蘇可盈，楊惠林，謝書垚，陳鋅璐，王凱，畢會(huì)敏

（1.廣州工商學(xué)院工學(xué)院，廣州 510850；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510642）

0 引 言

計(jì)算機(jī)模擬篩選技術(shù)是新興的研究技術(shù)，可用于生物活性多肽的篩選和多肽藥物的研究等領(lǐng)域。國(guó)外學(xué)者對(duì)計(jì)算機(jī)模擬篩選技術(shù)運(yùn)用較成熟，并且已經(jīng)開發(fā)了許多新的肽類數(shù)據(jù)庫(kù)，如BIOPEP-UWM。IMAI 等[1]利用該數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出7 種新的膽汁酸結(jié)合肽（VFWM，QRIFW，RVWVQ，LIRYTK，NGDEPL，PTFTRKL 和KISQRYQ）；LAMICHHANE 等[2]為了尋找針對(duì)野生型的細(xì)菌螺旋31 的配體，使用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，通過幾輪的篩選成功發(fā)現(xiàn)TYLPWPA、CVRPFAL 等幾個(gè)親和力較好的肽。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)計(jì)算機(jī)模擬篩選技術(shù)也有初步的應(yīng)用，如頡宇等[3]利用BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過對(duì)所選酶進(jìn)行虛擬酶解，成功獲得了目標(biāo)抗氧化肽LDEPDPL；周湘人[4]則用UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)和BIOPEP 活性肽數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合，通過模擬酶解和肽序篩選，發(fā)現(xiàn)了大米谷蛋白具有制備DPP-IV 抑制肽和ACE 抑制肽的潛力。

乳類含豐富的蛋白質(zhì)成分，如生長(zhǎng)因子、免疫球蛋白、抗菌蛋白等[5]。與乳類蛋白相比，乳類源肽的空間結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性較高，功能更豐富，在人體的生長(zhǎng)代謝起著重要的作用，部分研究表明[6-8]，乳類蛋白在酶解后的生物活性大大提高。近年來，人們?cè)趯?duì)乳類源生物活性肽的研究中發(fā)現(xiàn)了抗菌肽[9]、抗氧化活性肽[8，10]、降血壓肽等多種生物活性肽[11-12]。但研究大多為“酶解-提取分離-肽序列解析-活性驗(yàn)證”傳統(tǒng)方法[6-12]，需經(jīng)過繁瑣的實(shí)驗(yàn)過程，耗時(shí)較長(zhǎng)，且乳類中蛋白種類繁多，酶解得到的肽更是數(shù)不勝數(shù)，用傳統(tǒng)方法難以篩選出高效的生物活性肽。本研究把計(jì)算機(jī)模擬篩選技術(shù)用于生物活性肽的篩選，能簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，減少實(shí)驗(yàn)工作量，因此，效率高于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸緩沖溶液（pH 6.5）、硫酸亞鐵、30% H2O2，均為分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；無水乙醇(分析純)，廣東林氏化學(xué)試劑有限公司；鄰菲羅啉(分析純)，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP法），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；合成肽序列VPPF、IPPL、PSF、PPT 和PPQ（純度＞95%），上海淘普生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

V-1000 可見分光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司；AB104 電子天平，沈陽(yáng)多杰電子科技有限公司；雷磁PHB-3E pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；RT-6100 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，濟(jì)南駿馳生物科技有限公司；HHS 型電熱恒溫水浴鍋、HPX-9082MBE 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KQ2200 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；移液槍，萊普特科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳類蛋白的模擬水解

在UniprotKB 中分別獲取牛乳蛋白β-酪蛋白和羊乳蛋白αS1-酪蛋白的蛋白序列文件。再通過BIOPEP-UWM Database 選擇糜蛋白酶（chymotrypsin，EC 3.4.21.1）、胰蛋白酶（trypsin，EC 3.4.21.1）、胃蛋白酶（pepsin，pH＞2，3.4.23.1）3 種酶對(duì)牛乳的β-酪蛋白和羊乳的αS1-酪蛋白分別進(jìn)行模擬腸胃道環(huán)境的水解反應(yīng)。從水解后的結(jié)果中選擇氨基酸個(gè)數(shù)為3～6 的低聚肽進(jìn)行后續(xù)研究，這類短肽進(jìn)入人體消化道后不易被降解，且吸收較快，有較好的生物活性[12]。

1.3.2 乳類低聚肽的生物活性預(yù)測(cè)

Peptide Ranker 是一個(gè)基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)生物活性肽概率的新型生物活性預(yù)測(cè)服務(wù)器[5]。利用Peptide Ranker 網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)進(jìn)行多肽的生物活性預(yù)測(cè)，將模擬酶解后篩選出的氨基酸個(gè)數(shù)為3～6 的低聚肽序列輸入Peptide Ranker 服務(wù)器中，可預(yù)測(cè)得到各多肽的生物活性大小。其活性用“Score”表示，滿分為1，數(shù)值越高，表示多肽的預(yù)測(cè)活性越高。選擇預(yù)測(cè)活性Score＞0.5 的多肽進(jìn)行后續(xù)的抗氧化活性研究。

1.3.3 低聚肽的合成

把篩選出的Score＞0.5 的多肽進(jìn)行合成。多肽合成的簡(jiǎn)要步驟為：（1）樹脂溶脹；（2）氨基酸的固定；（3）檢測(cè)；（4）清洗；（5）再檢測(cè)；（6）肽鏈的延伸：按照以上方法重復(fù)操作，依次接完剩余的氨基酸，即完成肽鏈的延伸；（7）收縮；（8）切割與脫保護(hù)，切割液各組分的體積比為：TFA(94.5%)、水(2%)、EDT(2.5%)、TIS(1%)；（9）得到粗品肽。制備工藝如圖1 所示。

圖1 多肽合成工藝

1.3.4 合成肽的純度驗(yàn)證

采用安捷倫1260 型高效液相色譜（HPLC）測(cè)定合成肽純度; 檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（DAD）。色譜柱：kromasil C18-5 色譜柱（4.6mm×150 mm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm。流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸乙腈（A）和0.1%三氟乙酸水（B）。流動(dòng)相程序?yàn)椋海?）0～0.01 min ：5%A:95%B；（2）0.01～25 min：70%A:30%B；（3）25～30 min：90%A:10%B。

1.3.5 低聚肽的抗氧化活性的測(cè)定

1.3.5.1 總抗氧化活性的測(cè)定

采用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP 法）測(cè)定：根據(jù)待測(cè)樣品的數(shù)量需要（含標(biāo)準(zhǔn)曲線），將試劑盒的TPTZ 稀釋液、TPTZ 溶液和檢測(cè)緩沖液全部配置成FRAP 工作液，并置于(37±1)℃孵育6～8 min。稱量FeSO4·7H2O 27.8 mg，加入1 mL 蒸餾水溶解，再將其稀釋成0.1、0.25、0.5、0.75、1 和2 mmol/L 的FeSO4溶液；取各合成肽樣品，配制成0.125、0.25、0.2、1、2 g/L 的樣品溶液。

在96 孔板中先后加入180 μL FRAP 工作液、5 μL不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，將這些溶液輕輕振蕩使其混合均勻，在（37±1) ℃溫度下孵育6～8 min，然后使用酶標(biāo)儀測(cè)量在595 nm 的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。把5 μL 不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液換成樣品溶液，測(cè)定各合成肽溶液的總抗氧化活性，用5 μL 蒸餾水作空白對(duì)照。結(jié)果用FeSO4的相對(duì)濃度表示，每組測(cè)定3次，取平均值。

1.3.5.2 ·OH 清除能力測(cè)定

參考陳麗花[13]的方法并作適當(dāng)調(diào)整。在試管中依次加入1 mL 不同濃度的合成肽樣品，1 mL 3 mmol/L 鄰菲羅啉，2 mL 0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.4），和1 mL 4 mmol/L FeSO4·7H2O 溶液，溶液加入完成后振蕩混勻，隨后再添加1 mL 0.1% H2O2溶液，在37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)50 min，并使用分光光度計(jì)在536 nm 處測(cè)定吸光值。按照下式計(jì)算多肽生成液的·OH 自由基清除率。

·OH 自由基清除率=（A樣品-A損失）/(A未損-A損失）×100%

式中：A樣品為加入多肽生成液的吸光度，A損失為加入蒸餾水替代多肽生成的吸光值，A未損為加入蒸餾水分別替代多肽生成液和H2O2的吸光度。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳類蛋白的胃腸模擬水解

Uniprot 是目前所知的信息資源比較豐富的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，能夠自由訪問蛋白質(zhì)的序列文件，能極大的支撐分子對(duì)接、虛擬篩選等領(lǐng)域的應(yīng)用[14-15]。BIOPEP 可以通過計(jì)算機(jī)運(yùn)算來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)鏈中易被內(nèi)肽酶水解的鍵，并定量衡量蛋白質(zhì)作為生物活性肽潛在前體的價(jià)值[16]。本研究用BIOPEP-UWM 對(duì)牛乳β-酪蛋白和羊乳αS1-酪蛋白進(jìn)行腸胃道模擬水解的數(shù)據(jù)如表1 所示。其中來源于牛乳β-酪蛋白的3～6肽有10 條、來源于羊乳αS1-酪蛋白的3～6 肽有9 條。由表1 可知羊乳蛋白中αS1-酪蛋白的水解度為74.65%，高于牛乳中β-酪蛋白的水解度69.51%；但β-酪蛋白中3～6 肽的出現(xiàn)頻率為0.0641，略高于αS1-酪蛋的0.0563，兩種蛋白中3～6 肽的出現(xiàn)頻率與本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)植物蛋白研究[17]中3～6 肽的出現(xiàn)頻率相近。雖然羊乳中αS1-酪蛋白比牛乳中β-酪蛋白的水解程度更大，但其中的3～6 肽出現(xiàn)的概率更小，可能原因是羊乳中αS1-酪蛋已更多水解成單個(gè)的氨基酸或二肽分子。

表1 2 種蛋白的胃腸道模擬水解

2.2 乳類低聚肽的Peptide Ranker 分析

運(yùn)用Peptide Ranker 網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)對(duì)篩選出的3～6肽進(jìn)行生物活性預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果如表2 和表3 所示。由表2 可知牛乳的β-酪蛋白(Beta-casein)中Score＞0.5 的活性肽有4 個(gè)，分別為IPPL、VPPF、PPT 和PPQ，其中IPPL 和VPPF 肽序的預(yù)測(cè)活性遠(yuǎn)高于其他肽序列，分別為0.84517 和0.926314；而表3 羊乳的αS1-酪蛋白(αS1-casein)中Score＞0.5 的肽序列只有PSF，符合本實(shí)驗(yàn)的篩選要求，其活性為0.920402。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示牛乳的β-酪蛋白的肽序列活性普遍高于羊乳的αS1-酪蛋白，但各肽序列的抗氧化活性仍需通過后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出進(jìn)行后續(xù)研究的肽序列分別為：IPPL、VPPF、PPT、PPQ 和PSF。

表2 牛乳多肽的生物活性預(yù)測(cè)

表3 羊乳多肽的生物活性預(yù)測(cè)

2.3 低聚肽的純度分析

HPLC 法定量準(zhǔn)確、分析快速、重復(fù)性較高，被廣泛應(yīng)用于純度分析和定量檢測(cè)的相關(guān)研究中。本研究用HPLC 法測(cè)定各合成多肽的純度。各多肽序列的高效液相色譜結(jié)果如圖2 所示，圖（d）和（e）中的VPPF和IPPL 兩個(gè)肽序在保留時(shí)間為20.608 min 時(shí)峰面積高達(dá)98.84%；而圖（b）的PSF 肽序在15.962 min 時(shí)，峰面積高達(dá)98.79%；圖（a）和圖（c）中的PPT 和PPQ 分別在7.258 min 和9.625 min 時(shí)峰面積為96.04%和95.46%。說明各多肽序列的純度均在95%以上。

圖2 合成肽的高效液相色譜

2.4 多肽抗氧化活性分析

2.4.1 總抗氧化活性

2.4.1.1 FeSO·47H2O 標(biāo)準(zhǔn)曲線

FeSO·47H2O 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3 所示，在0～2 mmol/L的FeSO4濃度中，F(xiàn)eSO4·7H2O 標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=0.3132x+0.119，R2=0.9965。FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)濃度表示了多肽的總抗氧化能力，F(xiàn)eSO4溶液的相對(duì)濃度越高，說明多肽的總抗氧化活性越強(qiáng)。

圖3 FeSO4·7H2O 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.1.2 多肽的總抗氧化活性

不同乳類多肽的總抗氧化活性如圖4 所示。由圖4 可知，PPT 和PSF 的總抗氧化活性呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，在濃度為0.125～2 g/L 時(shí)，總抗氧化活性隨著多肽濃度的增加而增強(qiáng)；多肽濃度為2 g/L 時(shí)，PPT 肽序的總抗氧化活性相當(dāng)于0.1794 mmol/L 的FeSO4溶液；PSF 的總抗氧化活性相當(dāng)于0.2085 mmol/L的FeSO4溶液。PPQ、VPPF 和IPPL 肽序的總抗氧化活性雖在0.125～2 g/L 范圍內(nèi)無明顯的量效關(guān)系，但濃度為2 g/L 時(shí)，其總抗氧化活性均達(dá)到最強(qiáng)，PPQ 為0.1452 mmol/L 的FeSO4溶液；VPPF 為0.1248 mmol/L 的FeSO4溶液；IPPL 為0.104 mmol/L的FeSO4溶液?？偟膩碚f，PPT、PSF 肽序的總抗氧化活性較好。

圖4 不同肽序的FeSO4 相對(duì)濃度

2.4.2 ·OH 清除能力

·OH 是最活躍的自由基之一，能夠轉(zhuǎn)移電子從而損壞細(xì)胞中的生物大分子，氧化能力極強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中用鄰菲羅啉、Fe2+和H2O2組成的反應(yīng)體系用來檢測(cè)合成肽的·OH 清除率。各合成肽對(duì)·OH 清除能力如圖5 所示，在0.25～2.00 g/L 范圍內(nèi)，PPQ 的·OH 清除能力呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，濃度為2 g/L 時(shí)，其清除能力最強(qiáng)，為47.28%。其他肽序列的·OH 清除能力隨濃度的增加呈現(xiàn)波動(dòng)上升，量效關(guān)系不明顯。其中，VPPF 在1 g/L 時(shí)，·OH 清除能力達(dá)到59.88%，為所有實(shí)驗(yàn)組中最高，而相同濃度下其余肽序列也呈現(xiàn)較好的·OH 清除能力，其排序?yàn)椋篒PPL（46.97%）＞PPQ（40.12%）＞PSF（39.04%）＞PPT（32.19%），該結(jié)果與Peptide Ranker 的生物活性預(yù)測(cè)結(jié)果匹配度較高，且本實(shí)驗(yàn)所得的·OH 清除能力略高于相關(guān)研究關(guān)于乳酸菌和酵母發(fā)酵乳的測(cè)定結(jié)果（30.83%～53.73%）。此外，段帥等[18]的研究顯示，5 g/L 的油莎豆粕抗氧化肽濃度對(duì)·OH 清除率為42.57%；干建松[19]的研究顯示，1 g/L海帶抗氧化肽的海帶抗氧化肽的·OH 清除率約為30%，其·OH 清除率與本研究結(jié)果相近，但效率均略低于本研究，可見乳類多肽有望用于更高效的抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)。

圖5 不同肽序的·OH 清除率

3 結(jié) 論

以牛乳的β-酪蛋白和羊乳的αS1-酪蛋白為研究對(duì)象，通過計(jì)算機(jī)模擬篩選的方法篩選出5 個(gè)生物活性潛能較高的低聚肽，分別為IPPL、VPPF、PPT、PPQ和PSF，并對(duì)其進(jìn)行合成、純度驗(yàn)證和抗氧化活性測(cè)定。結(jié)果顯示，被篩選出的5 個(gè)低聚肽在不同濃度下均有一定的總抗氧化活性和·OH 清除能力，其中，2 g/L PSF 的總抗氧化活性最強(qiáng)，相當(dāng)于0.2085 mmol/L的FeSO4溶液；1 g/L 的VPPF·OH 清除能力最強(qiáng)，達(dá)到59.88%。此外，PPT 和PSF 的總抗氧化活性呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，PPQ 的·OH 清除能力呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。這些低聚肽序列對(duì)抗氧化功能性食品的開發(fā)有較強(qiáng)的參考作用，然而其中的抗氧化作用機(jī)理等問題還需要做進(jìn)一步的研究。

本研究有別于傳統(tǒng)的多肽類研究方法，通過U-niprot Database、BIOPEP-UWM Database 和Peptide Ranker 3 個(gè)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)結(jié)合，運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬的方法篩選出更具生物活性潛能的多肽，再通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定多肽的生物活性。此方法大大縮減了研究的時(shí)間成本和原料成本，提高了研究效率，且研究結(jié)果穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性強(qiáng)，適用范圍廣，可用于各種生物活性多肽和多肽類藥物的研究和篩選。