佟雪溪,趙 剛,2

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是頭頸部癌癥患者最常見的殺手之一,盡管在診斷和治療方面取得一定進(jìn)展,但復(fù)發(fā)率和死亡率仍然很高,尋找新的生物標(biāo)志物對早期發(fā)現(xiàn)、病中監(jiān)測以及疾病預(yù)后預(yù)測具有重要意義。研究數(shù)據(jù)顯示下調(diào)的miR-191-5p通過靶向TJP1來抑制OSCC。

miRNA是長度為18～25個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA,其與基本上所有已知的病理和生理過程(包括癌癥)相關(guān)聯(lián)。miRNA對癌癥相關(guān)機(jī)制影響的研究集中在細(xì)胞增殖、對細(xì)胞死亡的抗性、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和血管生成[1]。循環(huán)miRNA可作為癌癥生物標(biāo)志物,miRNA組合可用于癌癥風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測,已經(jīng)有研究者進(jìn)行了幾項(xiàng)涉及miRNA檢測的早期臨床試驗(yàn)[2]。有研究證實(shí)miRNA在血清中可以相當(dāng)穩(wěn)定并且易于通過各種測定法被檢測[3],這說明了miRNA作為早期癌癥生物標(biāo)志物的可能性。

miR-191是miR-191/425簇的一部分,該簇是高等真核生物的重要參與者,位于人類3號染色體(3p21.31)上 DALRD3 基因的第一個(gè)內(nèi)含子,編碼四種成熟miRNA:miR-191-5p、miR-191-5p-3p、miR-425-5p和 miR-425-3p。有研究表明miR-191-5p在細(xì)胞分化和發(fā)育中起重要作用,包括加速促進(jìn)衰老[4]、促進(jìn)紅細(xì)胞生成[5]以及成骨方面[6]發(fā)揮了重要介質(zhì)作用。miR-191是一種高度保守的miRNA,它被發(fā)現(xiàn)在20 多種不同的癌癥中異常表達(dá),并被證明是其中一些癌癥的主要參與者。最近的研究發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌患者外周血中miR-191高度表達(dá),認(rèn)為其是具有較高早期診斷潛力的生物標(biāo)志物[7]。本研究通過開展體外實(shí)驗(yàn)探究miR-191-5p對OSCC細(xì)胞的影響及其機(jī)制,為OSCC的靶向治療提供新的治療靶點(diǎn)和治療策略。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

Trizol、Lipo3000試劑購自美國Invitrogen,miR-191-5p inhibitor、inhibitor NC和si-TJP1、si-NC購自淼靈質(zhì)粒平臺,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR和ChamQ Universal SYBR試劑盒購自南京Vazyme公司,CCK-8試劑盒購自博士德公司,TJP1、GAPDH 抗體購自武漢ABclonal公司,E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體購自上海Abways公司,雙熒光素酶檢測試劑盒購自上海碧云天公司,miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒和miRNA熒光定量PCR試劑盒(染料法)購自上海生工。

1.2 生物信息學(xué)分析

從StarBase數(shù)據(jù)庫( http://starbase．sysu．edu．cn)中的 Pan-Cancer 模塊中分析miR-191-5p得到miR-191-5p在多種癌癥中的差異表達(dá)數(shù)據(jù)。接著使用公開數(shù)據(jù)庫TargetScan、miRBase和miRanda分析miR-191-5p的候選靶基因并取交集。得到的候選靶基因分別在StarBase數(shù)據(jù)庫Gene Differential Expression模塊中分析在人頭頸部鱗癌中的表達(dá)差異,并在RNA-RNA CoExpression模塊進(jìn)行miR-191-5p與候選靶基因的相關(guān)性分析。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

人口腔鱗癌細(xì)胞Cal-27購自武漢普諾賽生命科技有限公司。將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(BI,以色列),1%青-鏈霉素(博士德,中國)的完全DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco,美國)中,37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按照lipo 3000轉(zhuǎn)染步驟,對Cal-27細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-191-5p inhibitor、inhibitor NC,空白組為空轉(zhuǎn)染的Cal-27細(xì)胞。為驗(yàn)證TJP1的作用,設(shè)計(jì)細(xì)胞分組為對照組(轉(zhuǎn)染miR-191-5p inhibitor+si-NC)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-191-5p inhibitor+si-TJP1)。

1.4 qRT-PCR檢測

采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,使用超微分光光度計(jì)(Colibri)測量RNA濃度和純度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書獲得cDNA反應(yīng)液。按照SYBR試劑盒說明對miR-191-5p和TJP1 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。分別以U6和GAPDH作為內(nèi)參,實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 CCK-8增殖檢測

將轉(zhuǎn)染處理后對數(shù)生長期細(xì)胞,接種于96孔板中1 000個(gè)/孔,分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后每孔加入CCK-8試劑(1∶9),置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1 h,用酶標(biāo)儀測定波長490 nm處吸光度值(optical density,OD)。

1.6 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

將每組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率合適后,用0.25%胰蛋白酶分離并分散成單細(xì)胞,將每組細(xì)胞懸液細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×103個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中單個(gè)克隆細(xì)胞團(tuán)鏡下數(shù)量大于等于50個(gè)時(shí)可停止培養(yǎng),0.1%結(jié)晶紫溶液染色,用倒置顯微鏡拍照并統(tǒng)計(jì)集落數(shù)量。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測

Matrigel膠包被Transwell小室上室,將2×104個(gè)細(xì)胞接種到含無血清培養(yǎng)基的上室中,在小室下室中加入600 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。37 ℃,5% CO2培養(yǎng)24 h,用PBS清洗小室3次,用4%多聚甲醛固定小室30 min,擦去Matrigel膠及未侵襲的細(xì)胞,0.1%結(jié)晶紫染色。用PBS洗凈,干燥后正置顯微鏡觀察,隨機(jī)觀察6～10個(gè)視野,記錄每個(gè)視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測

將細(xì)胞接種到六孔板中,分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理。用200 μL無菌槍頭垂直于橫線劃痕。用PBS洗滌去除懸浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片。添加新鮮的無血清培養(yǎng)基,倒置熒光顯微鏡拍照記錄0 h細(xì)胞愈合圖像,培養(yǎng)板放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每隔12 h取出6孔板拍照記錄細(xì)胞的傷口愈合情況至傷口完全愈合;收集圖片數(shù)據(jù),Image J軟件分析細(xì)胞傷口愈合率。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

通過生信網(wǎng)站預(yù)測miR-191-5p與TJP1的結(jié)合位點(diǎn),將miR-191-5p與TJP1結(jié)合部位的序列及其突變體序列插入到螢火蟲熒光素酶基因下游構(gòu)建表達(dá)載體(Promega,美國)。將miR-191-5p mimics與pmirGLO-TJP1-WT/MUT重組質(zhì)粒,以及對照組mimics NC與TJP1的野生型或突變型重組質(zhì)粒,利用Lipo3000轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.10 Western blotting檢測

使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取20 μg蛋白加1×上樣緩沖液煮沸變性,通過SDS-PAGE將蛋白分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h后,加入一抗,4 ℃過夜孵育。次日洗膜3次,加入二抗,在溫室中孵育1 h。再洗膜3次后,加入發(fā)光試劑使蛋白顯影,置于凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像。以GAPDH為內(nèi)參,Image J軟件計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8軟件用于數(shù)據(jù)處理分析與圖形繪制。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。兩組之間的比較使用t檢驗(yàn)分析,多組比較使用單因素或雙因素方差分析。P<0.05表示差異顯著并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-191-5p在OSCC中高表達(dá)

中山大學(xué)StarBase數(shù)據(jù)庫分析顯示,相比于正常組織miR-191-5p在癌組織中表達(dá)量高(圖1),而OSCC是最常見的頭頸部癌癥類型,因此我們有理由懷疑miR-191-5p可能在OSCC進(jìn)展中起重要作用。

圖1 miR-191-5p在口腔鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)

在TJP1的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)中發(fā)現(xiàn)了miR-191-5p的互補(bǔ)區(qū)。在先前的研究中,miR-191-5p已被驗(yàn)證為在肝細(xì)胞癌中通過抑制TJP1的信號傳導(dǎo)增加HCC細(xì)胞侵襲性[8]。進(jìn)一步研究miR-191-5p在OSCC中的潛在機(jī)制,StarBase數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)與非癌組織相比人OSCC組織中TJP1表達(dá)水平下調(diào)(圖2)。為進(jìn)一步探討miR-191-5p與TJP1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的關(guān)系,對兩者的共表達(dá)相關(guān)性分析顯示TJP1的表達(dá)與miR-191-5p呈負(fù)相關(guān),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。

圖2 TJP1在口腔鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)

圖3 TJP1與miR-191-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

2.2 下調(diào)miR-191-5p可抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖

與inhibitor NC組比較,miR-191-5p inhibitor組細(xì)胞中miR-191-5p的表達(dá)顯著降低(圖4A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示空白組和inhibitor NC組在24 h后細(xì)胞增殖能力明顯提升,而miR-191-5p低表達(dá)后Cal-27細(xì)胞的增殖能力較inhibitor NC組顯著降低(圖4B)?？寺?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比miR-191-5p inhibitor組細(xì)胞集落數(shù)量少,說明細(xì)胞集落形成能力顯著降低(圖4C)。

A:qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率;B:CCK-8法檢測細(xì)胞增殖;C:克隆實(shí)驗(yàn)0.1%結(jié)晶紫染色圖;****:P<0.000 1

2.3 下調(diào)miR-191-5p抑制口腔鱗癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)

Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與inhibitor NC組比較,miR-191-5p inhibitor組Cal-27細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)目減少、相對遷移率變小(圖5),這說明了抑制miR-191-5p減弱了Cal-27細(xì)胞的侵襲遷移能力。EMT在癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起到關(guān)鍵作用,Western blotting結(jié)果顯示敲低miR-191-5p后,Cal-27細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)顯著升高,N-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水顯著降低(圖6)。表明降低miR-191-5p參與抑制OSCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和EMT形成。

A:Transwell測定法測定細(xì)胞侵襲;B:劃痕愈合測定法測定細(xì)胞遷移。**:P<0.01

A:蛋白條帶表達(dá);B:蛋白表達(dá)量化比較;**:P<0.01

2.4 miR-191-5p靶向TJP1

通過生信數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果可知,miR-191-5p與TJP1間存在互作序列(圖7)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,miR-191-5p過表達(dá)組的熒光素酶活性顯著低于mimics NC組。然而,TJP1的3′-UTR區(qū)突變組的熒光素酶活性表現(xiàn)出不同的結(jié)果,證實(shí)miR-191-5p可以靶向結(jié)合TJP1(圖8)。Western blotting檢測結(jié)果顯示,TJP1蛋白表達(dá)在過表達(dá)miR-191-5p的細(xì)胞中顯著降低,而抑制miR-191-5p可上調(diào)TJP1表達(dá)(圖9A),qRT-PCR結(jié)果也顯示過表達(dá)miR-191-5p后細(xì)胞中TJP1的表達(dá)降低(圖9B);上述結(jié)果表明TJP1是miR-191-5p的靶向基因。

圖7 miR-191-5p與TJP1的靶向結(jié)合位點(diǎn)

****:P<0.000 1

A:WB檢測TJP1的表達(dá);B:qRT-PCR檢測過表達(dá)miR-191-5p后TJP1的表達(dá);**:P<0.01 vs. mimics NC/inhibitor NC;****:P<0.000 1 vs. mimics NC

2.5 miR-191-5p通過靶向TJP1促進(jìn)OSCC的進(jìn)展

qRT-PCR結(jié)果顯示 miR-191-5p低表達(dá)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-TJP1 成功下調(diào)了 TJP1 的表達(dá)(圖10A),實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測對比miR-191-5p inhibitor+si-NC組,同時(shí)下調(diào)TJP1后Cal-27細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)、侵襲細(xì)胞數(shù)增多、細(xì)胞遷移率明顯增強(qiáng),表明下調(diào)TJP1可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)miR-191-5p對Cal-27細(xì)胞增殖和遷移侵襲的抑制(圖10B～D),這些結(jié)果表明miR-191-5p操控并抑制TJP1從而促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

A:qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率;B: CCK-8法檢測細(xì)胞增殖;C:Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力;D:劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力;****:P<0.000 1; **:P<0.01

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是最常見的侵襲性癌癥之一。雖然目前手術(shù)切除、化學(xué)療法和放療能夠被用于治療OSCC患者,但由于OSCC具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移性質(zhì),患者在術(shù)后往往會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移或生存差的情況[9],迫切需要揭示OSCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以開發(fā)新穎有效的OSCC治療策略。本研究數(shù)據(jù)顯示下調(diào)的 miR-191-5p 通過靶向TJP1來抑制OSCC。

miRs失調(diào)與口腔癌的癌變和進(jìn)展有關(guān),通過與mRNA 3′-UTR結(jié)合導(dǎo)致mRNA降解或翻譯受阻,在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮復(fù)雜多樣的功能[10]。以口腔鱗癌OSCC為例,新型LINC00472通過miR-455-3p/ELF3軸抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌生長[11];miR-340-5p靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白PERK和ATF6,以影響口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖和侵襲[12]。miR-191-5p的功能因腫瘤而異,到目前為止,許多證據(jù)表明miR-191-5p在腫瘤發(fā)生及乳腺癌[13]、結(jié)腸癌[14]等多種癌癥中的失調(diào)中起重要作用。然而在一些癌癥中miR-191-5p呈下調(diào)表達(dá),如在腎細(xì)胞癌細(xì)胞系中的下調(diào)[15]與本研究結(jié)果相矛盾。但目前在OSCC中的作用及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。通過本研究發(fā)現(xiàn)miR-191-5p在OSCC組織及細(xì)胞中表達(dá)顯著升高,體外實(shí)驗(yàn)顯示敲低miR-191-5p能夠抑制OSCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。

EMT是一種常伴隨腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的生物學(xué)活動(dòng)[16],目前認(rèn)為,EMT發(fā)生的主要標(biāo)志是E-cadherin表達(dá)降低、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)升高,引起腫瘤細(xì)胞間的黏附能力下降,運(yùn)動(dòng)能力增加,腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生浸潤或轉(zhuǎn)移。Transwell和劃痕愈合測定以及蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果表明,隨著E-cadherin表達(dá)的改善,下調(diào)的miR-191-5p抑制 OSCC增殖、侵襲遷移和EMT,并降低N-cadherin和Vimentin水平。有研究顯示在肺癌細(xì)胞中,miR-191-5p 促進(jìn)細(xì)胞侵襲遷移以及EMT并具有癌癥干細(xì)胞樣特性[17]。研究結(jié)果顯示體外下調(diào)miR-191-5p抑制了口腔鱗癌細(xì)胞生長和EMT,下調(diào)的miR-191-5p可能有助于阻斷OSCC進(jìn)展。

為進(jìn)一步揭示miR-191-5p的潛在作用機(jī)制,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TJP1是其潛在的靶基因,并通過雙熒光素酶報(bào)告基因測定進(jìn)行了驗(yàn)證。TJP1(也稱ZO-1)是膜相關(guān)鳥苷酸激酶同系物家族的成員,通過上皮表型相關(guān)基因和上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞表型相關(guān)基因來調(diào)控EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,參與促進(jìn)細(xì)胞分化和遷移并與癌癥干細(xì)胞表型相關(guān)[18]。細(xì)胞-細(xì)胞連接蛋白在維持組織結(jié)構(gòu)中起著至關(guān)重要的作用,但在不同的癌癥中通常會(huì)失調(diào)。越來越多的研究表明TJP1表達(dá)下調(diào)與癌癥擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)相關(guān)[19],例如TJP1可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)[20]。最近的研究表明TJP1定位于突出的板狀偽足和細(xì)胞后部細(xì)胞接觸位點(diǎn)的基部[21],表明TJP1可能對牽引力和拉力之間的相互作用很重要。通過與TJP1蛋白相互作用動(dòng)態(tài)調(diào)控E-cadherin表達(dá)和定位是闡明癌癥轉(zhuǎn)移集體遷移機(jī)制的關(guān)鍵因素,這也與本研究結(jié)果一致。數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示TJP1在OSCC中下調(diào),miR-191-5p的下調(diào)增加了TJP1蛋白的表達(dá)水平,抑制了口腔鱗癌細(xì)胞的侵襲性。本實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證TJP1的作用,將siRNA-TJP1轉(zhuǎn)染到miR-191-5p低表達(dá)的細(xì)胞中,同時(shí)下調(diào)TJP1后Cal-27細(xì)胞的增殖和侵襲遷移顯著增強(qiáng),表明下調(diào)TJP1可以逆轉(zhuǎn)敲低miR-191-5p對Cal-27細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。

綜上所述,miR-191-5p在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá),體外下調(diào)miR-191-5p可顯著抑制OSCC細(xì)胞增殖侵襲遷移和EMT形成,miR-191-5p可通過靶向緊密結(jié)合蛋白TJP1發(fā)揮這一功能。由于實(shí)驗(yàn)條件有限僅使用一種OSCC細(xì)胞開展研究,本研究需要進(jìn)一步探索miR-191-5p對其他口腔鱗癌細(xì)胞的影響以及其他靶標(biāo)的潛在機(jī)制。盡管這只是一項(xiàng)臨床前研究,我們的研究結(jié)果為口腔鱗狀細(xì)胞癌治療提供了一些線索,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果和在臨床實(shí)踐中的有效應(yīng)用需要進(jìn)一步驗(yàn)證。未來需要深入探究miR-191-5p對口腔鱗狀細(xì)胞癌的臨床影響,以證實(shí)當(dāng)前發(fā)現(xiàn)在臨床實(shí)踐中的臨床相關(guān)性。