錢桂英 錢云英 吳曉明 金鳳珠

摘要：建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定金銀花中9種主要成分的方法。采用負(fù)離子掃描方式，對(duì)主要成分進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析。色譜分離采用 Thermo Hypersil GOLD 色譜柱，柱溫35 ℃。流動(dòng)相由甲醇和 0.2% 甲酸水溶液組成，結(jié)合聚類熱圖分析和主成分分析對(duì)金銀花進(jìn)行綜合分析。結(jié)果表明： 9個(gè)化合物峰面積與濃度之間具有良好的線性關(guān)系（R2>0.999 1），日內(nèi)精密度（0.96%～2.26%）、日間精密度（0.52%～3.04%）和穩(wěn)定性（0.85%～2.15%）均符合相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；回收率在96.77%～101.94%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.48%～4.01%之間；層次聚類分析和主成分分析在內(nèi)的化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)果表明，不同地區(qū)的金銀花活性成分含量存在明顯差異，3-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩釣樨暙I(xiàn)最大的化合物。該研究可為進(jìn)一步開展金銀花有效成分及相關(guān)量效關(guān)系、相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：金銀花；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；化學(xué)計(jì)量學(xué)；多成分；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：R284.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1002-4026（2023）05-0001-08

Analysis of the contents of active ingredients in Lonicerae japonicae flos based on UPLC-MS/MS combined with chemometrics

QIAN Guiying， QIAN Yunying， WU Xiaoming， JIN Fengzhu*

（Changshu Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Changshu 215500， China）

Abstract∶This study aimed to devise a methodology for the simultaneous determination of the contents of nine primary components in Lonicerae japonicae flos through ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The chemometric analysis of the nine primary components was performed via negative ion scanning. Further， chromatographic separation was performed on a Thermo Hypersil GOLD column at a temperature of 35 ℃. The mobile phase comprised methanol and water containing 0.2% formic acid， as determined through the cluster thermogram and principal component analyses of Lonicerae japonicae flos. The peak areas with concentrations of nine components exhibited a good linear relationship （R2>0.999 1）， and the intraday （0.96%～2.26%） and interday （0.52%～3.04%） precisions and stability values （0.85%～2.15%） agreed well with relative standard deviation （RSD）. The recovery rate was between 96.77% and 101.94%， and the RSD was between 2.48% and 4.01%. The results of the chemometric， hierarchical cluster， and principal component analyses revealed that there were considerable differences in the contents of the active ingredients of Lonicerae Japonicae Flos from various regions， and 3-O-caffeoylquinic acid and 3，5-dicaffeoylquinic acid were considered as the dominant compounds. UPLC-MS/MS quantitative and chemometric analyses of Lonicerae Japonicae Flos performed herein may provide a reference for the modernization of and innovative research on the effective ingredients of Lonicerae Japonicae Flos and related quantity effect relations as well as the quality control of related products.

Key words∶Lonicerae japonicae flos; UPLC-MS/MS; chemometrics; multicomponent; assay

金銀花是忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾或帶初開的花，原產(chǎn)于中國，大約1 500 年前，在現(xiàn)今的河南等地大量種植[1]，常用于治療癰腫疔瘡、咽喉麻木、丹毒、血毒毒痢、風(fēng)熱感冒、溫?zé)岬取，F(xiàn)代藥理研究表明，金銀花具有抗炎、抗氧化、保肝、細(xì)胞保護(hù)、抗菌、抗糖尿病和抗乙型肝炎病毒等活性，化學(xué)成分為黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜皂苷、生物堿等[2-4]。目前，金銀花種植區(qū)主要集中在山東、山西、河南、河北、湖北、江西、廣東等地，由于地理?xiàng)l件、氣候等原因，每個(gè)產(chǎn)地的金銀花主要有效成分的含量存在差異，功效也會(huì)有所不同[5-7]。金銀花中發(fā)揮抗菌和抗炎作用的主要成分是黃酮類和酚酸類物質(zhì)，2020版《中國藥典》中還規(guī)定了其指標(biāo)成分為3-O-咖啡?？鼘幩岷湍鞠菟豙8]。因此，有必要以酚酸類和黃酮類物質(zhì)為指標(biāo)，對(duì)金銀花進(jìn)行質(zhì)量控制。目前，高效液相色譜（HPLC）為測(cè)定中藥成分含量的常用手段。隨著超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的出現(xiàn)，其高選擇性、高靈敏度使中藥定量分析技術(shù)更加成熟并得到廣泛應(yīng)用[9-12]。金銀花目前的質(zhì)量控制研究重點(diǎn)在其化學(xué)成分的種類和含量，控制技術(shù)主要有HPLC法、UPLC法、UPLC-MS聯(lián)用、一測(cè)多評(píng)等；除了在有效成分的含量上控制，有害成分如重金屬和農(nóng)藥殘留等控制標(biāo)準(zhǔn)均有報(bào)道[13-14]。在本文中，建立了 UPLC-MS/MS 方法測(cè)定來自 10 個(gè)不同地區(qū)的金銀花的有效成分含量，在負(fù)離子掃描模式下，測(cè)定了9種抗菌消炎的主要成分，對(duì) 10 批樣品進(jìn)行了化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，以期為金銀花的有效成分及相關(guān)量效關(guān)系、相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

UPLC-TSQ QUANTIS三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)（Thermo Scientific），JA203H型十萬分之一電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司），KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（青島精誠儀器儀表有限公司），DZKW-C型水浴鍋（河南沃林儀器設(shè)備有限公司）。

HPLC級(jí)甲醇（Fisher Scientific），HPLC 級(jí)甲酸（Sigma），蒸餾水（杭州娃哈哈集團(tuán)）。所有其他試劑均為分析純。10批次的金銀花信息見表1。所有樣品由南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院主任中藥師金鳳珠鑒定為金銀花正品。3，4-二羥基苯甲酸（批號(hào)SH-211102）、5-O-咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)SH-211021）、3-O-咖啡酰奎寧酸（批號(hào)SH-220321）、4-O-咖啡酰奎寧酸（批號(hào)SH-220122）購自上海源葉生物科技有限公司?？Х人幔ㄅ?hào)110885-201703）、3，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)111782-202208）、木犀草苷（批號(hào)111720-202111）、蘆?。ㄅ?hào)100080-202012）、4，5-二咖啡酰奎寧酸（批號(hào)111894-202205）、標(biāo)準(zhǔn)品酸和內(nèi)標(biāo)氯霉素（批號(hào)130303-202115）購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

金銀花粉末過60目篩，取粉末0.05 g，加入10 mL甲醇， 35 Hz超聲提取30 min。然后將樣品以5 000 r/min[JP]離心15 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 對(duì)照品溶液制備

9種標(biāo)準(zhǔn)品適量溶解于甲醇中制備儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度均為 1.00 mg/mL）。

2.3 分析條件

色譜條件：采用Thermo Hypersil GOLD 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），柱溫35 ℃。流動(dòng)相由甲醇（A）和0.2%甲酸水（B）組成。梯度洗脫：0～6 min，90%～83% B；6～7min，83%～60% B；7～12 min，60%～50% B；12～13 min，50%～90% B；13～15 min，90% B。流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為2 μL。

質(zhì)譜條件：所有樣品均在負(fù)離子模式下進(jìn)行分析。分析方法采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的選擇性反應(yīng)模式（MRM）。優(yōu)化參數(shù)設(shè)置如下：鞘氣30 kPa；輔助氣10 kPa；吹氣：0 kPa，離子傳輸管溫度325 ℃，蒸發(fā)器溫度350 ℃，各組分監(jiān)測(cè)條件見表2。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察

取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液適量，按2.3項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。根據(jù)離子對(duì)，樣品與對(duì)照品的保留時(shí)間，質(zhì)譜信息保持一致，待測(cè)成分分離效果良好，無干擾，結(jié)果見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品母液溶液，用溶劑稀釋至不同濃度后依次進(jìn)行分析，記錄峰面積，以峰面積 （Y） 為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度 （X） 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表3。

2.4.3 精密度試驗(yàn)

取同一份混合對(duì)照品溶液，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，測(cè)得日內(nèi)精密度3，4-二羥基苯甲酸、5-O-咖啡?？鼘幩?、3-O-咖啡?？鼘幩?、咖啡酸、4-O-咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷、蘆丁及4，5-二咖啡?？鼘幩嵯鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差δRSD分別為1.79%、1.92%、2.13%、0.96%、1.93%、2.26%、1.93%、1.60%、1.92%；每天進(jìn)樣3次，連續(xù)進(jìn)樣3 d，測(cè)定日間精密度δRSD分別為0.85%、1.10%、2.12%、1.37%、0.52%、0.63%、1.29%、1.66%、3.04%。表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（S1）按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行測(cè)定，3，4-二羥基苯甲酸、5-O-咖啡?？鼘幩帷?-O-咖啡酰奎寧酸、咖啡酸、4-O-咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡?？鼘幩帷⒛鞠蒈?、蘆丁及4，5-二咖啡?？鼘幩岱迕娣e的δRSD分別為0.85%、0.90%、1.32%、0.97%、2.15%、0.98%、0.96%、1.30%、1.74%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（S1），按2.1項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，以2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得3，4-二羥基苯甲酸、5-O-咖啡酰奎寧酸、3-O-咖啡?？鼘幩?、咖啡酸、4-O-咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡?？鼘幩帷⒛鞠蒈?、蘆丁及4，5-二咖啡?？鼘幩岬钠骄糠謩e為20.12 μg/g（δRSD=2.26%）、2 431.45 μg/g（δRSD=3.21%）、22 146.58 μg/g（δRSD= 2.71%）、34.03 μg/g（δRSD=2.57%）、878.64 μg/g（δRSD=2.62%）、1 347.08 μg/g（δRSD= 2.39%）、68.49 μg/g（δRSD= 2.76%）、69.42 μg/g（δRSD=3.32%）及2 212.44 μg/g（δRSD=2.31%），表明重復(fù)性良好。

2.4.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量樣品（S1）0.05 g，共6 份，按100%的量各加入3，4-二羥基苯甲酸、5-O-咖啡?？鼘幩?、3-O-咖啡酰奎寧酸、咖啡酸、4-O-咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩?、木犀草苷、蘆丁及4，5-二咖啡酰奎寧酸對(duì)照品的混合溶液，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，得3，4-二羥基苯甲酸、5-O-咖啡酰奎寧酸、3-O-咖啡酰奎寧酸、咖啡酸、4-O-咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩帷⒛鞠蒈?、蘆丁及4，5-二咖啡?？鼘幩崞骄厥章试?6.77%～101.94%，δRSD在2.48%～4.01%（均低于5.0%），表明方法的準(zhǔn)確度符合要求，結(jié)果見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1。

2.5 樣品含量測(cè)定

取10批樣品，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以9個(gè)化合物為指標(biāo)成分進(jìn)行聚類分析和熱圖分析，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示10批次樣品被分成許多簇，說明即使是同一種中藥，其含量在不同產(chǎn)地之間也存在較大差異。在熱圖中，可以觀察到3-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩崾菢悠返闹饕煞?。

主成分分析如圖3所示，S7和S9樣品與其他批次樣品存在顯著差異，這與定量分析中S7類黃酮含量較高和S9酚酸含量較高的結(jié)果一致。此外，3-O-咖啡?？鼘幩岬呢暙I(xiàn)率為97%，3，5-二咖啡?？鼘幩岬呢暙I(xiàn)率為2%，3-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩岬睦塾?jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到99%，表明3-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩崾墙疸y花的主要成分，此結(jié)果與熱圖的結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

為了獲得高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品溶液，我們進(jìn)行了提取優(yōu)化試驗(yàn)。首先，研究了9種化合物在不同溶劑中的提取效率，以最大限度地提高化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。用4種不同比例的甲醇溶液（甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為100%、85%、70%、50%）和4種不同比例的乙醇溶液（乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為100%、85%、70%、50%）超聲提取60 min。發(fā)現(xiàn)100%甲醇作為溶劑時(shí)，9種成分的提取效率最好。其次，為了獲得更好的提取效果，考察了提取時(shí)間對(duì)9種化合物提取效率的影響，進(jìn)行超聲提取30、45、60、90 min，發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間對(duì)結(jié)果沒有顯著差異，因此，選擇30 min的最短提取時(shí)間。此外，我們選擇了 Thermo Hypersil GOLD 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）和 Waters Acquity UHPLC HSS T3 色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）。在相同柱溫、流動(dòng)相和梯度洗脫條件下，Thermo Hypersil GOLD 色譜柱具有更好的分離效果、更好的峰形和更短的保留時(shí)間。因此，我們選擇了 Thermo Hypersil GOLD 色譜柱進(jìn)行分離。

在本研究中，建立了一種 UPLC-MS/MS 方法，用于快速同時(shí)測(cè)定金銀花中的 9 種化合物。經(jīng)驗(yàn)證該方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。以9個(gè)化合物為指標(biāo)成分進(jìn)行聚類分析和熱圖分析，結(jié)果顯示10批次樣品被分成許多簇，說明即使是同一種中藥，其含量在不同產(chǎn)地之間也存在較大差異。在熱圖中，可以觀察到3-O-咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?？鼘幩崾菢悠返闹饕煞??；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)果表明，金銀花的區(qū)域差異很大，9種化合物中3-O-咖啡酰奎寧酸和3，5-二咖啡?？鼘幩岬睦塾?jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到99%。綜上所述，UPLC-MS/MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)是一種簡單有效的控制金銀花品質(zhì)的方法，該研究為金銀花的可持續(xù)發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)，為中藥的綜合開發(fā)利用提供了技術(shù)思路。

參考文獻(xiàn)：

［1］李曉婭， 李欽， 張峰， 等. 金銀花采收及產(chǎn)地初加工研究[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥， 2020， 31（1）： 97-99. DOI： 10.3969/j.issn.1008-0805.2020.01.031.

[2]李蘭， 段政， 湯有宏， 等. 金銀花總黃酮的提取工藝及其抗氧化性研究[J]. 釀酒， 2022， 49（6）：131-136. DOI： 10.3969/j.issn.1002-8110.2022.06.035.

[3]郝夢(mèng)超， 安超娜， 王乙穎， 等. 金銀花黃酮的提取工藝及其藥理活性研究進(jìn)展[J]. 飲料工業(yè)， 2022， 25（5）：71-75. DOI： 10.3969/j.issn.1007-7871.2022.05.017.

[4]張浩， 葉靜， 馬長宏， 等. 不同產(chǎn)地金銀花中酚酸類含量的測(cè)定[J]. 人參研究， 2022， 34（5）： 20-22. DOI： 10.19403/j.cnki.1671-1521.2022.05.005.

[5]壽璐佳， 趙晨陽， 顏世利， 等. GC-MS指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析不同產(chǎn)地金銀花揮發(fā)油的成分變化[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 39（8）： 913-918. DOI： 10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2021.1401.

[6]劉艷萍， 王云， 賈哲， 等. 基于GC-MS和多元統(tǒng)計(jì)方法分析不同產(chǎn)地金銀花揮發(fā)性成分的差異[J]. 中國中藥雜志， 2022， 47（20）： 5508-5519. DOI： 10.19540/j.cnki.cjcmm.20220712.102.

[7]劉天亮， 楊林林， 董誠明， 等. 基于化學(xué)模式識(shí)別的不同產(chǎn)地金銀花HPLC指紋圖譜研究[J]. 中草藥， 2022， 53（15）：4833-4843. DOI： 10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.027.

[8]國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典2020年版一部[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020： 230.

[9]易可可， 謝潔， 江游， 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 質(zhì)譜學(xué)報(bào)， 2022， 43（6）：804-816. DOI： 10.7538/zpxb.2021.0146.

[10]車爽. UPLC-Q-TOF-MS聯(lián)合UNIFI技術(shù)在中藥分析領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 天津藥學(xué)， 2022， 34（3）：67-74. DOI： 10.3969/j.issn.1006-5687.2022.03.016.

[11]姜艷玲， 李嬋， 趙敏. UPLC-TOF-MS/MS在醫(yī)藥分析檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 精細(xì)化工中間體， 2022， 52（1）： 12-16. DOI： 10.19342/j.cnki.issn.1009-9212.2022.01.003.

[12]徐東升， 何云嬌， 鐘靈佼. UPLC-QQQ-MS/MS在中藥分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志， 2021， 33（11）： 2247-2250. DOI： 10.16448/j.cjtcm.2021.1149.

[13]楊志敏， 朱仁愿， 薛華麗， 等. 改良QuEChERS-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定金銀花中農(nóng)藥殘留[J]. 分析試驗(yàn)室， 2023， 42（1）： 49-56. DOI： 10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2021.121002.

[14]卜桐， 于曉， 張欣芮， 等. 金銀花中重金屬污染分析及其健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J]. 中國中藥雜志， 2022， 47（3）： 643-650. DOI： 10.19540/j.cnki.cjcmm.20211106.102.