何光華，瞿濤，劉少莉,，劉術(shù)明，郝東海，李歸浦

（1. 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023; 2. 黑龍江貝因美乳業(yè)有限公司，黑龍江 安達 151499；3. 貝因美（杭州）食品研究院有限公司，杭州 310006）

0 引 言

骨質(zhì)疏松癥是常見的骨代謝疾病，其發(fā)病機制可能與患者的年齡、性別、種族、體重、鈣攝入量、活動量、家族史等有關(guān)[1-2]。牛奶中不僅含有促進生長發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)，還有乳糖（Lactose）、酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptides）等影響骨代謝的生物功能性化合物[3-6]，對于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，效果顯著。特別是牛初乳作為一種營養(yǎng)珍品應(yīng)用已超過50 年，研究表明牛初乳不僅蛋白質(zhì)含量高，還含有多種影響免疫、生長發(fā)育和骨骼健康成分[7]。

近些年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)牛初乳中包括免疫球蛋白（Immunoglobulin）、乳鐵蛋白（Lactoferrin）、初乳堿性蛋白（Colostrum Basic Protein, CBP）、乳過氧化物酶（Lactoperoxidase）、溶菌酶（Lysozyme）、生長因子（Growth Factor）、低聚糖（Oligosaccharide）等物質(zhì)[8-11]。其中CBP 是國際上近幾年最新提取成功并用于保健領(lǐng)域的初乳精華，在初乳中含量僅為0.04%，與成熟牛奶相比，牛初乳中CBP 含量更高[7]。研究表明，CBP 可直接作用于骨骼細胞，促進骨骼新陳代謝；協(xié)調(diào)成骨細胞和破骨細胞的活動，保持兩者的動態(tài)平衡，促進骨骼生長，修復(fù)骨質(zhì)；熱處理和消化酶作用不會影響其吸收[12-13]。體外和體內(nèi)研究表明，CBP 含有多種促進骨形成和抑制骨吸收的成分[14-15]，在成骨細胞模型評估中被認為具有促生長的活性蛋白質(zhì)[16-17]，對骨骼的加強有重要的影響。2009 年我國把CBP 列為新資源食品。然而，目前CBP 主要依賴于進口，國內(nèi)對CBP的分離提取工藝的研究非常少，本文在CBP 的分離提取方面開展初步研究，為牛初乳的深加工和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮乳清蛋白粉（來自牛初乳，蛋白質(zhì)≥80%），東營瑞達生物科技有限公司；α-乳白蛋白（L5385）、β-乳球蛋白（L3908），美國Sigma 公司；初乳堿性蛋白（初乳堿性蛋白占乳清蛋白≥50%），新西蘭Seperex NutritionalsTM公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、三聚磷酸鈉、乙二胺四乙酸四鈉鹽、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、鹽酸、過硫酸銨、甘氨酸、考馬斯亮藍R250、甲醇、冰乙酸（均為分析純），上海麥克林生化科技有限公司；5×蛋白上樣緩沖液（DTT）、彩虹180 廣譜蛋白marker、Solarbio BCA 蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾、納濾、反滲透集成系統(tǒng)實驗設(shè)備，合肥格云液體技術(shù)有限公司；H1850 臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；pH 計，上海儀電雷磁；基礎(chǔ)電泳儀電源、Mini-PROTEAN ? Tetra 電泳槽，美國Bio-Rad 公司；冷凍干燥機，上海滬析實業(yè)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分離原理及工藝流程

乳清蛋白中含有約50%β-乳球蛋白、20%α-乳白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白及初乳堿性蛋白等[18-21]。α-乳白蛋白分子量約為14.2 ku，變性溫度為64 ℃左右[22]，在其等電點（pH 值為4.2～4.5）附近時溶解度較低，易聚集[9,23-24]；當pH≤4 的時候，加入螯合劑檸檬酸鈉，其中的鈉離子會把α-乳白蛋白的溶解態(tài)的分子形式變?yōu)槭モ}離子的凝聚態(tài)分子形式，聚集沉淀[25]。β-乳球蛋白分子質(zhì)量約為18.3 ku，變性溫度為78 ℃左右，在其等電點（pH 值為5.1～5.2）附近時溶解度較低[9]；當pH 在3.5～5.2 之間時，β-乳球蛋白存在形式為八聚體，此時β-乳球蛋白溶解度減小而出現(xiàn)聚集沉淀[26-28]，且在溫度60 ℃以上時，β-乳球蛋白的空間折疊結(jié)構(gòu)逐漸被打開，更易于集聚[29-30]。因此，通過pH 值的調(diào)整和保溫處理，可以有效分離α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，再用不同孔徑的膜去除上清液中所含的大分子如免疫球蛋白和乳鐵蛋白及小分子物質(zhì)如游離氨基酸、乳糖等，實現(xiàn)初乳堿性蛋白的分離提取，主要工藝流程如圖1 所示。

圖1 初乳堿性蛋白制備工藝

1.3.2 α-乳白蛋白的分離工藝條件優(yōu)化

將5.0 g 濃縮乳清蛋白粉（來自牛初乳）溶于溫水中，加入1 mol/L 檸檬酸鈉1.94 mL 作為螯合劑，再用1 mol/L 的檸檬酸調(diào)節(jié)pH，定容至50 mL，取40 mL置入50 mL 離心管中放入37 ℃水浴鍋中保溫不同時間，經(jīng)4 000 r/min、30 min 離心后取上清液1 檢測蛋白質(zhì)濃度，具體實驗方案如下：

在保溫時間為120 min 條件下，對pH（3.3、3.5、3.7、3.9、4.1、4.3、4.5、4.7）進行單因素實驗，根據(jù)實驗結(jié)果確定最佳的pH 值；根據(jù)確定的最佳pH，對保溫時間（0、20、40、60、80、100、120、140 min）進行單因素實驗，確定最佳保溫時間。

1.3.3β-乳球蛋白的分離工藝條件優(yōu)化

取去α-乳白蛋白的上清液145 mL，加入1 mol/L的NaOH 溶液調(diào)節(jié)到不同pH 值，并定容至50 mL，取40 mL 置入50 mL 離心管中放入60 ℃的水浴鍋中保溫不同時間，經(jīng)4 000 r/min、30 min 離心后取上清液2 檢測蛋白質(zhì)濃度，具體實驗方案如下：

在保溫時間為60 min 的條件下，對pH（4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4）進行單因素實驗，根據(jù)實驗結(jié)果確定最佳的pH 值；根據(jù)確定的最佳pH，對保溫時間（0、20、40、60、80、100 min）進行單因素試驗，確定最佳保溫時間。

1.3.4 初乳堿性蛋白30 ku 膜分離工藝優(yōu)化

以上清液2 為原料，用30 ku 膜截留，獲得滲透液1。對分離時的膜面流速、操作壓力、循環(huán)次數(shù)進行工藝參數(shù)優(yōu)化，以膜通量（單位時間內(nèi)通過單位膜面積上的流體量，單位為L/ (m2·h)）、滲透液1 蛋白質(zhì)總量（單位為g）為評價指標。

1.3.4.1 膜面流速條件優(yōu)化

將上清液2 配置3 L 蛋白質(zhì)濃度為4 g/L 的料液，在操作壓力0.15 MPa 條件下，調(diào)整不同的膜面流速，分別為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 L/min。用30 ku 膜截留，獲得其滲透液，以膜通量為評價指標，獲得最優(yōu)膜面流速。

1.3.4.2 操作壓力條件優(yōu)化

將上清液2 配置3 L 蛋白質(zhì)濃度為4 g/L 的料液，在單因素結(jié)果最佳膜面流速條件下，調(diào)整不同的操作壓力，分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 MPa。用30 ku 膜截留，獲得其滲透液，以膜通量為評價指標，獲得最優(yōu)操作壓力。

1.3.4.3 循環(huán)次數(shù)條件優(yōu)化

將上清液2 配置3 L 蛋白質(zhì)濃度為4 g/L 的料液，在單因素結(jié)果最佳膜面流速、最佳操作壓力條件下，采用不同循環(huán)次數(shù)，滲透液每到1 L 進行取樣、補水、記錄時間，每3 次補水為循環(huán)1 次，分別循環(huán)1、2、3、4 次，用30 ku 膜截留，獲得其滲透液，以循環(huán)結(jié)束時滲透液中的蛋白質(zhì)含量為評價指標，獲得最優(yōu)循環(huán)次數(shù)。

1.3.4.4 正交實驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計3 因素3 水平正交試驗，來進一步優(yōu)化膜分離工藝，按正交試驗方案進行初乳堿性蛋白膜分離，并取樣進行分析，以滲透液1中的蛋白質(zhì)總量為評價指標。

1.3.5 初乳堿性蛋白1 ku 膜分離工藝優(yōu)化

根據(jù)滲透液1 的膜通量，調(diào)整二級膜的膜面流速和操作壓力，使兩級膜分離速度達到平衡，獲得截留液2。

1.3.6 截留液2 的冷凍干燥

將截留液2 置于-20 ℃冰箱中冷凍24 h 后，放入冷凍干燥機-80 ℃的冷井中凍2～3 h 后，置于上方干燥倉中，抽真空直至干燥。

1.3.7 蛋白質(zhì)含量分析

采用BCA 法測定各個操作過程中的蛋白質(zhì)含量。將所取樣品經(jīng)過一定比例稀釋后，加樣于96 孔板，再加入BCA 工作液，按照試劑盒的操作說明繪制標準曲線并進行樣品蛋白質(zhì)含量的檢測[31]，最低檢測線為0.05 g/L。

1.3.8 凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

采用SDS-PAGE 對蛋白組成做定性分析。所有樣品均取1 g/L 的濃度與樣品緩沖液（體積比4∶1 混合），沸水浴10 min，其分離膠質(zhì)量分數(shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)為5%，取10 μL 上樣，濃縮膠和分離膠的電壓分別為60 V 和120 V。電泳結(jié)束后，將凝膠置于配好的染色液中染色2 h 后，倒出染色液，加入脫色液在搖床上脫色，3～4 h 后換一次脫色液，直至背景色完全消失，條帶清晰可見。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 和溫度對α-乳白蛋白分離效果的影響

2.1.1 pH

在37 ℃保溫時間120 min 條件下進行pH 值對α-乳白蛋白分離效果的影響評價，由圖2 可知，隨著pH 上升上清液1 中蛋白質(zhì)濃度先降后升，當pH為3.9 時，上清液1 中蛋白質(zhì)濃度最低，說明當pH=3.9時，α-乳白蛋白的分離效果較好。

圖2 pH 對α-乳白蛋白分離效果的影響

2.1.2 保溫時間

在pH=3.9 保溫溫度為37 ℃的條件下，進行保溫時間對α-乳白蛋白分離效果的影響評價，由圖3可知，隨著保溫時間的延長，上清液1 中蛋白質(zhì)濃度逐漸降低，當保溫時間達到100 min 后，上清液1 中蛋白質(zhì)濃度下降趨勢變緩，考慮受熱時間對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，確定保溫時間為100 min。

圖3 保溫時間對α-乳白蛋白分離效果的影響

初始配置的乳清蛋白溶液蛋白質(zhì)濃度為76.2 mg/mL，在pH=3.9、保溫100 min 條件下，上清液1 中蛋白質(zhì)濃度下降到（41.3±0.6）mg/mL，表明乳清蛋白中蛋白質(zhì)（α-乳白蛋白和部分β-乳球蛋白） 分離率約為45.8%。

2.2 pH 和溫度對β-乳球蛋白分離效果的影響

2.2.1 pH

在60 ℃保溫時間60 min 條件下，進行pH 值對β-乳球蛋白分離效果的評價，由圖4 可知，隨著pH上升上清液2 中蛋白質(zhì)濃度先降后升，當pH 為4.8時，上清液2 中蛋白質(zhì)濃度最低，說明當pH 為4.8時，β-乳球蛋白的分離效果較好。

圖4 pH 對β-乳球蛋白分離效果的影響

2.2.2 保溫時間

在pH 為4.8 保溫溫度為60 ℃的條件下，進行保溫時間對β-乳球蛋白分離效果的評價，由圖5 可知，隨著保溫時間的延長，上清液2 中蛋白質(zhì)濃度逐漸降低，當保溫時間達到80 min 后，上清液2 中蛋白質(zhì)濃度下降趨勢變緩，考慮受熱時間對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，確定保溫時間為80 min。

圖5 保溫時間對β-乳球蛋白分離效果的影響

在pH 為4.8、保溫80 min 條件下，上清液2 中蛋白質(zhì)濃度下降至（29.7±0.4）mg/mL，蛋白質(zhì)（主要是β-乳球蛋白）的分離率為20.1%，表明經(jīng)過2 次pH 調(diào)整和保溫處理后，乳清蛋白中蛋白質(zhì)的分離率達到56.7%。由于在乳清蛋白中，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白所占70%左右[32-33]。因此從乳清蛋白分離率上看，可以認為經(jīng)過2 次pH 調(diào)整和保溫處理后，已去除大部分的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。

2.3 30 ku 膜分離條件對分離效果的影響

2.3.1 膜面流速

在蛋白質(zhì)濃度為4.0 mg/mL，操作壓力為0.15 MPa條件下，進行不同的膜面流速對初乳堿性蛋白30 ku膜分離效果評價，由圖6 可知，隨著時間延長，在不同膜面流速條件下膜通量均呈下降趨勢，在30～40 min左右膜通量趨于穩(wěn)定。圖6 中可以看出，當膜面流速為6.5 L /min 時，在所選條件中膜通量最高，因此，本實驗確定膜面流速為6.5 L/min。

圖6 不同膜面流速對膜通量的影響

理論上來說膜面流速增加會減弱濃差極化，增加膜通量，但過大的料液流速會使膜面有效壓力損失增大，膜表面流體產(chǎn)生的剪切力增大，凝膠層阻力降低，同時，較高的膜面流速，強化了膜的傳質(zhì)作用，降低了邊界層厚度及邊界層阻力[34-35]，從而會導(dǎo)致膜通量略有下降。

2.3.2 操作壓力

在蛋白質(zhì)濃度為4.0 mg/mL，膜面流速為6.5 L/min條件下，進行不同的操作壓力對初乳堿性蛋白30 ku膜分離效果評價，由圖7 可知，隨著操作壓力增加，膜通量也逐漸增加，并且在0.5 MPa 時候趨穩(wěn)定，而且操作壓力過高對于整個膜系統(tǒng)來說是一種損傷。因此，本實驗確定操作壓力為0.5 MPa。

圖7 不同操作壓力對膜通量的影響

在膜分離的過程中，超濾操作壓力增大，膜分離推動力增強，膜通量增大，當操作壓力達到一定值后，由于大分子溶質(zhì)吸附積聚成的凝膠層厚度和致密度加大，膜被壓密，傳質(zhì)阻力增大，導(dǎo)致滲透通量增加減緩并逐漸平穩(wěn)不變[36-39]。

2.3.3 循環(huán)次數(shù)

在蛋白質(zhì)濃度為4.0 g/L，膜面流速為6.5 L/min，操作壓力為0.5 MPa 條件下進行不同循環(huán)次數(shù)對初乳堿性蛋白30 ku 膜分離效果評價，本次實驗一共做了4 組循環(huán)，如圖8 在最后一次補水之后，其蛋白質(zhì)濃度已經(jīng)下降到檢測線以下，因此，本實驗確定循環(huán)次數(shù)為4 次。

圖8 循環(huán)次數(shù)對于滲透液蛋白質(zhì)濃度的影響

2.3.4 正交實驗

在單因素試驗的結(jié)果中上，以滲透液1 蛋白質(zhì)總量作為評價標準，設(shè)計正交實驗如表1，結(jié)果如表2，分析如表3 所示。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗結(jié)果

表3 正交實驗結(jié)果方差分析

由表2 極差分析可知，各因素對滲透液1 蛋白質(zhì)總量的影響主次順序為A＞B＞C，即膜面流速影響最大，循環(huán)次數(shù)影響次之，操作壓力影響最小。進一步的方差分析表明，膜面流速對滲透液1 蛋白質(zhì)總量的影響顯著，循環(huán)次數(shù)次之，而操作壓力對滲透液1 蛋白總量影響不顯著。優(yōu)化后的分離條件為：膜面流速6.5 L/min；循環(huán)次數(shù)5 次；操作壓力0.5 MPa。

鑒于最優(yōu)工藝水平組合不在正交試驗設(shè)計方案的工藝水平組合實施范圍之內(nèi)，按最優(yōu)工藝進行重復(fù)試驗后，所得滲透液1 蛋白質(zhì)總量為(0.795±0.015) g，初乳堿性蛋白透過率為(6.6±0.1)%。

在單因素實驗中，隨著操作壓力的增大，滲透通量增加減緩并逐漸平穩(wěn)不變。但是正交實驗中隨著操作壓力增大，蛋白質(zhì)的滲透率會有一定的下降，這可能與高壓力下形成的濾餅層有關(guān)系，濾餅層加厚會導(dǎo)致分離效果的下降。也有相關(guān)的研究表明濾餅層被壓縮時，膜對蛋白質(zhì)的透過性降低[40]。

2.4 1 ku 膜分離效果的影響

在這步膜分離的過程中，選擇1 ku 的膜，主要去除小分子的物質(zhì)如游離氨基酸、乳糖、礦物質(zhì)等，同時將溶液濃縮，提高蛋白質(zhì)的濃度。根據(jù)實驗結(jié)果，當料液經(jīng)過1 ku 的膜，兩級膜分離達到平衡時，膜面流速為6.5 L/min、操作壓力為0.8 MPa。

當循環(huán)結(jié)束后，截留液2 體積為0.8 L，蛋白質(zhì)濃度為0.942 g/L，蛋白質(zhì)的截留率為94.80%。

2.5 截留液2 的冷凍干燥

將截留液2 放入冷凍干燥機中，24 h 后取出，得到初乳堿性蛋白粉。根據(jù)實驗結(jié)果計算提取率為2.12%。

2.6 SDS-PAGE 結(jié)果

如圖9 所示，本實驗得到的初乳堿性蛋白的分子質(zhì)量分布主要集中在20 ku，而市售初乳堿性蛋白含有部分大于30 ku 的蛋白質(zhì)，此方法制備的初乳堿性蛋白，其去除α-乳白蛋白，β-乳球蛋白這2 種蛋白較為徹底，獲得的初乳堿性蛋白的純度較高。

圖9 各樣品蛋白質(zhì)濃度為1 g/L 的SDS-PAGE 對比結(jié)果

3 結(jié) 論

本實驗采用來自牛初乳的濃縮乳清蛋白為原料，根據(jù)乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特性，以檸檬酸鈉為螯合劑、檸檬酸以及氫氧化鈉為酸堿調(diào)節(jié)劑，乳清蛋白在溫度37 ℃、pH 值為3.9 保溫100 min和60 ℃、pH 值為4.8 保溫80 min 條件下，通過離心沉淀分離了56.7%的蛋白質(zhì)（包括α-乳白蛋白和β-乳球蛋白）。

通過單因素實驗和正交試驗確定，用30 ku 膜從去α-乳白蛋白和β-乳球蛋白上清液提取初乳堿性蛋白的條件為：膜面流速為6.5 L/min，操作壓力為0.5 MPa，循環(huán)次數(shù)為5 次，初乳堿性蛋白的提取率為6.6%。30 ku 膜分離后滲透液再用1 ku 膜以膜面流速為6.5 L/min，操作壓力為0.8 MPa 條件截留去除小分子物質(zhì)，獲得截留液，初乳堿性蛋白的截留率為94.80%。

通過SDS-PAGE 分析，本實驗得到的初乳堿性蛋白的分子質(zhì)量分布主要集中在20 ku，去除α-乳白蛋白和β-乳球蛋白較為徹底，整個分離提取可獲得初乳堿性蛋白占濃縮乳清蛋白的比例為2.12%。