陳瑤 鄭才斌

白色念珠菌（Candida albicans）是一種常見的條件致病性真菌，在臨床上廣泛存在并引起各種感染，特別是對免疫功能低下的患者具有重要的致病性。然而，近年來，白色念珠菌對抗真菌藥物的耐藥性問題逐漸引起關(guān)注。耐藥性的出現(xiàn)不僅給治療帶來了挑戰(zhàn)，還可能導(dǎo)致治療失敗和疾病復(fù)發(fā)[1-2]。研究顯示，白色念珠菌是侵襲性念珠菌病的主要病原菌，也是醫(yī)院獲得性真菌感染的主要致病菌[3-4]。目前，在臨床治療中，唑類抗真菌藥物仍然是一線治療藥物，常見的有伏立康唑、氟康唑、伊曲康唑等。這些藥物的作用機(jī)制主要是通過干擾真菌細(xì)胞的麥角固醇合成來抑制真菌的生長和繁殖。麥角固醇是真菌細(xì)胞壁的重要組成成分，它在維持菌體結(jié)構(gòu)和功能上起著關(guān)鍵作用。唑類抗真菌藥物通過抑制麥角固醇合成酶（14α-脫甲基酶）的活性，阻斷了麥角固醇的合成，導(dǎo)致真菌細(xì)胞壁的形成受到影響，從而使真菌無法正常生長和繁殖。白色念珠菌的致病性與多種毒力因子密切相關(guān)，這些毒力因子協(xié)同作用，使得白色念珠菌能夠逃避宿主的免疫反應(yīng)，侵襲和定植于宿主組織，并引起感染[5-6]。因此，在治療白色念珠菌感染時，除了選擇合適的抗真菌藥物外，還需要考慮控制和干擾這些毒力因子的策略，以提高治療效果。耐藥性是指白色念珠菌對抗真菌藥物的敏感性降低，從而導(dǎo)致藥物治療失效或需要使用更高劑量或更毒性的藥物來進(jìn)行治療。耐藥性的出現(xiàn)主要是由于白色念珠菌的遺傳變異和選擇壓的作用[7]。本研究旨在探索白色念珠菌的耐藥性模式，并深入研究耐藥性與致病性之間的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究回顧性地分析2020 年1 月—2023 年3 月從臨床無菌部位（如胸腹水、引流液、膽汁）和血液標(biāo)本中分離出的125 株經(jīng)準(zhǔn)確鑒定的白色念珠菌。包括白色念珠菌ATCC90028 和近平滑假絲酵母菌ATCC22019。

1.2 方法

為了進(jìn)行抗真菌藥物的耐藥性檢測，采用微量肉湯稀釋法。

（1）配制RPMI 1640 培養(yǎng)基。準(zhǔn)備所需材料：RPMI 1640 培養(yǎng)基粉末、蒸餾水、無菌量筒或燒瓶、調(diào)節(jié)pH 的緩沖液（如無菌的1 M HEPES 緩沖液）、CO2培養(yǎng)箱或無菌操作臺。粉末溶解：根據(jù)需要的量，稱取適量的RPMI 1640 培養(yǎng)基粉末，并將其轉(zhuǎn)移到一個干凈的容器中。加入蒸餾水：將適量的蒸餾水加入容器中，按照粉末與水的比例（通常是1 g 粉末配制成1 L 培養(yǎng)基），攪拌或搖晃容器，使粉末充分溶解。調(diào)節(jié)pH：使用調(diào)節(jié)pH 的緩沖液（如1 M HEPES 緩沖液），逐漸調(diào)節(jié)RPMI 1640 培養(yǎng)基的pH 值至所需的范圍（通常為7.2 ～7.4）。使用pH 計(jì)進(jìn)行測量和調(diào)節(jié)，小心避免pH 劇烈波動。無菌過濾：將配制好的RPMI 1640 培養(yǎng)基通過0.22 μm 的濾膜無菌過濾器過濾，以去除潛在的微生物污染。瓶裝和儲存：將過濾后的RPMI 1640 培養(yǎng)基分裝到無菌培養(yǎng)瓶或離心管中，并密封好。標(biāo)注瓶上的培養(yǎng)基類型、配制日期和保存條件。一般而言，RPMI 1640 培養(yǎng)基可以在4℃下保存數(shù)周，或在-20℃或更低溫度下冷凍保存。

（2）藥液配制。準(zhǔn)備所需藥物：根據(jù)試驗(yàn)需要，準(zhǔn)備需要測試的抗菌藥物。通常使用已知的標(biāo)準(zhǔn)藥物粉末，按照實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的規(guī)程和藥物配方進(jìn)行準(zhǔn)備。藥物溶解：稱取適量的抗菌藥物粉末，如準(zhǔn)備相應(yīng)的抗真菌藥物的藥粉，如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B 和5-氟尿嘧啶等，并將其溶解于適量的溶劑中。溶劑可以是培養(yǎng)基、生理鹽水或其他適當(dāng)?shù)娜芤骸４_保將藥物充分溶解，并形成均一的溶液。稀釋藥物：根據(jù)試驗(yàn)要求和藥物的預(yù)期濃度范圍，將藥物溶液進(jìn)行逐級稀釋。通常采用2 倍稀釋的方法，將藥物的濃度逐漸降低。加入培養(yǎng)基：將稀釋后的藥物溶液加入RPMI 1640 培養(yǎng)基中，使得最終藥物濃度和培養(yǎng)基充分混合?？梢愿鶕?jù)試驗(yàn)需求，在培養(yǎng)基中的不同孔中添加不同濃度的藥物。混勻：輕輕搖晃或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)基和藥物的混合物，確保藥物在培養(yǎng)基中均勻分布。滅菌：通過過濾或高溫滅菌方法，確保配制好的藥物溶液是無菌的。使用0.22 μm 濾膜過濾器將藥物溶液過濾，以去除潛在的微生物污染。校驗(yàn)藥液濃度：可使用適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄈ绫壬ɑ蚬饷芏扔?jì)）對配制好的藥液濃度進(jìn)行校驗(yàn)，確保藥液濃度與試驗(yàn)要求相符。實(shí)驗(yàn)使用：將配制好的藥液用于體外藥敏試驗(yàn)或其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)中。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作要求，在試驗(yàn)板或培養(yǎng)皿中加入適量的藥液和細(xì)菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（3）菌液配置。培養(yǎng)菌株：首先，準(zhǔn)備需要測試的真菌菌株。可以從已有的純培養(yǎng)菌株中選擇合適的菌株，或者進(jìn)行新鮮分離培養(yǎng)。培養(yǎng)基準(zhǔn)備：配制適合真菌生長的培養(yǎng)基，常用的培養(yǎng)基包括Sabouraud 葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、Malt Extract 瓊脂培養(yǎng)基等。按照培養(yǎng)基配方的要求準(zhǔn)備，并進(jìn)行無菌處理。菌液接種：從培養(yǎng)基上挑取一株純培養(yǎng)的真菌菌株，用無菌的接種環(huán)或接種針將菌株轉(zhuǎn)移到無菌的培養(yǎng)基上。注意每次接種只轉(zhuǎn)移一小塊菌落或一小團(tuán)孢子。培養(yǎng)菌株：將接種好的培養(yǎng)基含菌培養(yǎng)皿在適當(dāng)?shù)臏囟认屡囵B(yǎng)，一般為25 ～30℃，培養(yǎng)時間根據(jù)具體菌株和實(shí)驗(yàn)需求而定。菌株應(yīng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下生長至足夠的菌量。菌液懸浮：從培養(yǎng)好的菌株中挑取適量的菌落或孢子，加入一定體積的生理鹽水或緩沖液中。使用無菌的注射器或移液器將菌落均勻地懸浮在液體中，形成菌液。菌液濃度調(diào)整：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，通過逐級稀釋的方法將菌液進(jìn)行濃度調(diào)整。通常采用2 倍稀釋的方法，將菌液的濃度逐漸降低，以獲得所需的菌液濃度。菌液保存：將調(diào)整好濃度的菌液分裝到無菌試管或培養(yǎng)皿中，密封保存。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，可以將菌液在低溫下保存，避免菌株的變異和降低菌液的活性。

（4）操作步驟。準(zhǔn)備無菌U 型96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板：獲取無菌的U 型96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。在每一排的第1 ～12 孔中，加入100 μL RPMI 1640 培養(yǎng)基，最后一排的第12 孔作為空白對照。配制藥液：根據(jù)所需藥物的濃度，在適當(dāng)?shù)娜萜髦信渲扑幰骸Ｒ苑颠驗(yàn)槔?，配制濃度為最終使用濃度的2 倍，即12.8 mg/mL 的溶液。藥液稀釋：取100 μL 配制好的藥液加入無菌U 型96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的第1 孔中，并充分混勻。從第1 孔中吸取100 μL 液體，加入第2 孔中，并混勻。依次進(jìn)行倍比稀釋，將每次稀釋后的100 μL 液體從前一孔吸取并加入下一孔中，直到第10 孔。最后，將剩余的100 μL 液體棄去。菌液接種：取100 μL 配制好的1.0×103CFU/mL 的菌液加入無菌U 型96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的第1 ～11 孔中，分別與稀釋好的藥液混合。第11 孔屬于陽性對照，只含有RPMI 1640 培養(yǎng)基和菌液，沒有藥液。第12 孔屬于生長對照孔，只含有RPMI 1640 培養(yǎng)基，無菌液和藥液。培養(yǎng)：將已加樣的無菌U 型96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 ～48 h。對于氟康唑和兩性霉素B，結(jié)果可在24 h 后讀取。48 h 后讀取伊曲康唑、伏立康唑和5-氟尿嘧啶結(jié)果。在培養(yǎng)結(jié)束后，觀察每個孔的菌落生長情況。記錄各藥物濃度下的菌落生長情況，包括清亮（無生長）、輕微渾濁（輕微生長）、渾濁（正常生長）等。根據(jù)菌落生長情況，確定最小抑菌率。

（5）結(jié)果解讀和分析：根據(jù)菌液在不同藥物濃度下的生長情況，確定最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。MIC 是指能夠抑制菌株生長的最低藥物濃度。MBC 是指能夠殺死菌株的最低藥物濃度。通過對照組的生長情況，判斷藥物的抗真菌效果。結(jié)果記錄和報告：將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行記錄，包括藥物濃度、菌落生長情況、MIC和MBC 值等。繪制藥物對菌株的抑菌曲線或生長曲線，以圖表形式展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較不同藥物的MIC 和MBC 值，評估藥物的抗真菌活性。撰寫實(shí)驗(yàn)報告。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 125 株白色念珠菌的藥物敏感性

對于125 株白色念珠菌的藥物敏感性進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示，氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B 和氟胞嘧啶對大多數(shù)菌株表現(xiàn)出較高的敏感性。其中，僅有少數(shù)菌株對氟胞嘧啶表現(xiàn)出耐藥性，耐藥率為1.6%。而其他藥物則顯示出普遍的敏感性，見表1。

表1 125 株白色念珠菌的藥物敏感性分析

2.2 活性差異分析

關(guān)于不同感染部位的菌株之間毒力因子活性，經(jīng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖1。

圖1 不同標(biāo)本來源的三種毒力因子的活性差異

表2 125 株白色念珠菌的活力分布分析 [株（%）]

3 討論

白色念珠菌具有分泌型天冬氨酸蛋白酶的能力，該酶能夠在細(xì)胞外發(fā)揮作用。這種水解酶于1965 年被首次發(fā)現(xiàn)，其在宿主不同解剖部位和感染階段中表達(dá)出多樣性。這表明白色念珠菌通過分泌不同類型和數(shù)量的蛋白酶來適應(yīng)宿主環(huán)境，并且這種酶的活性與其致病性密切相關(guān)。它具有較高的蛋白水解活性，能夠水解多種宿主底物，并在白色念珠菌的入侵和定植過程中發(fā)揮作用[8]。然而，也有一些研究報道顯示，在從感染者中分離的白色念珠菌中，只有44.4%的菌株顯示出酶的產(chǎn)生[9]。檢測率的差異可能受到多種因素的影響，包括樣本來源、分離人群和地理位置等。這些結(jié)果表明，了解白色念珠菌的酶產(chǎn)生率及其在感染過程中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制對于深入理解其致病機(jī)制具有重要意義。

本研究中，對于125 株白色念珠菌的藥物敏感性進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示，氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B 和氟胞嘧啶對大多數(shù)菌株表現(xiàn)出較高的敏感性。其中，僅有少數(shù)菌株對氟胞嘧啶表現(xiàn)出耐藥性，耐藥率為1.6%。而其他藥物則顯示出普遍的敏感性，且不同感染部位菌株之間毒力因子活性不明顯，這與劉娜等[10]的研究結(jié)果一致 。特別是對氟康唑和伏立康唑的敏感性達(dá)到100%，與文獻(xiàn)中對白色念珠菌的敏感性報道一致，其耐藥率不到 1%[11]。盡管在體外藥敏試驗(yàn)中，觀察到兩性霉素B 及5-氟胞嘧啶對白色念珠菌表現(xiàn)出較高的敏感性，但是兩性霉素B 具有一定的腎毒性，從而限制了該藥物在臨床中廣泛使用。同時，單獨(dú)使用5-氟胞嘧啶易導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生，因此在臨床實(shí)踐中很少獨(dú)立使用該藥物，而常與唑類藥物聯(lián)合使用。這種聯(lián)合用藥的策略旨在提高治療效果并減少耐藥性的發(fā)展。唑類藥物如氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑通常被選擇與5-氟胞嘧啶聯(lián)合使用。聯(lián)合應(yīng)用這些藥物可提高治療效果，并降低耐藥性的風(fēng)險，從而增加對白色念珠菌感染的治療成功率[12]。

綜上所述，本次的研究結(jié)果顯示，從臨床樣本中分離得到的白色念珠菌對常用的抗真菌藥物顯示出較高的敏感性。此外，通過對白色念珠菌的毒力因子活性進(jìn)行了比較和分析，這為深入理解和揭示其致病機(jī)制提供了重要的參考。這些研究結(jié)果對于臨床治療和預(yù)防念珠菌感染具有重要的實(shí)際意義。