋白與信號分子結合以激活各種靶基因的轉錄[14]。研究表明las、rhl、pqs系統均可調節(jié)多種毒力因子的表達，如胞外酶、次級代謝物和毒素。rhl、pqs系統還可以調節(jié)鼠李糖脂的生成[15]。除了這3個QS系統外，還存在第四種群體感應系統，稱為iqs系統，它的信號分子被稱為IQS，iqs系統具有整合QS信號和應激反應方面的功能。iqs系統的中斷會干擾pqs和rhl介導的QS信號。在營養(yǎng)充足的條件下iqs系統由las系統控制，其可通過限制磷酸鹽被激活。iqs系統可以在lasI或lasR基因突變的情況下調控las系統，繼續(xù)發(fā)揮銅綠假單胞菌QS系統的調節(jié)作用[16]。然而，最近的一項研究證實IQS是一種銅綠醛，是綠膿菌素生物合成或降解的副產物[17]。

在銅綠假單胞菌的QS網絡中，各子系統彼此獨立而又相互關聯，存在級聯調節(jié)機制。已有研究表明las系統中的lasRI基因位于其他系統的上游，是QS網絡系統的主控因子，啟動lasRI基因后可上調其他系統基因的表達[18]。另外，pqsR和pqsH基因能夠被LasR-3OC12-HSL激活，而pqsABCD和pqsR又能被RhlR-C4-HSL抑制，PqsR-AQS信號分子AQS的分泌能夠進一步上調rhlI和rhlR的表達[19]?？偟膩碚f，pqs系統與las和rhl系統相互聯系，形成緊密而又高效的信號傳遞與交流的通路，共同調節(jié)菌體生理特性。

2 QS系統調節(jié)PA生物膜形成，增加抗生素耐藥性

2.1 QS系統調節(jié)PA生物膜形成

銅綠假單胞菌QS網絡中的las、rhl和pqs系統調節(jié)多種促進生物膜發(fā)育的分子產生，包括Pel多糖、鼠李糖脂、綠膿菌素、鐵載體pyoverdine和凝集素等。Pel多糖在維持生物膜生長、成熟及結構維持中起決定作用。鼠李糖脂是一種含有鼠李糖的糖脂化合物，在后期生物膜形成過程中維持細胞聚集物之間的開放空間起著重要作用。綠膿菌素是一種有細胞毒性作用的次級代謝物，可誘導細胞裂解并將細胞DNA釋放形成胞外DNA（extracellular DNA， eDNA）eDNA是生物膜成分之一，它可以與綠膿菌素結合，增加溶液黏度，進而增加生物膜基質與周圍環(huán)境的相互作用，促進細胞聚集。鐵載體pyoverdine是對鐵具有高親和力的熒光鐵載體，它可以在環(huán)境中固定鐵，并將其輸送到細胞中，鐵是生物膜形成的必要成分。凝集素（lectin， Lec）是位于外膜上的可溶性蛋白質，包括LecA和LecB，前者與半乳糖及其衍生物結合，后者與巖藻糖、甘露糖和含甘露糖的低聚糖結合。凝集素的這種黏附特性促進細胞和胞外多糖停留在生長的生物膜中，不僅有利于形成生物膜結構，還有利于黏附在上皮和黏膜等生物表面[17]。此外，核苷酸的第二信使，二磷酸鳥苷，是胞外聚合物（extracellular polymeric sub-stances， EPS）產生的關鍵調節(jié)因子，能使細菌細胞從能動階段轉變?yōu)楣讨A段，并使粘附細胞處于生物膜狀態(tài)[20]。既往研究已經證實QS信號分子可直接或間接地作用于二磷酸鳥苷，將復雜的環(huán)境信息信號轉換為一般細胞內信號，促進生物膜形成[21]?？偟膩碚f，這種分子和細胞的交互作用再合并其他聚合物可促進形成一個穩(wěn)固而成熟的生物膜[22]。

2.2 銅綠假單胞菌生物膜與抗生素耐藥性

銅綠假單胞菌以生物膜和浮游生物兩種形式存在，PA以生物膜的形式生長時表現出許多不同于浮游細胞的特性，一方面增強了對抗生素的耐藥性，另一方面還可以對抗宿主免疫系統[23]，使得由PA生物膜引起的感染難以治療和根除[24]。PA的生物膜由EPS基質包圍的細胞構成，這種基質包含多糖、脂類、蛋白質、核酸和生物表面活性劑，它們有助于細胞的初始黏附，并為生物膜形成提供基本結構。其中EPS基質產生于生物膜發(fā)育后期高度自聚集時[20]。銅綠假單胞菌生物膜的形成包括4個主要步驟： 附著在表面，增殖，微菌落形成及成熟為一個結構化的耐藥微生物群落[25]。

生物膜胞外多糖基質作為一種擴散屏障，阻止抗生素的擴散，并固定抗生素。此外，擴散障礙導致養(yǎng)分梯度的產生，使得細菌細胞的生長在生物膜的不同區(qū)域有所不同。生長在生物膜表面的細菌細胞代謝更加活躍，而內部細胞生長更加緩慢[26-27]。生物膜內部細胞生長速度下降和代謝活動的減少使持久性細胞增加[28]。一些抗生素，如大多數β-內酰胺類抗生素，僅對生長中的細胞有效，而少數抗生素，如多黏菌素，對生長條件差的細胞仍有殺傷作用[26]，Baek等[29]還觀察到多黏菌素和環(huán)丙沙星聯用可以清除持久細胞。一般來說，較低濃度的抗生素就可以殺死大多數銅綠假單胞菌生物膜細胞，但是即便增加它們的濃度也不能殺死持久細胞[30]。因此，研究人員得出結論，生物膜細胞中只有一小部分負責增強抗生素抗藥性，大多數生物膜細胞對抗生素治療仍然敏感[27]。既往研究證實，革蘭陰性菌生物膜中含有更多的持久細胞，可能是因為它們的細胞壁含有脂多糖，進一步減弱了抗生素對細胞的滲透性[28]。

3 PA的群體感應抑制劑

QS在銅綠假單胞菌的致病性和多重耐藥性中起著關鍵作用，它可以上調有關毒力基因、生物膜相關基質基因、外排泵基因的表達，不僅有助于銅綠假單胞菌的傳播，還可以提高銅綠假單胞菌對抗菌藥物的耐藥性。治療銅綠假單胞菌感染的一種有希望的新方法是在不殺死任何目標細菌的情況下阻斷QS，近些年發(fā)現的QQ酶和QSIs可在不影響細菌生長的前提下，大大降低銅綠假單胞菌的毒性。這一作用使其不易誘導細菌耐藥[31]，因此此類藥物成為目前抗感染領域的研發(fā)熱點。QQ酶和QSIs通過不同的機制發(fā)揮作用（以AHL luxI/luxR調控機制為例，如圖2）：①抑制信號分子的合成；②酶降解信號分子；③與信號分子競爭結合相關受體位點；④干擾信號分子與基因啟動子的結合并抑制基因表達；⑤通過抗體和環(huán)糊精等大分子清除AIs。最近，已經報道了許多類型的QSIs，它們可以是人工合成的，也可以來自大自然中，從陸地、海洋到淡水生態(tài)系統[13]。QSIs由多種生物體產生，如植物、動物、真菌或細菌。大多數已知的QSIs主要在植物和微生物中鑒定。這可能是由于對植物提取物和微生物的QSIs活性進行了更多的篩選[32]。近年來，人工合成的QSIs也越來越多地被報道。

3.1 人工合成QSIs

在銅綠假單胞菌的QS系統中，LasR位于級聯傳導的頂端，是銅綠假單胞菌多種QS系統的核心調節(jié)因子。因此，LasR蛋白是近年研究銅綠假單胞菌群體感應抑制的熱門藥物靶點。Dalal等[33]篩選了大量潮霉素系列小分子，通過原子分子動力學模擬和分子力學計算來描述它們抑制LasR蛋白的潛力。結果表明一部分潮霉素分子對LasR蛋白具有良好的結合親和力，并可以形成穩(wěn)定的LasR抑制劑復合物，這將有助于正在進行的新抗生素研究。Aflakian等[34]通過人工合成設計了新的抗菌肽WSF、FASK和YDVD，通過與LasR蛋白的轉錄激活物結合，在銅綠假單胞菌的QS系統中干擾LasR，并進一步抑制了生物膜生成、生物膜相關基因AlgC、PslA和PelA的表達和浮游銅綠假單胞菌生長。

3.2 天然植物來源QSIs

除了人工合成化合物以及微生物次級代謝產物，天然植物及其次級化合物逐漸受到科學家們的重視，尤其是2015年之后，相關研究文獻激增[35]。大豆異黃酮（soy isoflavones， SI）是一組富含于大豆和其他豆類的酚類化合物，Yin等[36]通過體外實驗發(fā)現SI與銅綠假單胞菌的AHLs有很好的競爭性結合作用，對生物膜的形成，毒力因子、AHLs的產生以及QS相關基因的表達水平具有顯著的抑制作用。綠原酸（chlorogenic acid， CA）是一種在蔬菜、水果和中藥中含量豐富的酚類化合物，Xu等[37]將CA應用于耐多藥銅綠假單胞菌臨床分離株的QQ試驗，發(fā)現綠原酸能夠下調lasI、lasR、rhlI、rhlR、pqsA和pqsR基因的表達，抑制了耐多藥銅綠假單胞菌生物膜的形成，可以作為治療臨床銅綠假單胞菌感染的抗毒力因子。El-Sayed等[38]用70%乙醇萃取獲得綠茶提取物，通過體外實驗證明其對PA的lasI、lasR、rhlI和rhlR基因轉錄有較強的抑制作用，其抑制率分別約為92%、96%、95%、95%和93%，并且，在亞MIC下，綠茶提取物對PA生物膜抑制率高達85%，這項研究表明未來有希望減少對抗生素的依賴。α-松油醇（α-terpineol， αT）是一種香料，是從松樹、茶樹等植物中提取的精油的組成部分。Bose等[39]使用含有αT的游離納米結構脂質載體（nanostructured lipid carriers， NLCs）作用于PA，體外實驗發(fā)現αT-NLCs顯著降低PA的毒力基因rhlAB、aprA、lasB、toxA、plcH和關鍵QS基因las和rhl的表達水平。同時也顯著降低EPS、溶血素、彈性蛋白酶和綠膿菌素的產生，另外，還抑制了PA的游泳運動和生物膜形成。電子分析還表明，αT-NLCs對QS受體lasR、rhlR和pqsR有很強的結合親和力?；讦罷-NLCs體外的強群體感應抑制活性，Bose等[40]還以銅綠假單胞菌感染小鼠角膜炎為模型，探討了αT-NLCs對銅綠假單胞菌誘導的角膜炎的治療效果，具體來說，經αT-NLCs治療后，角膜組織中的細菌數量顯著減少，并改善了角膜組織病理學，減少了炎癥標記物水平。這是少有的體內實驗的研究結果。松油烯-4-醇是αT的異構體，是茶樹油中主要的單氧萜類活性成分，Bose等[41]觀察到松油素-4-醇、環(huán)丙沙星單獨使用均可抑制PA的毒力因子和生物膜的產生，并減少成熟生物膜的數量，另外，還觀察到松油烯-4-醇和環(huán)丙沙星聯用使PA的毒力因子的產生最大程度的降低。使QSI與抗生素聯用成為另一種治療感染的可能。

3.3 傳統中藥來源QSIs

此外，傳統中藥及其次級化合物在抑制QS方面的研究也在日益增多，如黃芩苷，姜辣素、姜烯酮、姜油酮（生姜的酚類化合物）及它們的衍生物，肉桂醛和丹皮酚等[1，42]，已有相關綜述在前，不再贅述。值得一提的是，最近的研究顯示，肉桂醛和抗生素聯用表現出更強烈的群體感應抑制活性，具體來說：肉桂醛單獨誘導lasB、rhlA和pqsA基因的抑制分別約為50%、60%和45%，而肉桂醛和妥布霉素聯合使用可降低lasR表達約70%，抑制rhlR和PQS分別為64.7%和69.4%。此外，與單獨作用相比，肉桂醛與黏菌素和肉桂醛與妥布霉素在生物膜抑制和預成生物膜分散中具有相加活性[43]。Subhaswaraj等[44]為了解決生物利用度問題，開發(fā)出亞MIC水平的肉桂醛包覆殼聚糖納米粒（cinnamaldehyde encapsulated chitosan nanopart-icles，CANPs），結果表明，與肉桂醛單獨使用相比，CANPs通過下調QS調節(jié)的毒力因子和相關的生物膜形成，顯示出更顯著的抗群體感應活性，并可顯著抑制PA的游泳和群集運動。

4 總結和展望

生物膜相關感染治療困難，也更容易引起復發(fā)，找到有針對性的治療措施，是臨床抗感染中急需解決的問題，QQ酶和QSIs以細菌QS系統作為靶標防治細菌感染，不僅可以減少毒力因子的產生，降低細菌致病性，還可以抑制生物膜的產生和清除成熟生物膜，增加抗生素對細菌的敏感性。如果在治療中較早使用，則會延遲甚至消除耐藥性，使其可能成為優(yōu)良的輔助抗菌藥物，越來越多的研究已經證明抗生素和QSI合用可以發(fā)揮協同作用，不僅可以減少藥物的劑量和不良反應，還能延緩細菌耐藥速度。并且隨著納米技術與QSIs的碰撞，更是解決了傳統QSIs的生物利用度的問題。由于QSIs并不殺死或抑制細菌生長，使得細菌不易產生抗藥性[45]。然而目前的研究成果大多還停留在體外試驗和體內動物實驗，這些研究成果還需要進一步驗證，才能成功過渡并轉化為應用醫(yī)學，從而在臨床環(huán)境中對抗銅綠假單胞菌的感染。

參 考 文 獻

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