張穎，宋彩露，劉凌蕊，唐海林，賴潔蘭

中山大學(xué)腫瘤防治中心，廣東廣州 510060

乳腺癌是全世界發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)2020 年全球癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)，2020 年估計全球新增乳腺癌230 萬例，已經(jīng)超過肺癌成為全球第一大癌癥［1］。三陰乳腺癌（TNBC）臨床表現(xiàn)惡性程度高，侵襲性強，病理學(xué)分級較高，容易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。在所有乳腺癌分子亞型中，TNBC 患者腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率最高，其發(fā)生發(fā)展的分子機制一直是科學(xué)研究的熱點問題［2］。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類非編碼RNA，在調(diào)節(jié)基因表達和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 在TNBC 生長與肺轉(zhuǎn)移中具有重要的調(diào)控作用。例如，circKIF4A 和circEPSTI1 在TNBC 中顯著上調(diào)，且其高表達與TNBC 的不良預(yù)后呈正相關(guān)。敲低circKIF4A 和circEPSTI1 可顯著抑制TNBC 的增殖和遷移［4-5］。本課題組經(jīng)預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，circSLCO1B3（SLCO1B3 來源的 hsa_circ_0025580）在TNBC 腦轉(zhuǎn)移細胞系中顯著低表達。本研究擬探究circSLCO1B3 對TNBC 腦轉(zhuǎn)移的作用及其可能的調(diào)控機制，為TNBC 腦轉(zhuǎn)移靶向治療藥物的尋找提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 RPMI1640、DMEM/F12 培養(yǎng)基、馬血清、表皮生長因子、氫化可的松、胰島素、胎牛血清、1%雙抗（102 U/mL 青霉素及0.1 g/L 鏈霉素）（Gibco，美國）、Lipo 3000、RIPA 蛋白裂解液及PMSF抑制劑、抗體PTEN 及GAPDH（Affinity，美國），過表達circSLCO1B3 的慢病毒質(zhì)粒（circSLCO1B3-OE）及其對照（circCTR-OE）、敲低circSLCO1B3的慢病毒質(zhì)粒（sh-circSLCO1B3）及其對照（sh-circCTR）、miR-155模擬物（miR-155 mimics）及其對照（miR-CTR）、Nase R酶、細胞核/胞質(zhì)細胞組分提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）、TaqMan逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa，日本），0.8 nm Transwell 小室及基質(zhì)膠（BD，美國），Nanodrop 2000 紫外可見分光光度計（Thermo，美國），OLYMPUS BX51 正置顯微鏡（奧林巴斯，日本）。

1.2 細胞來源及培養(yǎng) ATCC來源的人正常乳腺上皮細胞MCF-10A，人非TNBC 細胞系MCF-7、T47D、BT474、SKBR-3、BT20、BT483、HCC1569，人TNBC細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-361、MDA-MB-436、MDAMB-453、MDA-MB-468、BT-549、HCC-38、HCC1599和HCC1806，人腦轉(zhuǎn)移TNBC 細胞系231Br（通過左心室注射將親代TNBC 腫瘤細胞MDA-MB-231 植入免疫缺陷小鼠而衍生的；從收獲的腦轉(zhuǎn)移瘤中提取轉(zhuǎn)移細胞，再經(jīng)兩輪注射—提取—腦轉(zhuǎn)移形成循環(huán)產(chǎn)生的，其顯示出豐富的腦轉(zhuǎn)移活性［6］）以及小鼠TNBC 細胞系4T1。其中，MCF-10A 細胞培養(yǎng)于含1%馬血清、20 ng 表皮生長因子、0.5 μg 氫化可的松、10 μg/mL 胰島素以及1%雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，其余細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。

1.3 實驗方法

1.3.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建 取生長狀態(tài)良好、匯合度達70%左右的231Br細胞，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，更換新鮮培養(yǎng)基，分別將circSLCO1B3-OE 和circCTR-OE病毒液加入目的細胞和對照細胞293T中；培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄含病毒液的培養(yǎng)基，更換新鮮完全培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，更換含2 μg/mL 的嘌呤霉素完全培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定過表達circSLCO1B3 的細胞株及其對照細胞株。繼續(xù)傳代篩選并傳3 代后，通過qRT-PCR 驗證circSLCO1B3 的過表達效率，凍存穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株備用，分別命名為231Br/OE（circSLCO1B3穩(wěn)定過表達組，即circSLCO1B3-OE組）和231Br/CTR（對照組，即circCTR-OE組）。

1.3.2 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。將231Br/OE和231Br/CTR細胞分別制成2×105/mL單細胞懸液。在Transwell 小室中鋪加基質(zhì)膠，培養(yǎng)箱內(nèi)靜置6 h 成膜后取出。小室中加入150 μL 單細胞懸液，下方24孔板孔中則加入350 μL含20%的FBS培養(yǎng)基。于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h 后取出小室，0.5%結(jié)晶紫染色，清洗并晾干小室后，于鏡下觀察并統(tǒng)計染色細胞數(shù)目。

1.3.3 腦轉(zhuǎn)移動物模型構(gòu)建 4～6 周齡雌性NOD/SCID 小鼠購自廣東藥康生物科技有限公司。將231Br/OE細胞或?qū)φ?31Br/CTR 細胞經(jīng)左心室注射成瘤（每組5 只），1 月后摘除腦組織，肉眼統(tǒng)計腫瘤結(jié)節(jié)形成數(shù)，石蠟包埋后切片進行HE染色檢測。

1.3.4 circSLCO1B3 亞細胞定位分析 根據(jù)細胞核/胞質(zhì)細胞組分提取試劑盒的說明書進行操作，提取細胞胞質(zhì)及胞核RNA，采用qRT-PCR 檢測細胞核對照18S、細胞質(zhì)對照GAPDH 和circSLCO1B3 分別在細胞質(zhì)和細胞核中的相對表達量，并根據(jù)在胞核和胞質(zhì)中所占的比例作圖。

1.3.5 circSLCO1B3、PTEN 與miR-155 之間的結(jié)合關(guān)系驗證 采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。①circ-SLCO1B3 與miR-155 之間的結(jié)合關(guān)系驗證。通過生物信息學(xué)軟件CircInteractome 預(yù)測，發(fā)現(xiàn)circSLCO1B3序列中存在多個miR-155結(jié)合位點。將2×104個231Br 細胞接種到6 孔板中，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h。使用Lipo 3000 分別進行共轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染分組分別為：野生型circSLCO1B3+miR-NC、野生型circ-SLCO1B3+miR-155、突變型circSLCO1B3+miR-NC、突變型circSLCO1B3+miR-155，轉(zhuǎn)染后按照試劑盒說明書進行后續(xù)操作［7］，qRT-PCR 檢測相對熒光素酶的活性用以驗證circSLCO1B3 與miR-155 之間的結(jié)合關(guān)系。②miR-155 與PTEN 之間的結(jié)合關(guān)系驗證。通過TargetScan 預(yù)測miR-155的下游靶點，發(fā)現(xiàn)PTEN 的3'UTR 存在miR-155 的潛在結(jié)合位點。轉(zhuǎn)染方法同上，共轉(zhuǎn)染分組分別為：野生型PTEN+miR-NC、野生型PTEN+miR-155、突變型PTEN+miRNC、突變型PTEN+miR-155，操作方法同上，qRTPCR 檢測相對熒光素酶的活性用以驗證miR-155 和PTEN之間的作用關(guān)系。

1.3.6 circSLCO1B3、PTEN mRNA、miR-155檢測采用qRT-PCR。根據(jù)RNA抽提試劑盒說明書進行操作，分別提取細胞總RNA，于紫外可見分光光度計上檢測合格后儲存于-20 ℃中備用。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR 試劑盒（使用IQTM5 Multicolor 實時熒光定量系統(tǒng)，美國BioRad）進行相對表達量分析。circSLCO1B3、PTEN、miR-155 及其對照引物均購自廣州復(fù)能基因有限公司，反應(yīng)體系為20 μL，每組含3個復(fù)孔。使用2-ΔΔCT計算分子的相對表達量。

1.3.7 PTEN 蛋白檢測 采用蛋白質(zhì)印跡分析。RIPA 裂解法從細胞中提取總蛋白，然后進行SDSPAGE 凝膠分離實驗。蛋白的轉(zhuǎn)膜條件為300 mA進行2 h。隨后轉(zhuǎn)移PVDF 膜至4 °C 冰箱中，一抗PTEN（1∶1 000）和GAPDH（1∶3 000）分別孵育過夜，次日在室溫條件下采用特異性二抗孵育2 h，最后進行顯影成像，檢測PTEN的蛋白表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。實驗均重復(fù)至少3 次。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circSLCO1B3 在TNBC 細胞中低表達 與正常乳腺上皮細胞MCF-10A 相比，circSLCO1B3 在TNBC細胞系中的表達均下調(diào)，且在腦轉(zhuǎn)移相關(guān)的TNBC細胞HCC38、MDA-MB-231、231Br及鼠源性TNBC細胞4T1 中下調(diào)尤為顯著（P均＜0.05）；與親代TNBC細胞系MDA-MB-231相比，子代腦轉(zhuǎn)移細胞系231Br中的circSLCO1B3 表達下調(diào)更為顯著（P＜0.05），見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測circSLCO1B3在正常乳腺上皮細胞及不同分子分型的乳腺癌細胞中的表達情況

2.2 過表達circSLCO1B3可抑制TNBC 細胞侵襲能力 qRT-PCR結(jié)果顯示：與circCTR-OE組相比，circ-SLCO1B3-OE 組circSLCO1B3 的相對表達量顯著增加（t=11.82，P＜0.05，圖2），circSLCO1B3過表達細胞株231Br/OE 構(gòu)建成功。Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示：與circCTR-OE 組相比，circSLCO1B3-OE 組細胞的侵襲數(shù)量顯著降低（t=4.084，P＜0.05，圖3-4）。

圖2 兩組circSLCO1B3表達比較

圖3 Transwell侵襲實驗中的代表性穿膜細胞圖

圖4 兩組侵襲細胞數(shù)比較

2.3 過表達circSLCO1B3可抑制TNBC 細胞的腦轉(zhuǎn)移能力 左心室注射構(gòu)建的腦轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示：與circCTR-OE 組相比，circSLCO1B3-OE 組細胞的腦轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量顯著降低（t=3.600，P＜0.05，圖5）。circCTR-OE 組和circSLCO1B3-OE 組的腦轉(zhuǎn)移灶HE染色代表性圖片如圖6所示，過表達circSLCO1B3能抑制TNBC細胞的腦轉(zhuǎn)移能力。

圖5 兩組腦轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較

圖6 腦轉(zhuǎn)移組織HE染色

2.4 circSLCO1B3 可作為ceRNA 吸附miR-155 亞細胞定位實驗結(jié)果顯示：與細胞核相比，circSLCO1B3在細胞質(zhì)中相對含量高（t=49.15，P＜0.05，圖7A），circSLCO1B3 的亞細胞定位主要為細胞質(zhì)。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示：與野生型circSLCO1B3+miR-NC 共轉(zhuǎn)染組相比，野生型circSLCO1B3+miR-155 組的相對熒光酶活性顯著降低（t=15.85，P＜0.05，圖7B）；與突變型circSLCO1B3+miRNC 組相比，突變型circSLCO1B3+miR-155 組的相對熒光酶活性無顯著變化（t=1.059，P＞0.05，圖7B）。進一步的qRT-PCR 結(jié)果顯示，與circCTR-OE 組相比，circSLCO1B3-OE 組miR-155 的相對表達量顯著降低（t=10.37，P＜0.05，圖7C）。以上結(jié)果表明在TNBC 中，circSLCO1B3 可吸附miR-155，下調(diào)miR-155的表達水平。

圖7 circSLCO1B3可作為ceRNA吸附miR-155

2.5 circSLCO1B3 通過miR-155/PTEN 調(diào)控TNBC腦轉(zhuǎn)移 熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示：與野生型PTEN+miR-NC 共轉(zhuǎn)染組相比，野生型PTEN+miR-155 組的相對熒光酶活性顯著降低（t=29.09，P＜0.05，圖8A）；與突變型PTEN+miR-NC 組相比，突變型PTEN+miR-155 組的相對熒光酶活性無顯著變化（t=1.750，P＞0.05，圖8A）。miR-155可與PTEN相互作用。進一步的qRT-PCR 結(jié)果顯示：與miR-NC組相比，miR-155 組PTEN mRNA 的相對表達量顯著降低（t=7.87，P＜0.05，圖8B）。與circCTR-OE 組相比，circSLCO1B3-OE 組PTEN mRNA 的相對表達量顯著增加（t=7.223，P＜0.05，圖8C）；而與circSLCO1B3-OE 組相比，circSLCO1B3-OE+miR-155 組PTEN mRNA 的相對表達量則顯著降低（t=6.667，P＜0.05，圖8C），相應(yīng)的PTEN 蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果如圖8D 所示。以上結(jié)果表明，過表達circSLCO1B3 可以上調(diào)TNBC 細胞中的PTEN 表達水平，而過表達miR-155可以逆轉(zhuǎn)circSLCO1B3對PTEN表達的促進作用。

圖8 circSLCO1B3通過miR-155/PTEN調(diào)控TNBC腦轉(zhuǎn)移

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是女性最常見的腫瘤死亡原因之一，其發(fā)病率正不斷上升。腫瘤遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因，其常見轉(zhuǎn)移部位包括骨、肺、肝和腦，其中發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后最差（中位生存時間僅為4～6 個月）［8］。盡管診療水平的進步極大地改善了乳腺癌患者的預(yù)后，乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率依然居高不下，其中以TNBC 患者的腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率最高（30%～50%）。TNBC侵襲性強，極易發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移，常發(fā)生在初次治療后3～5 年內(nèi)［9］。然而，由于缺乏有效的預(yù)后預(yù)測和治療靶點，目前TNBC 腦轉(zhuǎn)移缺乏有效的治療手段。因此，研究TNBC 腦轉(zhuǎn)移的分子機制和搜尋有效的治療靶點有助于提高乳腺癌患者的生存情況。

近年來，隨著對非編碼RNA 生物學(xué)功能研究的不斷深入，circRNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［10］。多個研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。circFBXW7 可通過調(diào)控185-aa 蛋白抑制TNBC的生長與肺轉(zhuǎn)移［11］；下調(diào)circCNOT2的表達可以顯著降低乳腺癌細胞的生存能力［12］；circFECR1可通過調(diào)控DNA 甲基化和去甲基化酶從而促進乳腺癌的遠處轉(zhuǎn)移［13］。以上結(jié)果表明，circRNA 在乳腺癌的進展過程中起著關(guān)鍵作用，但circRNA 在TNBC 腦轉(zhuǎn)移中的作用以及分子機制尚不明確。在本文中，我們通過檢測circSLCO1B3 在乳腺癌細胞系中的表達，發(fā)現(xiàn)circSLCO1B3 在TNBC細胞系中顯著下調(diào)。且相對于親代TNBC 細胞系，子代腦轉(zhuǎn)移細胞系中circSLCO1B3 下調(diào)更明顯，說明circSLCO1B3 可能是TNBC 腦轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的一個circRNA。接下來，通過在腦轉(zhuǎn)移性TNBC 細胞系中過表達circSLCO1B3，我們發(fā)現(xiàn)circSLCO1B3 可顯著抑制TNBC細胞的侵襲及體內(nèi)腦轉(zhuǎn)移能力。

circRNA 是一類內(nèi)源性非編碼RNA，其結(jié)構(gòu)呈閉合環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)。研究表明，circRNA主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達，多含有大量的miRNA 結(jié)合位點，可作為ceRNA，通過自身miRNA應(yīng)答元件競爭結(jié)合miRNA，從而調(diào)控基因的表達水平［14-15］。通過吸附miRNA 進而解除miRNA 對其目的基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用［16-17］，circRNA 調(diào)控著腫瘤細胞的生長、凋亡以及侵襲、遷移等多種生物學(xué)行為［18］。例如，circRNA CDR1as可通過調(diào)控IGF2BP3從而抑制黑色素瘤的遠處轉(zhuǎn)移［19］。又如，circ0000799 通過吸附miR-31-5p，靶向上調(diào)RAB27A的表達，促進膀胱癌的進展［20］。通過亞細胞定位，我們確定了circSLCO1B3主要位于細胞質(zhì)。隨后通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)circSLCO1B3存在miR-155 的結(jié)合位點，而PTEN 是miR-155 的預(yù)測下游靶基因。

既往文獻表明，miR-155 在多種腫瘤中均顯著表達上調(diào)，其高表達均提示腫瘤患者的不良預(yù)后［21］。在乳腺癌，miR-155 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，可促進腫瘤生長、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移［22］。研究顯示，miR-155 可通過抑制PTEN 的表達，激活PI3K/Akt 通路，從而促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移［23］。PTEN 是一個重要的抑癌因子，它具有促進腫瘤細胞凋亡、參與細胞周期的調(diào)控以及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。在乳腺癌中，PTEN 的缺失可通過激活致癌信號通路PI3K/AKT 從而誘導(dǎo)乳腺癌的細胞增殖、凋亡抑制和腫瘤轉(zhuǎn)移［24］。研究表明，miRNA 可通過誘導(dǎo)PTEN 的表達缺失促進乳腺癌的惡性進展。在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移灶中，研究者發(fā)現(xiàn)來自腦微環(huán)境中的星狀細胞通過外泌體釋放靶向PTEN的miRNA，引起PTEN 的表達缺失，從而增強細胞增殖和減少凋亡，促進腦轉(zhuǎn)移瘤細胞的生長［25］。因此，miRNA 誘導(dǎo)的PTEN 的表達缺失是乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的特異性驅(qū)動因素，如何恢復(fù)腦轉(zhuǎn)移灶中PTEN 的表達成為乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的研究關(guān)鍵。通過雙熒光素酶報告基因、qRT-PCR 和Western blotting 實驗，我們證實了circSLCO1B3 與miR-155、PTEN 與miR-155 之間的相互作用關(guān)系，即circSLCO1B3 可通過吸附miR-155，下調(diào)miR-155的表達，最終促進PTEN 的表達而抑制TNBC 腦轉(zhuǎn)移的。circSLCO1B3/miR-155/PTEN軸在TNBC腦轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

目前該機制的嚴謹性仍待完善，后續(xù)將納入多株親代及子代轉(zhuǎn)移性TNBC 細胞系、臨床腦轉(zhuǎn)移樣本，并進行RIP、qRT-PCR、小動物活體成像等實驗進一步驗證。本研究初步證實了circSLCO1B3 與TNBC 腦轉(zhuǎn)移的密切關(guān)聯(lián)，該過程可能是通過調(diào)控miR-155/PTEN 軸實現(xiàn)的，該研究可能為提高TNBC腦轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后提供新的思路和靶點。

利益沖突聲明所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明唐海林，賴潔蘭：研究構(gòu)思與設(shè)計；張穎，宋彩露，劉凌蕊：細胞及動物實驗；張穎，宋彩露：結(jié)果分析與解釋；張穎：起草原稿