王福玲,高 原,盛潔靜,王冬雪,王金宏,王 昊,韓曉宇,辛國松,3,楊 波,4

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150076 ; 2.浙江上藥九旭藥業(yè)有限公司,浙江 金華 321016 ;3. 教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心,黑龍江 哈爾濱 150076 ; 4. 黑龍江省預(yù)防與治療老年性疾病藥物研究重點(diǎn)實驗室,黑龍江 哈爾濱 150076)

畜牧業(yè)集中養(yǎng)殖家禽時,若環(huán)境不衛(wèi)生,容易引起真菌感染。在機(jī)體免疫能力下降或菌群失衡時,白色念珠菌感染可引發(fā)皮膚炎、陰道炎、甲溝炎、口瘡、肺炎和腸胃炎等常見炎癥。通過查閱文獻(xiàn)可知,苦豆子復(fù)方具有抑制白色念珠菌的作用[1]。為更好的發(fā)揮苦豆子復(fù)方治療和防御炎癥的效果,本試驗主要以醇提的方法提取苦豆子復(fù)方中抗白色念珠菌物質(zhì),以最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)值為評價指標(biāo),在單因素考察基礎(chǔ)上,采用正交設(shè)計篩選最佳提取工藝,得出苦豆子復(fù)方中抗白色念珠菌物質(zhì)的最佳提取工藝,從而為其在醫(yī)藥和日用化學(xué)等行業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌與藥材 苦豆子、蛇床子、黃柏,均購自哈爾濱市中藥材市場,經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室鑒定分別為豆科植物苦豆子SophoraalopecuroidesL.的種子、傘形科植物蛇床Cnidiummonnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果實、蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮。白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231,購自黑龍江省微生物研究所。

1.2 主要試劑 95%乙醇(批號為20170608),購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司;蛋白胨(批號為20190308)、酵母膏(批號為20180430),均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;葡萄糖(批號為20180711),購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;生理鹽水(批號為170525D1),購自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司。

1.3 主要儀器 電子分析天平(型號為BSA6202S-CW),賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋(型號為HH-2),江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;循環(huán)水式多用真空泵(型號為SHB-3),鄭州長城科工貿(mào)有限公司;高效萬能粉碎機(jī)(型號為B-56-2),天津泰斯特儀器有限公司;超聲波清洗機(jī)(型號為HS-20D),上海新芝生物技術(shù)研究所;精密恒溫培養(yǎng)箱(型號為BP-9082)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(型號為DHG-9070A),上海一恒科學(xué)儀器有限公司;紫外超凈工作臺(型號為AC2-4S1 HDL),北京東聯(lián)哈儀器制造有限公司。

1.4 培養(yǎng)基的配制 取10.00 g蛋白胨和5.00 g酵母膏于具塞錐形瓶中,加蒸餾水定容至400 mL,攪拌均勻后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(121 ℃,20 min);另取10.00 g葡萄糖,加蒸餾水定容至100 mL,攪拌均勻后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(115 ℃,15 min),最后將2種溶液混合,即為酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(Yeast peptone dextrose medium,又稱YPD液體培養(yǎng)基)。

1.5 菌懸液的配制 從生長白色念珠菌的固體培養(yǎng)基上挑選狀態(tài)較好的白色念珠菌單菌落,接種于YPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h后,取出菌液,稀釋至105CFU/mL,備用。

1.6 單因素試驗 (1)溫度(A)對提取的影響:以MIC為指標(biāo),按1∶1∶1的比例稱取苦豆子、黃柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10用75%乙醇分別在60、70、80、90 ℃和100 ℃條件下提取1 h。(2)料液比(B)對提取的影響:以MIC為指標(biāo),按1∶1∶1的比例稱取苦豆子、黃柏、蛇床子各1 g,分別以料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25用75%乙醇在80 ℃條件下提取1 h。(3)時間(C)對提取的影響:以MIC為指標(biāo),按1∶1∶1的比例稱取苦豆子、黃柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10用75%乙醇在80 ℃條件下分別提取0.5、1.0、1.5、2.0 h和2.5 h。(4)次數(shù)(D)對提取的影響:以MIC為指標(biāo),按1∶1∶1的比例稱取苦豆子、黃柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10用75%乙醇在80 ℃條件下分別提取1、2、3、4次和5次。(5)乙醇體積分?jǐn)?shù)(E)對提取的影響:以MIC為指標(biāo),按1∶1∶1的比例稱取苦豆子、黃柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10分別用55%、65%、75%、85%和95%乙醇在80 ℃條件下提取1 h。

1.7 正交試驗 綜合單因素試驗結(jié)果,選取5個單因素中具有代表性的3個水平來進(jìn)行正交試驗,按L18(37)正交表安排試驗,以MIC值為指標(biāo)。

1.8 最小抑菌濃度(MIC)的測定 干燥好的苦豆子復(fù)方提取物加生理鹽水配制成40 mg/mL的溶液,采用96孔板2倍稀釋法測定MIC值。取一96孔板,在第1、2列的B孔及以下的每個孔中加入生理鹽水100 μL,向A1～A2孔中加入已配制好(濃度40 mg/mL) 的苦豆子提取物溶液200 μL,混勻后從第1行A孔中吸取100 μL待測溶液加入第2行B孔中,以此類推,加至第7行G孔,從G孔中吸取100 μL溶液打入廢液缸。在第1列每個孔中加液體培養(yǎng)基100 μL,作為對照組,在第2列每個孔中加入菌液100 μL,作為試驗組。其他各列分別按上述操作加入各個藥液,將制備好的96孔板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h,觀察菌液生長情況,菌液透明澄清時所對應(yīng)的藥液濃度即為MIC。

1.9 驗證試驗 用正交試驗所得的最佳提取條件,重復(fù)3次,測定MIC值,驗證提取工藝。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 使用SPSS 16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗 結(jié)果如圖1所示,在溫度為60、70 ℃和80 ℃時MIC值較小,所以選取這3個提取溫度進(jìn)行正交試驗;當(dāng)料液比為1∶15、1∶20和1∶25時MIC值較小,所以選取這3個料液比進(jìn)行正交試驗;當(dāng)時間為1.5、2.0 h和2.5 h時MIC值較小,所以選取這3個提取時間進(jìn)行正交試驗;當(dāng)提取次數(shù)為1、2、3次時MIC值較小,所以選取這3個提取次數(shù)進(jìn)行正交試驗;在乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%～65%時MIC值較小,抑菌效果好,所以選取乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、60%和65%這3個水平進(jìn)行正交試驗。

圖1 各單因素對苦豆子復(fù)方醇提取MIC的影響Fig.1 Effects of single factors on the MIC of alcohol extraction of Kudouzi compound

各因素選取3個較低水平進(jìn)行五因素三水平的正交試驗,見表1。

2.2 正交試驗 結(jié)果如表2所示,苦豆子復(fù)方醇提取的最佳工藝條件為A1B2C2D1E3,即提取溫度為60 ℃,料液比為1∶20,提取時間為2.0 h,提取次數(shù)為1次,乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%,抑菌效果好。方差分析表明,5個因素對苦豆子復(fù)方抗白色念珠菌影響的主次順序為A>B>D>C>E。

表2 L18(37)正交試驗分析結(jié)果Table 2 Result of L18(37) orthogonal design analysis

從表3可知,提取溫度(A)和料液比(B)顯著影響苦豆子復(fù)方醇提物抑菌效果(P<0.05),其他因素對醇提物的MIC值無顯著影響(P>0.05)。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Result of the variance analysis

2.3 驗證試驗 用正交試驗所得的最佳提取條件,重復(fù)3次,提取的苦豆子復(fù)方抗白色念珠菌物質(zhì)的MIC值均為1.25 mg/mL,由此可知,本試驗所得苦豆子復(fù)方抗白色念珠菌物質(zhì)的最佳提取工藝數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

3 討論

白色念珠菌是較為常見的真菌感染致病菌,臨床上的抗真菌藥品多為西藥,大量應(yīng)用會導(dǎo)致真菌耐藥性的增多,使得真菌感染的治療越發(fā)困難。中藥具有有效、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[2]。已有研究表明,復(fù)方苦豆子栓劑、復(fù)方苦參洗劑、蛇床子苦參散等中藥復(fù)方制劑在臨床上具有良好的抑菌療效[3-5]。本試驗以現(xiàn)有的中藥復(fù)方制劑為基礎(chǔ),通過各中藥協(xié)同增效,優(yōu)化制備工藝,得到治療白色念珠菌效果較好的苦豆子復(fù)方物質(zhì),使其更好的用于治療。

苦豆子和黃柏大苦大寒,具有清熱燥濕、解毒療瘡、殺蟲止癢止痛之功[6-7];蛇床子寒中有溫、溫而制寒,具有以溫陽利濕之功[8]。中藥有效成分如生物堿具有很強(qiáng)的抗菌效應(yīng)[9-10]。復(fù)方不但能增強(qiáng)各單味藥特有的功效還能改善其他病癥,符合協(xié)同給藥規(guī)律。

不同的提取方法對有效成分影響很大,本試驗對苦豆子復(fù)方抗白色念珠菌的提取工藝進(jìn)行正交試驗優(yōu)化,得出最佳提取工藝為20倍的65%乙醇,在溫度為60 ℃的條件下,提取2.0 h,提取1次,此時得到的提取物具有較好的抗白色念珠菌活性。本試驗為深入研究苦豆子抗菌機(jī)理提供了數(shù)據(jù)支持。另外,苦豆子、蛇床子和黃柏來源廣泛、經(jīng)濟(jì)價廉、安全性高、副作用小,具有很大的開發(fā)價值,但其有效成分和抗菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。