張 亞,胡小飛,段佳蕾,田 輝,孫 哲,霍環(huán)艷,薛景景,張盼濤,田克恭

(1. 國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心,河南 洛陽(yáng) 471000 ; 2. 普萊柯生物工程股份有限公司,河南 洛陽(yáng) 471000)

雞傳染性貧血(Chicken infectious anemia,CIA)是由雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)引起的雛雞以貧血和免疫抑制為主要特征的傳染病。該病于1979年首次在日本被發(fā)現(xiàn)[1],我國(guó)于1992年由崔現(xiàn)蘭等[2]首次報(bào)道,此后全國(guó)各地陸續(xù)出現(xiàn)相關(guān)報(bào)道[3-5]。CIA發(fā)病特征主要表現(xiàn)為淋巴器官萎縮、骨髓細(xì)胞脂肪化和再生障礙性貧血[6]。育成雞群感染CIAV表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩、體重下降。若產(chǎn)蛋雞群在開產(chǎn)初期感染CIAV,會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)蛋率上升緩慢;在產(chǎn)蛋高峰期感染該病毒則導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降10%～25%。種雞感染CIAV,可傳播給后代雛雞,造成雛雞死亡率增加。商品雞群感染CIAV則引起飼料轉(zhuǎn)化率下降、料肉比增加,嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。CIAV的另一重大危害是與其他病原(如馬立克氏病病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生征病毒、禽白血病病毒等)混合感染,可使CIAV的致病性增強(qiáng),加劇雞群病癥表現(xiàn),死亡率增加[7]。張言坤[8]研究顯示,CIAV感染可影響其他疫苗的免疫效力。

目前,CIAV只有1個(gè)血清型,但是不同地區(qū)CIAV分離株之間的基因組序列存在差異,毒力也有所不同[9,10]。CIAV基因組由單鏈環(huán)狀負(fù)鏈DNA組成,大小為2 298 bp或2 319 bp,共編碼3種病毒蛋白,分別為VP1、VP2和VP3[11]。VP1為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,變異率最大,高變區(qū)為第139～151位氨基酸,Renshaw等[12]報(bào)道顯示,高變區(qū)內(nèi)的第139和144位氨基酸在CIAV的繁殖和傳播中起重要作用;VP2為非結(jié)構(gòu)蛋白,較為保守;VP3又稱為凋亡素,可誘導(dǎo)感染細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此,VP1基因序列常被用來進(jìn)行毒株的變異情況分析,關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)常被用來進(jìn)行毒株的致病力分析。本試驗(yàn)于2020年從江西省、寧夏回族自治區(qū)和山東省3個(gè)大型雞場(chǎng)采集的臨床樣品中分離CIAV,并對(duì)CIAV分離株進(jìn)行VP1基因遺傳進(jìn)化分析,以期對(duì)CIAV的流行、病毒的遺傳變異規(guī)律及防控技術(shù)研究提供理論和方法的參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品 共10份肝臟和脾臟組織樣品,于2020年分別采集自山東省、江西省和寧夏回族自治區(qū)3個(gè)疑似感染CIAV的養(yǎng)殖場(chǎng),3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病雞臨床表現(xiàn)均為精神沉郁、羽毛粗亂,部分雞只雞冠蒼白,剖檢肝臟和脾臟腫大。

1.2 SPF種蛋和SPF雞 SPF種蛋,購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司;SPF雞胚,購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司,于普萊柯生物工程股份有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(豫)2014—0001]禽用負(fù)壓區(qū)動(dòng)物房飼養(yǎng)至1日齡開展試驗(yàn)。

1.3 主要試劑 DNA抽提試劑盒,購(gòu)自旭基科技股份有限公司;DNA Marker和PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 Plus Dye),均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;引物合成和基因測(cè)序,均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.4 主要儀器 PCR儀(C1000 Touch)和凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc TMXR),美國(guó)伯樂公司產(chǎn)品;電泳儀(DYY-2C),北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;多樣品組織研磨器,上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品;負(fù)壓型安全隔離器,蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.5 病毒分離培養(yǎng)和鑒定 取黃豆大小臟器組織樣品,剪碎,按照1∶1比例加入pH 7.4無菌PBS,充分研磨,按1∶5體積比加入含5 000 U/mL三抗(青霉素、鏈霉素和卡那霉素)的PBS,反復(fù)凍融3次,于2～8 ℃作用4 h,4 ℃、5 000 r/min離心10 min,收集上清并濾過除菌。取200 μL過濾病毒液用于基因組DNA提取,并進(jìn)行PCR鑒定。PCR鑒定為陽(yáng)性的病毒液,接種6日齡SPF雞胚,每胚0.2 mL,置于37 ℃孵育觀察14 d,收獲1～14 d死亡雞胚和14 d存活雞胚的肝臟組織。按上述相同方法研磨、凍融、離心、濾過除菌制備組織上清液,接種6日齡SPF雞胚,如此盲傳3代,提取第3代盲傳產(chǎn)物基因組DNA,以此為模板,進(jìn)行PCR鑒定。引物序列、擴(kuò)增條件和檢測(cè)方法均參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行,PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果為陽(yáng)性的病毒液置于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6VP1基因序列擴(kuò)增和測(cè)序 根據(jù)GD-101株(GenBank:KU050680)基因序列設(shè)計(jì)合成2對(duì)針對(duì)VP1基因的測(cè)序引物,引物名稱和序列見表1。參照病毒DNA抽提試劑盒說明書,提取病毒DNA,以其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系50 μL:2×PremixTaq25 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,滅菌雙蒸水21 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)并純化后,送公司測(cè)序。

1.7VP1基因序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建 應(yīng)用Lasergene軟件,按照Clustal W計(jì)算方法,對(duì)分離獲得的VP1基因序列,與GenBank中CIAV參考毒株(參考毒株信息見表2)核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)。應(yīng)用MEGA 6.0分析軟件進(jìn)行VP1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析,采用鄰位相接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,用Bootstrap值評(píng)估進(jìn)化樹的可靠性。

1.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 取1.5獲得的所有陽(yáng)性病毒液分別進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn),根據(jù)陽(yáng)性病毒液的數(shù)量進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)分組。將1日齡SPF雞隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組,每組10只,其中試驗(yàn)組為病毒感染組,分組的數(shù)量依陽(yáng)性病毒液的數(shù)量而定。試驗(yàn)組以腿部肌肉注射方式分別接種0.2 mL病毒液(103.5EID50),對(duì)照組接種同樣劑量的pH 7.4無菌PBS。每日觀察雞只的臨床癥狀,試驗(yàn)第14天于各組中隨機(jī)抽取3只雞采集抗凝血,比較對(duì)照組與試驗(yàn)組血液變化。采血后剖檢雞只,觀察剖檢病變,同時(shí)將骨髓、胸腺、法氏囊用10%福爾馬林固定,經(jīng)常規(guī)組織脫水、透明、包埋、切片,進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin, H.E.)染色,顯微鏡下觀察并記錄病理變化。第21天將全部剩余雞只按上述同樣操作,進(jìn)行觀察、采血、剖檢和組織病理學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離培養(yǎng)和鑒定 將10份組織樣品按照1.5方法操作獲得第3代盲傳產(chǎn)物,以提取的基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示,3份樣品擴(kuò)增出675 bp條帶,與預(yù)期結(jié)果一致,為CIAV陽(yáng)性;其余7份樣品無條帶產(chǎn)生,為陰性(圖1)。將分離獲得的3株陽(yáng)性毒株分別命名為202006-JX-016、202006-NX-4-2和202006-SD-2-1。

圖1 病料樣品的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of diseased samplesM:DL2 000 Marker; +:陽(yáng)性對(duì)照; -:陰性對(duì)照; 1～3:來自江西省的3份病料; 4～6:來自寧夏回族自治區(qū)的3份病料;7～10:來自山東省的4份病料M:DL2 000 Marker;+:Positive control;-:Negative control;1-3:Three diseased samples from Jiangxi;4-6:Three diseased samples from Ningxia;7-10:Four diseased samples from Shandong

2.2VP1基因序列擴(kuò)增和測(cè)序 應(yīng)用CIAV分段引物對(duì)3株分離毒株的VP1基因進(jìn)行PCR分段擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物片段分別為1 499 bp和783 bp(圖2),與預(yù)期結(jié)果一致。將PCR產(chǎn)物測(cè)序、拼接后得到分離株VP1基因序列。

圖2 VP1基因序列的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of VP1 gene sequenceA:VP1基因的PCR擴(kuò)增片段1; B:VP1基因的PCR擴(kuò)增片段2 (M:DL2 000 Marker; +:陽(yáng)性對(duì)照; -:陰性對(duì)照; 1:202006-JX-016; 2:202006-NX-4-2; 3:202006-SD-2-1)A:PCR amplification fragment 1 of VP1 gene; B:PCR amplification fragment 2 of VP1 gene (M:DL2 000 Marker; +:Positive control;-:Negative control; 1:202006-JX-016; 2:202006-NX-4-2; 3:202006-SD-2-1)

2.3VP1基因序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

2.3.1VP1核苷酸相似性分析 3株分離株202006-JX-016、202006-NX-4-2和202006-SD-2-1的核苷酸相似性介于97.7%～99.6%。202006-NX-4-2株與Ⅱ分支參考株核苷酸相似性介于97.8%～99.3%,與GX1804株相似性最高,且除與JL15120株相似性為97.8%外,與其他Ⅱ分支參考株相似性均在99.0%以上;202006-SD-2-1株和202006-JX-016株與Ⅱ分支參考株核苷酸相似性分別介于97.1%～99.6%和97.2%～99.5%,均與JL15120株相似性最高(圖3)。

2.3.2VP1基因氨基酸序列分析 將3株分離株和國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒株GD-101株的VP1基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)202006-JX-016株、202006-NX-4-2株和202006-SD-2-1的株的毒力相關(guān)位點(diǎn)(第75、89、125、139、141、144和394位)均與GD-101株一致(表3)。

表3 202006-JX-016株、202006-NX-4-2株和202006-SD-2-1株氨基酸位點(diǎn)比較Table 3 Comparison of amino acid sites among strains 202006-JX-016,202006-NX-4-2 and 202006-SD-2-1

2.3.3 遺傳進(jìn)化分析 將3株分離株VP1基因核苷酸序列與國(guó)內(nèi)外參考株序列(表2)進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建VP1基因進(jìn)化樹,結(jié)果顯示,進(jìn)化樹由4個(gè)分支組成,3株分離株均屬于同一進(jìn)化分支(Ⅱ分支),與經(jīng)典株Cux-1株(Ⅰ分支)不屬于同一進(jìn)化分支;202006-JX-016株和202006-SD-2-1株與JL15120株進(jìn)化關(guān)系最近,202006-NX-4-2株與其他Ⅱ分支參考株有更近的遺傳距離(圖4)。

圖4 基于分離株VP1基因的遺傳進(jìn)化樹Fig.4 Plylogenetic tree based on VP1 gene of the isolates●:本試驗(yàn)分離株; ▲:疫苗參考株●:Strains isolated in this study; ▲:Vaccine reference strains

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 選擇1日齡SPF雞對(duì)3株分離毒株進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn),設(shè)定3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。結(jié)果顯示,202006-NX-4-2株試驗(yàn)組8/8發(fā)病,感染后第11～14天死亡2只;202006-SD-2-1株試驗(yàn)組8/10發(fā)病,感染后第18～19天死亡2只;202006-JX-016株試驗(yàn)組10/10發(fā)病,感染后第19～20天死亡2只。臨床癥狀觀察結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組雞群精神萎靡、羽毛蓬亂、雞爪和雞冠蒼白。試驗(yàn)第14和21天剖檢可見各試驗(yàn)組均有明顯病變,表現(xiàn)為胸腺、法氏囊和脾臟萎縮,骨髓黃化,脾臟顏色變淡(圖5A),血液稀薄(圖5B)。病理切片結(jié)果顯示,骨髓中造血細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)目明顯減少,胸腺和法氏囊中胸腺小葉/淋巴濾泡體積變小、明顯萎縮,淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯減少、逸失(圖5C)。

3 討論

CIAV的VP1蛋白是核衣殼蛋白,并且是唯一的結(jié)構(gòu)蛋白和主要的免疫原蛋白,可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的中和抗體。VP1基因的突變率最高,且有研究表明,基于CIAV全基因組和基于VP1基因構(gòu)建的進(jìn)化樹一致,而基于VP2和VP3基因構(gòu)建的進(jìn)化樹不能夠細(xì)致分群[14]。本試驗(yàn)對(duì)2020年發(fā)病雞場(chǎng)采集的樣品進(jìn)行CIAV的分離培養(yǎng)和特異性PCR檢測(cè),獲得3株CIAV分離株,對(duì)其進(jìn)行VP1基因測(cè)序和比對(duì),結(jié)果顯示,3株CIAV分離株相似性介于97.7%～99.6%;202006-NX-4-2株與GX1804株相似性最高,且除與JL15120株相似性為97.8%外,與其他Ⅱ分支參考株相似性均在99.0%以上;202006-SD-2-1株和202006-JX-016株均與JL15120株相似性最高。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,3株CIAV分離株均屬于遺傳進(jìn)化樹Ⅱ分支,與國(guó)內(nèi)大多數(shù)CIAV病毒株屬同一分支。其中Ⅰ分支的Cux-1株是德國(guó)2008年分離株,我國(guó)早期分離株大多與其親緣關(guān)系較近[15],而從本試驗(yàn)的毒株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可以看出,3株分離株均與Cux-1株親緣關(guān)系較遠(yuǎn),分別處于2個(gè)不同的進(jìn)化分支,說明目前我國(guó)流行毒株基因發(fā)生了變異。CIAV VP1蛋白的第394位氨基酸是病毒毒力強(qiáng)弱的主要決定因素,當(dāng)該位點(diǎn)為谷氨酰胺(Q)時(shí),病毒表現(xiàn)為高致病性,當(dāng)該位點(diǎn)為組氨酸(H)時(shí),病毒表現(xiàn)為低致病性[16]。本試驗(yàn)分離的3株毒株在VP1蛋白第394位均為Q,提示3株分離株均為高致病性病毒株,而3株分離株動(dòng)物回歸試驗(yàn)均引起嚴(yán)重的淋巴器官萎縮、骨髓黃化、血液稀薄等病理變化也證實(shí)了這一點(diǎn)。

CIAV可以通過水平和垂直傳播,大日齡雞只感染后不會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀,但該病毒可以垂直傳播給子代雞只,感染CIAV的子代雞只可引起繼發(fā)感染,影響其他疫苗的免疫效力。目前CIA主要通過免疫弱毒活疫苗進(jìn)行預(yù)防,較多養(yǎng)殖場(chǎng)使用的弱毒活疫苗為德國(guó)Cux-1株疫苗。本試驗(yàn)結(jié)果表明,該疫苗株與我國(guó)近期分離株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),對(duì)高致病性CIAV毒株引起CIA的保護(hù)作用較弱,不能滿足當(dāng)前CIA預(yù)防和控制的需要。

本試驗(yàn)結(jié)果提示,我國(guó)近幾年CIAV分離株已經(jīng)發(fā)生變異,現(xiàn)有弱毒活疫苗在未來可能不適用于我國(guó)CIA的免疫預(yù)防。且弱毒活疫苗存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn),當(dāng)務(wù)之急是研發(fā)更為安全有效的亞單位疫苗或核酸疫苗。本試驗(yàn)為篩選我國(guó)當(dāng)前流行病毒株和研發(fā)適合國(guó)內(nèi)的更為有效的疫苗提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。