馮寅潔，黃銀波，周小清，陳偉，胡慧，蔡霞，喬勇升

（泰州市食品檢驗院，江蘇 泰州 225300）

0 引 言

脂溶性維生素是機(jī)體維持生命活動必需的營養(yǎng)物質(zhì)。維生素A 又稱視黃醇，具有促進(jìn)視覺發(fā)育、維護(hù)上皮細(xì)胞穩(wěn)定和促進(jìn)骨骼生長等功能[1-2]。維生素A 缺乏是世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的全球四大營養(yǎng)素缺乏癥之一。機(jī)體因無法自主合成維生素A，若日常飲食不當(dāng)，會造成維生素A 不足[3]。維生素A 對光、氧氣、酸和高溫較敏感[4]，通常以相對穩(wěn)定的維生素A 醋酸酯或維生素A 棕櫚酸酯等作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑加入食品中。維生素E 又名生育酚，其中以α-生育酚的生物活性為最高[5]。維生素E 具有抗氧化、抗衰老和促生育等功能[6-7]，可保護(hù)大腦神經(jīng)元、預(yù)防和治療炎癥[8-9]。α-生育酚或混合生育酚可作為食品中的抗氧化劑或營養(yǎng)強(qiáng)化劑。正常人群中很少出現(xiàn)維生素E 缺乏癥，多出現(xiàn)在脂肪代謝障礙或脂肪吸收不良的群體中[10]。如果過量服用同樣會引起健康問題，如維生素A 過量攝入可能導(dǎo)致肝脾腫大、顱內(nèi)壓增高等[10]，維生素E 長期超劑量攝入可能造成胃腸功能紊亂等[11]。為充分保證嬰幼兒配方食品營養(yǎng)有效性和保障嬰幼兒營養(yǎng)的安全性，2023 年實施的嬰幼兒配方食品系列標(biāo)準(zhǔn)修改了產(chǎn)品中維生素A 和E 含量的最小值和最大值。準(zhǔn)確測定配方乳粉中維生素的含量，成為生產(chǎn)企業(yè)和檢測機(jī)構(gòu)工作的重點。

現(xiàn)階段根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[12]，實驗室廣泛采用的檢測方法主要是液相色譜法。配方乳粉基質(zhì)復(fù)雜，提取維生素A、E 需要先經(jīng)過皂化、萃取、水洗、濃縮等步驟，但皂化不完全、萃取和水洗易乳化等問題嚴(yán)重影響脂溶性維生素的提取效果，脫水和定容過程的多步操作增加了有機(jī)溶劑的揮發(fā)，且易導(dǎo)致維生素?fù)p失率加大。劉慧敏等[4]用薄層層析法分離母乳中的維生素A 和E，李彬等[13]用固相萃取代替液-液萃取提取乳粉中脂溶性維生素，K PRZYGODA 等[14]用超臨界流體萃取法提取種子油中生育酚，這些方法尚處于探索階段，未被廣泛應(yīng)用。測定脂溶性維生素含量的方法有分光光度法[15]、氣相色譜法[16]、液相色譜法[17-18]、氣質(zhì)聯(lián)用法[19]、液質(zhì)聯(lián)用法[20]等。維生素A 和維生素E都含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)和長的脂肪族烴鏈，該體系離域電子易激發(fā)，具有熒光性[21]，可根據(jù)此種特性用熒光法測定，與紫外法相比，特異性強(qiáng)、干擾少、檢出限更低。本文以配方乳粉為基質(zhì)，探索建立有針對性的前處理條件，采用超高效液相色譜串聯(lián)大體積流通池?zé)晒鈾z測器測定維生素A 和E 的含量。與國標(biāo)液相法相比，可減少皂化不完全、容易乳化和多步操作致目標(biāo)物損失等問題，檢出限明顯降低。該方法可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高，能夠滿足對配方乳粉的脂溶性維生素進(jìn)行批量準(zhǔn)確分析的要求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與材料

視黃醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.0%），上海麥克林生化科技有限公司；α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇（色譜純），德國Merck 公司；無水乙醇、氫氧化鉀、抗壞血酸、2, 6-二叔丁基對甲酚（BHT）、石油醚（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；嬰幼兒配方乳粉質(zhì)控樣品，大連中食國實檢測技術(shù)有限公司；配方乳粉，市售。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY H-CLASS UPLC 超高效液相色譜儀串聯(lián)二極管陣列（PDA）檢測器和大體積流通池?zé)晒鈾z測器，美國Waters 公司；XS204 電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；島津UV-2550 紫外可見分光光度計，島津（上海）實驗器材有限公司；Milli-Q Reference 超純水機(jī)，美國Millipore 公司；SHA-C 恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；RV 10 basic 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取5 g 配方奶粉于錐形瓶中，加入20 mL 45～50 ℃水，混勻，再加入1.0 g 抗壞血酸和0.1 g BHT，混勻，依次加入30 mL 無水乙醇和20 mL 50%氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，混勻后于80 ℃恒溫水浴振蕩皂化40 min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。用石油醚100 mL 萃取兩次，合并萃取液，分別用100 mL 水洗3次，收集醚層，在40 ℃減壓旋蒸至瓶內(nèi)醚液約1～2 mL時取下旋蒸瓶，用氮氣吹至近干。準(zhǔn)確加入10 mL 甲醇，超聲溶解瓶內(nèi)殘渣并混勻，過0.22 μm 有機(jī)系濾膜，待上機(jī)測定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量維生素A 和維生素E 標(biāo)準(zhǔn)品，分別用無水乙醇溶解并定容至50 mL，配成維生素A 濃度約0.5 mg/mL、維生素E 濃度約1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。臨用前參考GB 5009.82—2016 附錄方法對儲備液進(jìn)行校正，得出準(zhǔn)確濃度[12]。分別吸取維生素A 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.00 mL 和維生素E 標(biāo)準(zhǔn)儲備液5.00 mL 于同一50 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到維生素A 和維生素E 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，將標(biāo)準(zhǔn)中間液用甲醇進(jìn)行稀釋，配成維生素A 濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL，維生素E 濃度為2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 液相色譜條件

Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm），柱溫30 ℃；流動相為甲醇-水（V甲醇∶V水=95∶5）；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；二極管陣列檢測器波長：維生素A 325 nm，維生素E 294 nm，掃描波長190～400 nm；熒光檢測器維生素A 激發(fā)波長328 nm，發(fā)射波長440 nm；維生素E 激發(fā)波長294 nm，發(fā)射波長328 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個處理做6 次平行。借助Empower 3 色譜數(shù)據(jù)軟件分析色譜圖，檢測數(shù)據(jù)通過Excel 軟件處理，繪圖和分析采用Origin 2018 軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 皂化條件的優(yōu)化

脂溶性維生素對外界條件如光照、氧氣等敏感，試驗過程應(yīng)注意避光，減少樣品在空氣中暴露的時間。皂化過程除去了乳粉中脂肪的干擾，將脂溶性維生素從乳脂肪中脫離出來，并將維生素酯類化合物轉(zhuǎn)化為同一形態(tài)的維生素[11]，從而提高提取效率，便于分析和定量。分別對加堿量、皂化溫度和皂化時間進(jìn)行單因素優(yōu)化，其余操作參照1.2.1，以配方乳粉中維生素A 和E 的測定值作為考察指標(biāo)。

2.1.1 加堿量

分別添加50%氫氧化鉀溶液5、10、15、20、25、30 mL，80 ℃皂化40 min，考察加堿量對配方乳粉維生素A 和維生素E 測定值的影響。試驗發(fā)現(xiàn)，加入5 mL堿液的處理組皂化液中有較多棕色或黑色沉淀，溶劑萃取后分層不理想。不斷提高堿液量，皂化液中沉淀減少，液體色澤趨于均勻的棕色，當(dāng)加堿量達(dá)到15 mL 及以上時，皂化效果理想，溶劑萃取后有明顯的分層。如圖1 所示，隨著堿液量的增加，維生素A 和維生素E測定值均不斷提高。當(dāng)堿液添加量為20 mL 時，維生素A 和維生素E 的測定值趨于穩(wěn)定，說明皂化反應(yīng)基本完全。

圖1 加堿量對配方乳粉維生素測定值的影響

2.1.2 皂化溫度

添加堿液20 mL，分別在60、65、70、75、80、85、90 ℃皂化40 min，皂化溫度對配方乳粉維生素A 和維生素E 測定值的影響如圖2 所示。隨著皂化溫度升高，維生素A 測定值逐漸增加，80 ℃皂化處理組的維生素A 測定值最高，之后維生素A 測定值略下降；維生素E 測定值隨著皂化溫度上升而不斷增加，在80～90 ℃高溫環(huán)境下性質(zhì)較穩(wěn)定。試驗表明，提高皂化溫度有利于加速皂化反應(yīng)，但是過高溫度可能會影響維生素的穩(wěn)定性[22]，特別是視黃醇結(jié)構(gòu)會被破壞[23]，維生素A 測定值減小。綜合考慮2 種維生素測定值的變化趨勢，確定皂化溫度為80 ℃。

圖2 皂化溫度對測定值的影響

2.1.3 皂化時間

添加堿液20 mL，在80 ℃分別皂化30、35、40、45、50、55、60 min，皂化溫度對配方乳粉維生素A 和維生素E 測定值的影響如圖3 所示。隨著皂化時間的延長，維生素A 測定值先升高后下降，皂化40 min 處理組的維生素A 測定值最高，之后測定值逐漸降低；皂化時間達(dá)到40 min 后，各處理組的維生素E 測定值為13.49～13.62 mg/100 g，在P=0.05 水平下，無顯著性差異。結(jié)合測定結(jié)果和實驗效率，選擇皂化時間為40 min。

圖3 皂化時間對測定值的影響

岑建斌等[24]提取嬰幼兒乳粉中脂溶性維生素，選擇55%氫氧化鉀溶液于55 ℃皂化1 h。尹丹陽等[25]測定肉制品中脂溶性維生素，選擇50%氫氧化鉀溶液于80 ℃皂化30 min。王天嬌等[26]檢測保健食品中維生素D3，發(fā)現(xiàn)低于80 ℃需要延長皂化時間，高于80 ℃容易使待測物質(zhì)氧化。通過觀察皂化效果和考察維生素A 和維生素E 測定值的變化趨勢，本文選擇50%氫氧化鉀溶液20 mL 于80 ℃皂化40 min 為最佳皂化條件。

2.2 提取、洗滌和濃縮條件的優(yōu)化

比較正己烷、石油醚、石油醚-乙醚混合液（V石油醚∶V乙醚=1∶1）萃取皂化液發(fā)現(xiàn)，對于反應(yīng)較完全、沉淀較少的皂化液用3 種溶劑萃取均可呈現(xiàn)明顯的分層，而皂化反應(yīng)不完全、有較多沉淀物的渾濁液體用石油醚-乙醚混合液萃取后分層效果最好，正己烷、石油醚萃取后中間有乳化層。正己烷毒性較其他2 種溶劑大，單個樣品萃取需200 mL，大量使用對人體和環(huán)境有害。皂化條件經(jīng)過優(yōu)化后反應(yīng)較完全，因此本試驗選用石油醚作為提取溶劑。

用100 mL 水洗滌醚層，待分層后棄去下面的水層，再重復(fù)水洗2 次，可將醚層由堿性洗至中性。GB 5009.82—2016 未明確水洗的具體操作方法。試驗發(fā)現(xiàn)，初次和第2 次水洗若按液液萃取方式振搖，容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。多次嘗試后認(rèn)為，初次可豎直持分液漏斗順時針或逆時針方向輕輕搖動，靜置待分層。第2 次可持分液漏斗兩端，緩慢上下顛倒，靜置。第3次水洗可適當(dāng)加大幅度進(jìn)行斜面振蕩。每次水洗振蕩幾次后需及時打開分液漏斗頂塞或活塞放氣，避免氣液混合物在壓力下沖出塞子造成目標(biāo)物損失。

國標(biāo)方法中醚液需經(jīng)無水硫酸鈉脫水。實驗發(fā)現(xiàn)脫水速度較慢，石油醚通過無水硫酸鈉時易揮發(fā)到空氣中，且需再用石油醚洗無水硫酸鈉，操作時間較長。本實驗在水洗后棄去水層，可向下放一點醚層以完全沖去分液漏斗中的水。若漏斗頸內(nèi)壁附著水滴，可塞入細(xì)濾紙條吸除。然后將醚層放入旋蒸瓶中，再用少量石油醚沖洗分液漏斗，并入旋蒸瓶。此法省去了用無水硫酸鈉脫水的步驟，操作簡單、便捷，石油醚的損失較國標(biāo)方法少。減壓濃縮、氮氣吹至近干后直接準(zhǔn)確加入10 mL 甲醇，避免多次溶解轉(zhuǎn)移至容量瓶，從而減小損失。

2.3 流動相條件的選擇

配方乳粉中維生素E 的檢出形式一般只有α-生育酚，不需要分離異構(gòu)體，本試驗選用HSS T3 色譜柱，流動相采用等度洗脫模式。比較了甲醇、甲醇-水（V甲醇∶V水=95∶5）、甲醇-水（V甲醇∶V水=90∶10）為流動相，流速0.4 mL/min 時目標(biāo)物的出峰時間。發(fā)現(xiàn)甲醇洗脫下，維生素A 出峰時間太快，與干擾峰相近，影響定量。甲醇-水（V甲醇∶V水=90∶10）條件下，維生素E 出峰時間在20 min 左右，進(jìn)樣時間較長。綜合考慮，選擇流動相條件為甲醇-水（V甲醇∶V水=95∶5），進(jìn)樣時間為18 min。標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液熒光色譜圖分別如圖4、圖5 所示。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光色譜

圖5 樣品溶液熒光色譜

2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按濃度由低到高依次進(jìn)樣，比較用大體積流通池?zé)晒鈾z測器和二極管陣列檢測器測定，維生素A 和維生素E 響應(yīng)值的差異。以峰面積為縱坐標(biāo)Y，濃度為橫坐標(biāo)X 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算線性相關(guān)系數(shù)r。分別以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）確定檢出限和定量限。由表1 可見，維生素A 和維生素E 通過熒光法和紫外法測定的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r 均大于0.999。本試驗用2 種檢測器測定維生素A 和維生素E 的檢出限均比GB 5009.82—2016 第一法的低，特別是熒光法大大降低了維生素E 的檢出限，測定維生素E 的靈敏度是紫外法的30 倍。脂溶性維生素特別是維生素E 含量較低的樣品可用熒光檢測器測定。

表1 維生素A、E 的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 回收率和精密度

按照1.2.1 前處理，測定配方乳粉基質(zhì)中維生素A、維生素E 含量，再分別向配方乳粉中加入3 個濃度水平的維生素A、維生素E 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，基質(zhì)樣品和每個加標(biāo)水平的樣品重復(fù)測定6 次。經(jīng)檢測，配方乳粉基質(zhì)中維生素A 為476 μg/100g，維生素E 為13.56 mg/100g。加標(biāo)回收率結(jié)果如表2 所示，2 種脂溶性維生素的加標(biāo)回收率為85.2%～103.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～5.6%。

表2 維生素A、維生素E 加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.6 樣品測定

采用本方法檢測10 批配方乳粉，測定值、標(biāo)示值、測定值與標(biāo)示值的比值R 如表3，其中樣品編號1 號為嬰幼兒配方乳粉質(zhì)控樣品，2～4 號為女士配方奶粉，5～7 為中老年配方奶粉。質(zhì)控樣品的測定值與標(biāo)示值接近，表明該方法測定的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。依據(jù)GB 28050—2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則》，食品中的維生素A 允許誤差范圍為80%～180%的標(biāo)示值，食品中維生素E 允許誤差范圍為不低于80%的標(biāo)示值。表3 中，2～7 號配方乳粉中維生素A 測定值與標(biāo)示值的比值R 為89%～110%，維生素E 的比值R 為92%～120%，均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 樣品測定值與標(biāo)示值的比較

3 結(jié) 論

優(yōu)化了配方乳粉基質(zhì)中提取維生素A 和維生素E 的皂化條件，如加堿量、皂化溫度和皂化時間等，解決了皂化不完全的問題，避免在長時間的強(qiáng)堿、高溫環(huán)境下維生素大量損失。提取、水洗和濃縮條件是在GB 5009.86—2016 第一法的基礎(chǔ)上，結(jié)合實際操作經(jīng)驗得出的優(yōu)化方法，能有效避免乳化現(xiàn)象，減少多步操作帶來的誤差。

采用紫外法檢測，同一濃度下，維生素E 的響應(yīng)值明顯低于維生素A，峰型不如維生素A 尖銳。建立了超高效液相色譜-大體積流通池?zé)晒鈾z測器測定配方乳粉中維生素A 和維生素E 的方法。大體積流通池?zé)晒鈾z測器專屬性強(qiáng)、雜峰干擾少，可顯著提高目標(biāo)物的響應(yīng)值。試驗中熒光法測定維生素A 檢出限0.6 μg/100 g、維生素E 檢出限0.8 μg/100 g，均明顯低于國標(biāo)第一法的檢出限。方法加標(biāo)回收率和精密度良好，適用于多種系列配方乳粉中維生素A 和維生素E 的含量測定。