劉琳，高波

（黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱 150028）

0 引 言

奶粉是以哺乳類動(dòng)物鮮乳為原料[1-3]，添加或不添加營養(yǎng)強(qiáng)化劑，通過特定工藝加工而成的粉狀食品。奶粉營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)作為其中最主要的營養(yǎng)成分[4-5]，含量高低是評(píng)定奶粉品質(zhì)的重要依據(jù)。因此，精準(zhǔn)、穩(wěn)定、快速、高效測(cè)定奶粉中蛋白質(zhì)含量十分重要。

檢測(cè)蛋白質(zhì)含量的方法很多[6-14]，凱氏定氮法、比色法、燃燒法[15]應(yīng)用廣泛。但前2 種方法耗時(shí)、費(fèi)力、有污染、不安全[16]，燃燒法測(cè)定蛋白質(zhì)含量所使用的主要儀器為杜馬斯定氮儀，分析過程3～6 min，9 成以上的工作由儀器自主完成[17]。實(shí)驗(yàn)無需使用腐蝕性試劑，僅產(chǎn)生少量灰分殘?jiān)＝陙?，國?nèi)外雖然對(duì)燃燒法的關(guān)注有所提升，但國內(nèi)對(duì)此相關(guān)的研究依舊限于凱氏定氮法和燃燒法之間的對(duì)比[18-21]，缺少采用燃燒法來檢測(cè)特定基質(zhì)中蛋白質(zhì)含量工藝參數(shù)優(yōu)化的研究。奶粉含水率低、均勻性好，采用燃燒法進(jìn)行大批量奶粉中蛋白質(zhì)的測(cè)定優(yōu)勢(shì)明顯。為此，本研究以奶粉為對(duì)象，通過單因素試驗(yàn)建立杜馬斯燃燒法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的最優(yōu)分析條件并進(jìn)行驗(yàn)證[22]，為杜馬斯燃燒法快速測(cè)定奶粉中蛋白質(zhì)含量的廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

幼兒配方奶粉，市售；天（門）冬氨酸aspartic acid標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW(E)100080，N 理論含量10.52%），山東亞學(xué)生物科技有限公司；混合催化劑，瑞典FOSS 公司；高純氧氣、高純二氧化碳，山東魯中氣體有限公司。

1.2 主要儀器

Rapid N cube 氮分析儀，德國Elementar 公司；8400 全自動(dòng)蛋白質(zhì)滴定儀，瑞典FOSS 公司；精確度0.1 mg 電子天平，瑞士梅特勒托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 參數(shù)設(shè)置

溫度參數(shù)設(shè)置。熱導(dǎo)檢測(cè)器溫度：60 ℃；燃燒管溫度：960 ℃；二級(jí)燃燒管溫度：800 ℃；還原管溫度：815 ℃。

O2壓力設(shè)置。O2減壓閥輸出壓力：0.22 MPa。

CO2壓力設(shè)置。Input 顯示值：0.12～0.125 MPa；MFC-CO2顯示值：約650 mL/min；Flow-CO2顯示值：約650 mL/min。

定義標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。選用N 理論含量為10.52%的天（門）冬氨酸aspartic acid 作為校準(zhǔn)樣品，設(shè)置N 測(cè)試允許的偏差為5%。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品及檢測(cè)樣品的制備

取均勻、干燥的標(biāo)準(zhǔn)品和奶粉樣品，稱重后用錫箔包裝制片。樣品制備過程需用鑷子或帶上手套，確保包裝材料不受人為污染。包裹樣品后，對(duì)包裝進(jìn)行擠壓、趕盡空氣。

1.3.3 執(zhí)行樣品測(cè)試

輸入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品信息、設(shè)定通氧方法后，用鑷子夾取樣品放入進(jìn)樣盤相應(yīng)的孔位后，啟動(dòng)分析測(cè)試。分析測(cè)試結(jié)束后，校正測(cè)試數(shù)據(jù)、打印測(cè)試結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 稱樣量的選擇

在相同的通氧條件下（氧氣流量300 mL/min，通氧時(shí)間140 s），取同一均勻性奶粉樣品，選取不同稱樣量作為一個(gè)分析水平進(jìn)行氮含量測(cè)定，同一水平連續(xù)測(cè)定6 次，結(jié)果如表1 所示。

表1 不同稱樣量對(duì)氮含量測(cè)定結(jié)果的影響（n=6）

由表1 可見，稱樣量在≤150 mg、≥250 mg 時(shí)，結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較高；稱樣量為250、300 mg 時(shí)，氮含量測(cè)定結(jié)果偏高。分析其原因，可能當(dāng)稱樣量少時(shí)，檢測(cè)樣品代表性不強(qiáng)，加之天平及稱量操作的系統(tǒng)誤差凸顯，從而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性；當(dāng)取樣過多時(shí)，樣品的燃燒不夠充分，進(jìn)入檢測(cè)器中的目標(biāo)物質(zhì)少，加大分析結(jié)果誤差。另一方面，樣品由于燃燒不完全，會(huì)產(chǎn)生與氮?dú)鉄釋?dǎo)系數(shù)相近的一氧化碳?xì)怏w，通過熱導(dǎo)檢測(cè)器，顯示結(jié)果虛高。所以在進(jìn)行奶粉中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定時(shí)，稱樣質(zhì)量選擇200 mg 比較合適。

2.2 氧氣流量的選擇

稱?。?00±20）mg 奶粉樣品，設(shè)定不同的氧氣流量，在相同的通氧時(shí)間（140 s）條件下，同一水平對(duì)其氮含量連續(xù)測(cè)定6 次，結(jié)果如表2 所示。

表2 不同氧氣流量對(duì)氮含量測(cè)定結(jié)果的影響（n=6）

由表2 可見，通氧量不足或通氧過快都會(huì)導(dǎo)致樣品燃燒不充分，使得試驗(yàn)的誤差加大。所以，綜合考慮測(cè)定結(jié)果的RSD 值及測(cè)試耗費(fèi)因素，設(shè)定200 mL/min的氧氣流量進(jìn)行奶粉中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定較為合理。

2.3 通氧時(shí)間的選擇

稱取（200±20）mg 奶粉樣品，在200 mL/min 的氧氣流量條件下，分析不同的通氧時(shí)間對(duì)氮含量檢測(cè)結(jié)果的影響，同一水平連續(xù)進(jìn)行6 次測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

表3 不同通氧時(shí)間對(duì)氮含量測(cè)定結(jié)果的影響（n=6）

由表3 可見，通氧時(shí)間在60、80 s 時(shí)，測(cè)得的氮含量偏低，結(jié)果的RSD 較大，原因可能在于通氧時(shí)間不足，樣品沒有燃燒轉(zhuǎn)化完全，影響了氮含量的檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)通氧時(shí)間在100 s 以上時(shí)，測(cè)定結(jié)果理想，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，表明100 s 以上的通氧時(shí)間能滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)氧氣的需求，但通氧時(shí)間越長，氧氣剩余越多，過剩的氧氣會(huì)隨著進(jìn)入還原管，氧化還原銅，從而降低其使用壽命。同時(shí)出于高效的考慮，最終選取100 s 的通氧時(shí)間最為合理。

2.4 優(yōu)化條件驗(yàn)證試驗(yàn)

通過影響條件的單因素實(shí)驗(yàn)分析，建立得到杜馬斯定氮儀測(cè)定奶粉中蛋白質(zhì)含量的最佳燃燒條件為：樣品稱樣量為200 mg，氧氣流量為200 mL/min，通氧時(shí)間為100 s。依據(jù)此優(yōu)化的燃燒條件參數(shù)，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)氮含量分析，結(jié)果如表4 所示。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證此優(yōu)化條件的準(zhǔn)確性，分別以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)天（門）冬氨酸質(zhì)量與奶粉質(zhì)量比為1∶1、1∶3 的比例（基于燃燒法分析時(shí)，稱樣量少，稱量難度大，可考慮先將樣品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混勻后取樣）進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5 所示。

表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 杜馬斯燃燒法與凱氏定氮法測(cè)定結(jié)果對(duì)比

作為檢測(cè)蛋白質(zhì)含量的經(jīng)典方法，凱氏定氮法因其高的靈敏度、好的準(zhǔn)確性，一直是我國國家標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)蛋白質(zhì)含量的仲裁法和新進(jìn)檢測(cè)方法的比對(duì)標(biāo)桿。為了進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)化條件的可行性，分別采用凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法對(duì)同一奶粉樣品進(jìn)行氮含量測(cè)定，分析結(jié)果如表6 所示。

表6 凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測(cè)定氮含量結(jié)果對(duì)比表

表6 結(jié)果顯示，優(yōu)化條件下杜馬斯燃燒法的測(cè)定結(jié)果普遍略高于凱氏定氮法，比值D/K 范圍為0.993～1.022、趨近于1，絕對(duì)差值為0.02。由此看來，2種方法對(duì)奶粉中蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)結(jié)果差異不大。而優(yōu)化條件下的杜馬斯燃燒法檢驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于凱氏定氮法，說明該法測(cè)定的穩(wěn)定性要優(yōu)于凱氏定氮法，原因可能在于杜馬斯燃燒法的操作步驟比凱氏定氮法簡化的多，由此降低了人為、儀器等各個(gè)方面帶來的誤差。

為了全面考察此優(yōu)化條件的杜馬斯燃燒法與凱氏定氮法對(duì)檢測(cè)相同樣品的差異性，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t 檢驗(yàn)。配對(duì)t 檢驗(yàn)結(jié)果P 值為0.194、大于0.05，說明2 種方法無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。綜上得出結(jié)論：優(yōu)化條件的杜馬斯燃燒法能夠滿足對(duì)奶粉中蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)需求，方法適用性較好。

2.6 注意要點(diǎn)

用杜馬斯燃燒法檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)含量，由于分析樣品用量少，所以要求樣品有好的均勻性。對(duì)于奶粉樣品，其樣品屬性為粉末狀態(tài)，所以無需經(jīng)過研磨過篩處理。但需要注意，若樣品出現(xiàn)受潮結(jié)塊等現(xiàn)象，需要提前處理確保檢測(cè)樣品均勻、有代表性；同時(shí)為了減小天平和稱量帶來的誤差，對(duì)于相同樣品，建議平行測(cè)定3 次來確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確；制樣壓片時(shí)，要壓片緊實(shí)，保證錫箔紙內(nèi)空氣全部排出，樣品無外漏。

選用純度較高的標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)保證稱取量能滿足實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定準(zhǔn)確的需求。每次進(jìn)行樣品分析前，需要進(jìn)行校正因子的測(cè)試，當(dāng)連續(xù)測(cè)試30～40 個(gè)次樣品后，也應(yīng)再進(jìn)行一次校正，校正時(shí)至少測(cè)定3 次標(biāo)樣，消除由于受不同環(huán)境條件（氣壓和溫度）的影響，造成儀器系統(tǒng)的微小偏差。

樣品進(jìn)行測(cè)試前，做好對(duì)儀器運(yùn)行狀態(tài)及儀器測(cè)試性能的檢查。首先檢查各填充管的測(cè)試次數(shù)，在連續(xù)進(jìn)行1 000 次試驗(yàn)后需要對(duì)還原管進(jìn)行檢查、替換；連續(xù)進(jìn)樣40～50 次后，需要對(duì)灰分坩堝進(jìn)行清理；干燥管中干燥劑有7 成以上濕潤變藍(lán)色后，就需要更換新的氧化鎂干燥劑。其次，檢查操作氣體是否流通正常，通氣管路是否有堵塞、漏氣等情況。能夠正常進(jìn)樣、分析的通氣條件為：計(jì)算機(jī)中壓力顯示0.12～0.125 MPa，二氧化碳流量顯示約650 mL/min，Deltap 約232。再就是各個(gè)溫度的檢查，當(dāng)熱導(dǎo)檢測(cè)器溫度達(dá)到（60.00±0.01）℃、燃燒管溫度達(dá)到（960±0.01）℃、二級(jí)燃燒管溫度達(dá)到（800±0.01）℃、還原管溫度達(dá)到（815±0.01）℃時(shí)方可進(jìn)行樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)試。最后要看下空白值測(cè)試情況，保證儀器管路內(nèi)空氣燃燒完全（即TCD 的基線走平）后，再進(jìn)行樣品氮含量分析。

定期對(duì)儀器進(jìn)行清潔、維護(hù)，延長儀器使用年限。每次檢驗(yàn)完成后，要先對(duì)儀器進(jìn)行降溫再關(guān)掉儀器電源。定期對(duì)儀器進(jìn)行檢查、保養(yǎng)，清潔進(jìn)樣盤、鎳板、球閥、石英橋，及時(shí)清理、更換干燥劑、還原物質(zhì)、灰分管、密封圈等。

3 結(jié) 論

以奶粉為分析對(duì)象，通過一系列單因素試驗(yàn)，建立了杜馬斯燃燒法測(cè)定奶粉中蛋白質(zhì)含量的最佳測(cè)試條件：樣品稱樣量為200 mg，氧氣流量為200 mL/min，通氧時(shí)間為100 s。同時(shí)對(duì)優(yōu)化的測(cè)試條件進(jìn)行驗(yàn)證，精密度及回收率都能滿足實(shí)驗(yàn)所需。將此優(yōu)化條件下的檢測(cè)方法與凱氏定氮法進(jìn)行比較，對(duì)同一奶粉樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)試結(jié)果分析，表明2 種檢測(cè)方法分析結(jié)果無差異性，并且該方法的精密度、準(zhǔn)確度更高，同時(shí)具有樣品消耗少、測(cè)試時(shí)間短、實(shí)驗(yàn)過程綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)進(jìn)行大批量奶粉中蛋白質(zhì)含量分析時(shí)，此優(yōu)化條件下的杜馬斯燃燒法具有更加顯著的優(yōu)勢(shì)。但當(dāng)樣品批數(shù)較少時(shí)，出于前期儀器調(diào)試及檢測(cè)成本等多方考慮，分析人員可酌情選用檢測(cè)方法。