車笑吟,涂會鑫,楊舒涵,李琪瑤,董文龍

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院,吉林 吉林 132109)

奶牛乳房炎是奶牛飼養(yǎng)過程中一種危害極大的疾病,一旦發(fā)生會對奶牛胎次和產(chǎn)奶量產(chǎn)生影響,降低鮮奶的適口性和營養(yǎng)成分[1],而且增加治療成本和額外勞動力[2]。研究表明,奶牛乳房炎可由大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)和化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes,T.pyogenes)等多種病原體引起,其中S.aureus引起的奶牛乳房炎約占50%[3]。S.aureus具有多種毒力因子,其產(chǎn)生的腸毒素sea、seb、sec、sed和see等會溶于牛奶中,如不慎飲用易使人患扁桃體炎和咽喉炎等疾病[4]。目前,使用細(xì)菌素是治療奶牛乳房炎較為理想的方法,可避免抗生素治療后在牛奶中的殘留,不破壞人體內(nèi)正常的益生菌,不會引起部分人對抗生素的過敏反應(yīng),不會使人體對抗生素產(chǎn)生耐藥性,且不易引發(fā)重復(fù)感染。

S.aureus極易產(chǎn)生耐藥性[5],治療該菌引起的奶牛乳房炎主要有以下難點(diǎn):S.aureus可能帶有多重耐藥基因,對多種抗生素具有耐藥性,限制了治療藥物的選擇;S.aureus還能侵入宿主細(xì)胞內(nèi),從而避免了部分抗生素的抗菌作用;S.aureus含有大量可移動遺傳元件,可實(shí)現(xiàn)耐藥基因在不同菌株間的轉(zhuǎn)移[6]。新疆牛源S.aureus臨床抗菌素敏感性調(diào)查結(jié)果顯示,牛源S.aureus呈現(xiàn)出多重耐藥的特征,大部分菌株同時對5種以上常用類型抗生素耐藥[7]。奶牛乳房炎的臨床治療,主要有中醫(yī)療法和西醫(yī)療法,中醫(yī)療法易受藥物質(zhì)量、有效成分等因素影響,易出現(xiàn)治療效果不佳的情況,且治療成本偏高;西醫(yī)療法中長期使用抗生素易導(dǎo)致耐藥菌株增多,治療后病癥易反復(fù)[8]。據(jù)報(bào)道,牛奶中80%的殘留藥物來源于治療奶牛乳房炎的藥品[9]。細(xì)菌素是一種水解蛋白類物質(zhì),能有效地滲透生物膜且對人體無害。與抗生素相比,細(xì)菌素的抗菌譜較窄,具有一定的專一性和靶向性,且不易產(chǎn)生耐藥性[10]。本試驗(yàn)從平菇中分離出1株產(chǎn)細(xì)菌素糞腸球菌,該細(xì)菌素僅對S.aureus具有抗菌作用,該細(xì)菌素有望作為動物生產(chǎn)生活中S.aureus感染的替抗產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 新鮮平菇,購自吉林省吉林市某市場。

1.1.2 菌種 標(biāo)準(zhǔn)株:S.aureusATCC25923、E.coliATCC25922、T.pyogenesATCC19411;奶牛乳房炎臨床分離株:S.aureus:S1、S2,E.coli:E1、E2,T.pyogenes:T1、T2,均由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院動物微生物與免疫研究室保存。

1.1.3 主要試劑 MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基,均購自青島海博生物技術(shù)有限公司;革蘭染色試劑,購自北京索萊寶科技有限公司;DNA提取試劑盒,購自南京諾唯贊生物科技有限公司;過氧化氫酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺和PCR儀,均購自賽默飛世爾科技公司;恒溫氣浴振蕩器,購自上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;高速離心機(jī),購自鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;凝膠成像儀,購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離和純化 無菌條件下將平菇接種于乳酸細(xì)菌MRS肉湯培養(yǎng)基中,置于37 ℃搖床培養(yǎng)至菌液渾濁,涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)后進(jìn)行純化,直至出現(xiàn)單菌落。

1.2.2 產(chǎn)抗菌物質(zhì)菌株的篩選 將純化后的單菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基,37 ℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期,室溫6 000 r/min離心10 min,取上清液,使用0.22 μm濾膜抽濾除菌,抽濾后的上清液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,于50 ℃進(jìn)行濃縮,將其體積濃縮為原體積的1/10,再次抽濾得到無菌濃縮上清液。在MH瓊脂培養(yǎng)基上以S.aureusATCC25923為指示菌采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn),每孔加入200 μL經(jīng)針式過濾器過濾后的濃縮上清液,室溫靜置1 h,37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h,測量抑菌圈直徑,以此篩選產(chǎn)抗菌物質(zhì)的菌株。為減小試驗(yàn)誤差,所有抑菌試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù),所得抑菌圈大小取平均值。

1.2.3 抗菌物質(zhì)的初步確證 為排除過氧化氫的影響,在2 mL濃縮上清液中添加0.02 g過氧化氫酶,37 ℃水浴4 h后煮沸10 min,以未加入過氧化氫酶的原始濃縮上清液作為對照組;為了排除酸性物質(zhì)的影響,將濃縮上清液用氫氧化鈉和乳酸調(diào)節(jié)至pH=7,以未調(diào)節(jié)pH的原始濃縮上清液作為對照組,按1.2.2進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.4 菌落和菌體形態(tài)的觀察 將產(chǎn)抗菌物質(zhì)的細(xì)菌接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h,觀察菌落形態(tài),挑取單個菌落在酒精燈火焰上加熱固定,按照革蘭染色試劑盒說明書操作進(jìn)行染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.5 菌株的16S rRNA PCR鑒定 將純化后的單菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期,取1 mL菌液,12 000 r/min離心1 min,棄去上清液,收集菌體沉淀,按照DNA提取試劑盒說明書操作提取細(xì)菌基因組DNA。

以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增,使用細(xì)菌16S rRNA通用引物[11]:上游引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下游引物:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL:上、下游引物各1 μL,模板DNA 5 μL,PCR Mix 12.5 μL,ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共30個循環(huán);最后 72 ℃延伸7 min。取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,檢測合格樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。將16S rRNA測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行BLAST比對分析。

1.2.6 菌株分泌細(xì)菌素的蛋白酶敏感性測定 在菌株分泌細(xì)菌素中以0.2 g/mL為終濃度加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K。其中加入木瓜蛋白酶的細(xì)菌素置于55 ℃水浴,加入其余蛋白酶的細(xì)菌素置于37 ℃水浴,所有樣品水浴4 h后取出,沸水浴處理10 min使酶失活,按1.2.2進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.7 菌株分泌細(xì)菌素的穩(wěn)定性 取5等份菌株分泌細(xì)菌素,將其pH分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0和7.0,靜置2 h,再將pH調(diào)回至4.6,按1.2.2進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。取4等份菌株分泌細(xì)菌素,將其分別放入60、70、80、90和100 ℃水浴中加熱處理1 h,冷卻后按1.2.2進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.8 菌株分泌細(xì)菌素的抑菌譜檢測 選用導(dǎo)致奶牛乳房炎的E.coli、S.aureus、T.pyogenes為檢測對象,以10倍濃縮的MRS瓊脂培養(yǎng)基為對照組,再分別以S.aureusATCC25923、S1、S2、E.coliATCC25922、E1、E2、T.pyogenesATCC19411、T1、T2為指示菌,按1.2.2進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)抗菌物質(zhì)菌株的篩選 經(jīng)過初步篩選發(fā)現(xiàn)僅1株菌株的發(fā)酵上清液對S.aureusATCC25923具有抗菌作用,抑菌圈直徑平均值大小約為(20±1) mm。

2.2 抗菌物質(zhì)的初步確證 結(jié)果顯示,過氧化氫酶處理過的濃縮上清液抑菌圈直徑大小不變,說明抗菌物質(zhì)中不含過氧化氫;該細(xì)菌濃縮上清液的原始pH=4.6,將其調(diào)節(jié)至pH=7.0后仍有抑菌圈出現(xiàn),說明起到抗菌活性的物質(zhì)并非完全是酸性物質(zhì)。

正因其抗菌作用并非由過氧化氫和酸性物質(zhì)產(chǎn)生,故初步推斷該抗菌物質(zhì)為細(xì)菌素。

2.3 菌落和菌體形態(tài)的觀察 MRS瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)白色、邊緣整齊的光滑、圓形菌落(圖1A);顯微鏡下革蘭染色呈陽性,成雙或短鏈排列的卵圓形球菌,無芽孢、無莢膜(圖1B)。

圖1 菌落(A)和菌體(B,1 000×)形態(tài)觀察Fig.1 Morphological observations of colony (A) and bacteria (B,1 000×)

2.4 菌株的16S rRNA PCR鑒定 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示,在1 500 bp左右出現(xiàn)明顯條帶,16S rRNA基因 PCR擴(kuò)增片段大小與預(yù)期目的基因片段大小一致。分離菌株16S rRNA測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中糞腸球菌的同源性高達(dá)99.35%,遂將該菌株命名為EF-3。

2.5 EF-3分泌細(xì)菌素的蛋白酶敏感性測定 結(jié)果顯示,胰蛋白酶和蛋白酶K處理后的細(xì)菌素抗菌活性明顯下降,而經(jīng)胃蛋白酶和木瓜蛋白酶處理的細(xì)菌素抗菌活性均無明顯變化(表1)。

表1 蛋白酶對EF-3分泌細(xì)菌素活性的影響Table 1 Effect of proteases on the activity of EF-3 secreted bacteriocins

2.6 EF-3分泌細(xì)菌素的穩(wěn)定性 結(jié)果顯示,EF-3分泌細(xì)菌素抗菌活性幾乎不受溫度的影響,在100 ℃水浴4 h條件下依舊具有良好抗菌活性;但抗菌活性受環(huán)境pH變化影響較大,該細(xì)菌素在pH=4.0～6.0時能保持較強(qiáng)抗菌活性,在pH=3.0時失去抗菌活性(表2)。

表2 溫度和pH對EF-3分泌細(xì)菌素抗菌能力的影響Table 2 Effect of temperature and pH on the antibacterial ability of EF-3 secreted bacteriocins

表3 細(xì)菌素的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectrum of the bacteriocins

2.7 EF-3分泌細(xì)菌素的抑菌譜檢測 結(jié)果顯示,該細(xì)菌素僅對S.aureusATCC25923、S1、S2有抗菌作用;對E.coli、T.pyogenes的標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株均無抗菌活性。

3 討論

S.aureus是引發(fā)奶牛乳房炎的重要病原菌,主要通過奶牛的乳頭導(dǎo)管或乳房皮膚外傷進(jìn)入乳房引發(fā)炎癥,病牛主要癥狀是泌乳減少,如果沒有得到合理治療會對發(fā)情和泌乳產(chǎn)生影響,形成瞎乳頭,給奶牛產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展帶來巨大挑戰(zhàn)。目前,臨床主要依賴抗生素對奶牛乳房炎進(jìn)行防治,但長期濫用抗生素會使致病菌產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性并且危害動物體內(nèi)正常的有益菌群,嚴(yán)重時可導(dǎo)致動物死亡[12],同時奶制品中殘留的抗生素嚴(yán)重危害人體健康。

糞腸球菌作為人和動物腸道內(nèi)主要的菌群之一,可以抑制大腸桿菌和沙門菌等病原菌的生長,能夠改善腸道微循環(huán),其代謝可產(chǎn)生有機(jī)酸、蛋白質(zhì)等大分子生物活性物質(zhì)。研究表明,其部分代謝產(chǎn)物具有良好的抗菌作用[13-16]。而細(xì)菌素對動物體很安全,且具有不易產(chǎn)生耐藥性、作用快、耐高溫、無殘留、無毒等優(yōu)點(diǎn)[17],可用于代替抗生素控制致病菌的滋生和傳播,對保障動物健康具有重要意義。寶冠媛等研究表明,糞腸球菌細(xì)菌素抑菌譜較廣[18],無法對特定的細(xì)菌進(jìn)行針對性消滅。而本試驗(yàn)中糞腸球菌EF-3所分泌的細(xì)菌素僅針對S.aureus具有良好的抗菌活性,且具有良好的穩(wěn)定性,有望作為防控奶牛乳房炎源S.aureus感染的替抗產(chǎn)品,具有重大研究價值和應(yīng)用前景。