吉 幻,李 萌,姚恩惠,鐘 旖,張雨垚,武和明,李 斌

頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤,每年發(fā)生超過60萬例,其5年生存率僅有50%～60%。主要由于大多數(shù)患者確診時已經(jīng)是中晚期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高[1-2]。因此,尋找與HNSCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的因子,對HNSCC的早期診斷、早期干預以及早期治療極為重要。

近年來研究發(fā)現(xiàn)HNSCC的發(fā)生發(fā)展與長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs,LncRNA)密切相關(guān)[3]。LncRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度超過200 bp的RNA,其主要功能是通過調(diào)控基因或競爭性靶向miRNA調(diào)控腫瘤的生物學過程,可間接或直接發(fā)揮抑癌或促癌作用,抑制或加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。LINC00958在肝癌、肺癌、口腔癌等多種腫瘤中表達上升并調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展,然而目前LINC00958在HNSCC中的表達及其對增殖和遷移的影響鮮見報道[5-7]。

本研究旨在探索LINC00958在HNSCC中表達及其與腫瘤預后的相關(guān)性,以及其對HNSCC細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響,并驗證LINC00958是否可通過調(diào)控miR-877-3p影響HNSCC的增殖和轉(zhuǎn)移能力,從而為HNSCC的診斷和臨床治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)庫、組織樣本及相關(guān)細胞系 基于基因表達水平值的交互式分析平臺(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA),簡稱GEPIA數(shù)據(jù)庫,可利用癌癥基因譜圖譜庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)的RNA表達譜數(shù)據(jù),行差異基因分析、生存曲線分析,或根據(jù)病理及癌癥分型分析等。收集15對2021年1月至2021年12月于南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院就診的HNSCC患者的癌及癌旁正常組織樣本?；颊呔橥?本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會批準(PJ2020-116-001)。CAL27、HN4和HN6細胞系為HNSCC細胞系,HOK為人正?？谇火つど掀ぜ毎?均購買于上海細胞系庫。

1.1.2 實驗試劑及儀器 CCK-8試劑盒(APExBIO,美國);PCR引物(銳博,中國廣州);PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,日本);小干擾RNA(吉瑪,中國上海);miR-877-3p mimics(吉瑪,中國上海);Dual-Glo Luciferase Reporter Assay(Promega,美國);miRNA PCR引物(銳博,中國廣州);GAPDH抗體(Proteintech,中國武漢);E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體(Cell Signaling Technology,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 CAL27和HOK使用DMEM高糖培養(yǎng),HN4和HN6使用DMEM/F12培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5% CO2濃度。根據(jù)LipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染。每孔5 μL脂質(zhì)體,與250 μL培養(yǎng)基輕輕混勻,靜置5 min;分別取100 pmol的si-LINC00958、si-NC、miR-877-3p mimic或mimics NC稀釋于250 μL OPTI-MEMI中,將兩種溶液輕吹混合,靜置20 min,轉(zhuǎn)染至六孔板內(nèi)細胞中,輕振混勻,轉(zhuǎn)染6～8 h后,換成含血清的培養(yǎng)液,按要求培養(yǎng)細胞。

1.2.2 組織總RNA提取 使用微量勻漿器充分研磨癌組織樣本及相應癌旁正常組織樣本。加入適量預冷Trizol,混勻,孵育10 min,然后4 ℃,12 000 r/min離心10 min,除去不溶解物質(zhì)。加入適量氯仿溶液,振蕩器15～30 s混勻,室溫孵育5 min。4 ℃,12 000 r/min離心10 min。上層水相移入無RNA酶的EP管,加入等量異丙醇,混勻,常溫放置20 min。4 ℃,12 000 r/min,離心10 min。留沉淀,預冷75%乙醇,加入約1 mL乙醇,混勻。4 ℃,7 500 r/min離心5 min。棄上清液,沉淀內(nèi)加入預冷的DEPC水,混勻。定量RNA濃度和純度。

1.2.3 細胞總RNA提取 收集細胞沉淀,沉淀內(nèi)加入適量Trizol,吹打細胞,孵育10 min。余步驟同1.2.2步驟提取。

1.2.4 實時定量PCR反應 取1.2.2和1.2.3步驟獲取的RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用PCR試劑盒進行實時定量PCR,LINC00958和miR-877-3p分別以GAPDH和U6作為內(nèi)參基因,用2-ΔΔCt對目的基因表達進行定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 CCK-8檢測細胞增殖 轉(zhuǎn)染細胞,培養(yǎng)至對數(shù)生長期,收集細胞。1 mL培養(yǎng)液重懸細胞,計數(shù),接種于96孔板中,每孔3×103個細胞。于0、24、48、72、96、120 h分別檢測。用培養(yǎng)基配制10% CCK-8混合液,每孔100 μL。37 ℃避光孵育2 h,在450 nm處測定吸光度。

1.2.6 Transwell實驗 包括細胞遷移實驗和細胞侵襲實驗。細胞遷移實驗:取24孔板,放入小室,小室下方加600 μL含10% FBS的培養(yǎng)液,小室內(nèi)加入200 μL細胞懸液,將細胞在37 ℃下培養(yǎng)24 h,固定細胞,結(jié)晶紫染色, 清洗小室, 自然晾干。 細胞侵襲實驗:預先用無血清的培養(yǎng)液按1∶8稀釋Matrigel膠,取60 μL稀釋膠加到上室中,37 ℃孵育至少30 min,其余步驟同細胞遷移實驗。正置顯微鏡選擇適當放大倍數(shù)拍照,用ImageJ軟件分析。

1.2.7 生物信息學分析 采用以下2個數(shù)據(jù)庫預測LINC00958下游miRNA:DIANA TOOLS(http://diana.imis.athena-innovation.gr)和RegRNA 2.0(http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw)。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?預測LINC00958和miR-877-3p的結(jié)合位點。構(gòu)建包含LINC00958的野生型(WT)序列和突變(MUT)序列,分別插入GP-miRGLO載體,由上海吉瑪公司合成,命名為GP-miRGLO-LINC00958-WT和GP-miRGLO-LINC00958-MUT。取對數(shù)生長期并狀態(tài)良好的CAL27和HN6細胞,接種到24孔板中。按照LipofectamineTM2000試劑說明轉(zhuǎn)染,將2 μg GP-miRGLO-LINC00958-WT或GP-miRGLO-LINC00958-MUT,50 nmol miR-877-3p mimics或mimics NC,與2 μL脂質(zhì)體混合,室溫孵育20 min。共轉(zhuǎn)染48 h后,使用Promega公司的Dual-Glo Luciferase Reporter Assay試劑盒檢測。

1.2.9 免疫蛋白質(zhì)印跡(Western Blot) 提取總蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白濃度,蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF上,用5%脫脂奶粉室溫封閉后分別加入一抗4 ℃過夜,洗膜后加入二抗,室溫孵育1 h,用ECL化學發(fā)光液顯色。

1.2.10 細胞核質(zhì)分離實驗 采用Paris Kit試劑盒。收集所需細胞,向細胞沉淀中加入細胞分離液,吹打重懸細胞,放置冰上裂解,離心。離心后上清液即是細胞質(zhì),沉淀為細胞核。取上清液至新的EP管,向沉淀加細胞裂解液,渦旋混勻。管內(nèi)加入適量的2×lysis/Binding Buffer用于裂解細胞核與細胞質(zhì)中,將無水乙醇分別加入細胞核與細胞質(zhì),混勻。標記吸附管,將混合液移入相應的管內(nèi),加入Wash Solution 1,離心,加入洗滌液,離心。向吸附管內(nèi)加入預熱的洗脫液,離心。定量檢測RNA濃度,置-80 ℃保存。用于后續(xù)細胞核質(zhì)RNA檢測實驗。

1.3 統(tǒng)計學分析

本研究實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差顯示,采用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù),實驗均獨立重復3次。兩組間比較采用t檢驗分析,多組比較采用one-way ANOVA單因素方差分析,多組間兩兩比較采用Dunnett檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中LIN00958在HNSCC組織中的表達和臨床意義

分析GEPIA數(shù)據(jù)庫中519例HNSCC組織和44例癌旁正常組織中LINC00958表達發(fā)現(xiàn),與癌旁正常組織相比,LINC00958在HNSCC組織中的表達明顯升高(圖1A),生存曲線分析發(fā)現(xiàn)HNSCC患者組織中LINC00958表達越高,其預后越差(圖1B)。

A:組織中LINC00958表達;B:生存曲線分析;*:P<0.05

2.2 LIN00958在HNSCC組織和細胞中的表達

實時定量PCR實驗結(jié)果顯示,相較于癌旁正常組織,LINC00958在HNSCC組織中的表達明顯升高(圖2A)。在HNSCC細胞系CAL27、HN4和HN6中,LINC00958的表達水平明顯高于人正?？谇火つぜ毎礖OK(圖2B)。此外,通過檢測CAL27和HN6細胞核和細胞質(zhì)中RNA發(fā)現(xiàn),LINC00958主要表達在細胞質(zhì)中(圖2C、D)。

A:組織中LINC00958表達;B:細胞中LINC00958表達;C、D:LINC00958在CAL27和HN6細胞中分布;**:P<0.01;***:P<0.001

2.3 LINC00958對CAL27和HN6細胞增殖能力的影響

結(jié)果顯示,將si-LINC00958轉(zhuǎn)染到CAL27和HN6細胞后,CAL27和HN6細胞中LINC00958表達明顯降低(圖3A)。CCK-8實驗檢測LINC00958對HNSCC細胞系CAL27、HN6生長的影響。結(jié)果表明,與轉(zhuǎn)染si-NC組相比,轉(zhuǎn)染si-LINC00958組的CAL27和HN6細胞吸光度值明顯降低(圖3B、C)。

A:si-LINC00958轉(zhuǎn)染效率驗證;B:CAL27細胞增殖曲線;C:HN6細胞增殖曲線;**:P<0.01;***:P<0.001

2.4 LINC00958對CAL27和HN6細胞遷移和侵襲能力的影響

細胞遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染si-NC組相比,轉(zhuǎn)染si-LINC00958組的CAL27和HN6細胞在顯微鏡下穿過小室的細胞數(shù)量減少,表現(xiàn)出較弱的遷移和侵襲能力(圖4A、B)。

2.5 LINC00958對EMT通路相關(guān)蛋白的影響

Western Blot曝光實驗結(jié)果表明,敲低LINC00958后,N-cadherin、Vimentin(間充質(zhì)標志物)蛋白表達水平下降,E-cadherin(上皮標志物)蛋白表達增高(圖5A、B)。

A:CAL27細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達情況;B:HN6細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達情況

2.6 miR-877-3p在HNSCC組織和細胞中的表達

實時定量PCR實驗結(jié)果顯示,相較于癌旁正常組織,miR-877-3p在HNSCC組織中的表達含量明顯降低(圖6A)。在HNSCC細胞系CAL27、HN4和HN6中,miR-877-3p的表達水平明顯低于人正?？谇火つぜ毎礖OK(圖6B)。

A:miR-877-3p在組織中表達;B:miR-877-3p在細胞中表達;**:P<0.01;***:P<0.001

2.7 LINC00958負向調(diào)節(jié)miR-877-3p表達

PCR結(jié)果顯示,敲低LINC00958后miR-877-3p在CAL27和HN6表達量增高,并有顯著意義(圖7A)。通過預測miR-877-3p與LINC00958的結(jié)合位點,構(gòu)建LINC00958野生型(GP-miRGLO-LINC00958-WT)質(zhì)粒和LINC00958突變型(GP-miRGLO-LINC00958-MUT)質(zhì)粒(圖7B)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示:只有在CAL27和HN6細胞中共轉(zhuǎn)染LINC00958野生型質(zhì)粒(GP-miRGLO-LINC00958-WT)和miR-877-3p mimics,熒光素酶活性才顯著降低(圖7C)。

′A:轉(zhuǎn)染si-LINC00958后細胞中miR-877-3p的表達;B:LINC00958和miR-877-3p結(jié)合位點;C:CAL27和HN6細胞系熒光素酶活性;*:P<0.05;**:P<0.01;ns:無統(tǒng)計學意義

2.8 miR-877-3p對CAL27和HN6細胞增殖能力的影響

PCR結(jié)果顯示,將miR-877-3p mimics轉(zhuǎn)染到CAL27和HN6細胞系中后,細胞系中miR-877-3p表達明顯升高(圖8A)。CCK-8實驗結(jié)果表明,與轉(zhuǎn)染NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-877-3p mimics組的CAL27和HN6細胞450 nm吸光度值明顯降低(圖8B、C)。

A:miR-877-3p mimics轉(zhuǎn)染效率驗證;B:CAL27細胞增殖曲線;C:HN6細胞增殖曲線;*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

2.9 miR-877-3p對CAL27和HN6細胞遷移和侵襲能力的影響

細胞遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-877-3p mimics組的CAL27和HN6細胞在顯微鏡下穿過小室的細胞數(shù)量減少,表現(xiàn)出較弱的遷移和侵襲能力(圖9A、B)。

A:鏡下遷移實驗結(jié)晶紫染色后小室圖和統(tǒng)計分析;B:鏡下侵襲實驗結(jié)晶紫染色后小室圖和統(tǒng)計分析;比例尺=100 μm;**:P<0.01;***:P<0.001

2.10 miR-877-3p對EMT通路相關(guān)蛋白的影響

Western Blot曝光實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-877-3p mimics后,N-cadherin、Vimentin(間充質(zhì)標志物)蛋白表達水平下降,E-cadherin(上皮標志物)蛋白表達增高(圖10)。

A:CAL27細胞中miR-877-3p對EMT相關(guān)蛋白的影響;B:HN6細胞中miR-877-3p對EMT相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

LncRNA屬于一類新發(fā)現(xiàn)的RNA,其轉(zhuǎn)錄本包含200多個不編碼蛋白質(zhì)的核苷酸[8]。近年來研究表明LncRNA的失聯(lián)在多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。LncRNA可作為致癌因子,通過與其他RNA的交叉作用和多種基于染色質(zhì)的機制促進多種癌癥的生長或轉(zhuǎn)移。LncRNA可通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼能力、在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平改變基因表達進而調(diào)控惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程,影響腫瘤生長、轉(zhuǎn)移等,有望成為治療惡性腫瘤的靶向分子[4,9]。

研究表明,LINC00958在多種惡性腫瘤中高表達并與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10]。據(jù)報道,在肺腺癌中,LINC00958作為miR-625-5p海綿,促進細胞增殖、遷移或侵襲能力[6]。LINC00958可通過miR-627-5p促進口腔鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移[7]。本研究發(fā)現(xiàn),與相鄰的正常組織相比,LINC00958在15個HNSCC腫瘤組織中表達量明顯上調(diào)。后續(xù)的研究結(jié)果證實,沉默LINC00958可以顯著抑制HNSCC的細胞增殖、遷移和侵襲。通過分析GEPIA數(shù)據(jù)庫,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HNSCC患者的LINC00958表達升高提示患者預后不佳。本研究進一步驗證了LINC00958在HNSCC進展中的重要作用。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和腫瘤發(fā)生發(fā)展、腫瘤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān),其顯著標志是上皮標志物(如E-cadherin)的下降和間充質(zhì)標志物(如N-cadherin、Vimentin)的上升[11-12]。此外,EMT通常和很多轉(zhuǎn)錄因子有關(guān),如snail、slug、ZEB1和TWIST等,這些轉(zhuǎn)錄因子能通過不同途徑抑制E-cadherin表達,影響EMT[13-14]。據(jù)報道,LncRNA在調(diào)節(jié)EMT進程中具有重要作用,有望成為抑制EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子[15-16]。為了探索LINC00958促進HNSCC發(fā)生發(fā)展的機制。本研究通過WB實驗發(fā)現(xiàn),與NC組相比,轉(zhuǎn)染si-LINC00958后,E-cadherin蛋白表達量顯著上升,而N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平明顯下降,提示LINC00958通過調(diào)控EMT影響HNSCC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

近年來,研究表明LncRNA可以通過競爭與microRNA結(jié)合而發(fā)揮競爭內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNAs)的作用[17]。MicroRNA是22 nt左右的小RNA分子,可以通過與靶mRNA結(jié)合來沉默基因和抑制翻譯。MicroRNA在心血管疾病、視網(wǎng)膜疾病、癌癥等多種人類疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[18-19]。此前已有多種研究表明,LINC00958可通過作用miRNA調(diào)節(jié)癌癥進展。如LINC00958通過浸潤miR-625-5p,上調(diào)LRRC8E表達,促進宮頸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移[20]。LINC00958通過作用miR-627-5p,調(diào)節(jié)YBX2表達,促進口腔鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移[7]。

通過生物信息學研究,我們預測miR-877-3p可能與LINC00958結(jié)合。通過qRT-PCR實驗證實,與NC組相比,沉默LINC00958后miR-877-3p在CAL27和HN6細胞中的表達明顯上調(diào)。因此我們推測LINC00958可能負向調(diào)節(jié)miR-877-3p。通過功能實驗,我們證實在HNSCC中miR-877-3p是腫瘤抑制因子,抑制HNSCC細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力,其對細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用與LINC00958相反。接下來本研究通過雙重熒光素酶報告基因,驗證了LINC00958與miR-877-3p存在直接結(jié)合。根據(jù)這些研究結(jié)果,我們認為LINC00958可結(jié)合miR-877-3p,在HNSCC發(fā)揮致癌基因作用。此外,本研究發(fā)現(xiàn),與NC組相比,過表達miR-877-3p后,E-cadherin(上皮標志物)表達量顯著上升,而間充質(zhì)標志物(N-cadherin和Vimentin)蛋白表達水平明顯下降,提示過表達miR-877-3p抑制HNSCC細胞的EMT通路。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)LINC00958在HNSCC中高度上調(diào),LINC00958可結(jié)合并負向調(diào)節(jié)miR-877-3p,通過調(diào)控EMT促進HNSCC的增殖、遷移和侵襲能力;LINC00958可能是HNSCC的新型治療生物標志物。然而,在HNSCC中,LINC00958如何通過海綿作用吸附miR-877-3p來調(diào)控下游信號通路的機制有待進一步深入研究。