張菊??+張怡??+曹鵬??+安一博??+黃輝??+袁俊慧??+王瑞瑞??李成偉

摘要：為了研究周口地區(qū)出現(xiàn)的艾草白粉病菌的種類和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為其防治及系統(tǒng)進(jìn)化提供理論依據(jù)，采用顯微形態(tài)學(xué)觀察、致病性檢測、分子生物學(xué)檢測的方法對其進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析。結(jié)果表明，艾草白粉病菌分生孢子長度平均約為34.57 μm，寬度平均約為18.36 μm，以約3～8個分生孢子串生在分生孢子梗上，附著胞少裂片對生。根據(jù)病原菌的rDNA-ITS序列（GenBank登錄號為KF056818）建立進(jìn)化樹分析可知其與來自韓國、日本的Golovinomyces artemisiae聚在1支上，登錄號分別為KJ136112、AB077654，而與同屬的另外1個種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。分析認(rèn)為，河南周口地區(qū)的艾草白粉病菌為G. artemisiae。

關(guān)鍵詞：艾草白粉病菌；分子鑒定；進(jìn)化樹

中圖分類號： S435.672文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0178-03

艾草（Atemisia argyi）別稱艾蒿，屬菊科（Asteraceae）蒿屬（Artemisia）植物，全草入藥，具有溫經(jīng)、去濕、平喘、利膽、止血、消炎、抗過敏等作用，故藥物學(xué)家李時珍對艾草推崇有加，并記錄在《本草綱目》中。目前，白粉病是艾草的主要病害，葉片、葉柄及莖危害較重，病部生有或薄或厚的白色無定形斑片，嚴(yán)重時可致整個植株死亡。雖然化學(xué)農(nóng)藥對白粉病的防治有一定的作用，但長期使用農(nóng)藥可能會造成農(nóng)藥殘留并影響艾草本身的藥性，因此難以保證艾草的藥用品質(zhì)。已有學(xué)者對艾草白粉病[1-3]進(jìn)行過研究，在青島、甘肅、塔里木盆地等的艾草植株上出現(xiàn)蒿白粉病菌，但僅限于對其形態(tài)學(xué)的研究，至今未發(fā)現(xiàn)運用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對艾草白粉病菌進(jìn)行研究的報道。因此，針對在河南周口發(fā)現(xiàn)的艾草白粉病菌，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、致病性、分子生物學(xué)的研究，以期為艾草白粉病菌系統(tǒng)進(jìn)化及防治奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

感染白粉病菌的艾草植株取自周口師范學(xué)院校園內(nèi)。

1.2白粉病菌的形態(tài)觀察

[CM（24]首先采取感病葉片，通過二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diamino[CM）]〖LM〗benzidine tetrahydrochloride，DAB）和臺盼藍(lán)染色后在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察[4]。同時剪取1 cm×1 cm大小的感病葉片，經(jīng)真空鍍金后，在Quanta 200型掃描電子顯微鏡的高真空環(huán)境下進(jìn)行觀察。參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)設(shè)駐留時間為6 μs，燈絲電壓為25.00 kV。

1.3白粉病菌總DNA的提取、ITS序列的克隆及測序

1.3.1病原菌總DNA的提取總DNA的提取方法參考生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒。

1.3.2ITS序列的克隆及測序ITS序列采用真菌核糖體區(qū)段通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行擴增。白粉病菌ITS PCR擴增體系為20 μL：總DNA模板1 μL，ITS1 2 μL，ITS4 2 μL，ddH2O 5 μL，Taq Mix 10 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，38個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將所得到的目的條帶經(jīng)膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]純化，連接到pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)質(zhì)粒PCR檢測陽性菌株后，將其送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序分析。

1.4ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中搜素與艾草白粉病菌ITS序列高度同源的序列，下載不同地區(qū)的G. artemisiae ITS序列，采用Clustal X（1.83版）進(jìn)行序列的完全比對，利用MEGA5.0軟件中的鄰近法（Neighbor-Joining，N-J）生成艾草白粉病菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹，用自展法對系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行檢驗，自展數(shù)為1 000次。

2結(jié)果與分析

2.1白粉病菌的形態(tài)觀察

[JP3]艾草白粉病菌主要侵染葉片正面，也可侵染葉片背面，發(fā)病初期葉片表面出現(xiàn)白色無定形斑片，隨后逐漸擴大并連成片狀白粉斑，即為病原菌分生孢子、分生孢子梗和菌絲體。病菌嚴(yán)重時，白粉斑布滿整個葉片，更為嚴(yán)重時可導(dǎo)致整個植株死亡。

將感病葉片經(jīng)真空鍍金后在掃描電鏡下進(jìn)行觀察，同時采用DAB和臺盼藍(lán)對其染色，在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，艾草白粉病菌的分生孢子成串且呈橢圓形或柱形，單個分生孢子長度平均約為34.57 μm，寬度平均約為18.36 μm，以約為3～8個分生孢子串生在分生孢子梗上，附著胞少裂片對生（圖1）。

2.2病原菌的致病性鑒定

根據(jù)科赫氏法則，對病原菌進(jìn)行致病性檢測，收集感病植株上的白粉病菌接種至健康的艾草植株上，15 d后葉片出現(xiàn)白色的粉狀物，且與自然狀態(tài)發(fā)病葉片上的癥狀類似（圖2-A）。取發(fā)病艾草葉片染色后在顯微鏡下觀察，其特征與自然發(fā)病葉片的顯微形態(tài)觀察特征相同（圖2-B），因此初步鑒定此病原菌為G. artemisiae。

2.3ITS序列的擴增及分析

本試驗通過真菌核糖體ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4，以艾草白粉病菌總DNA為模板，PCR擴增艾草白粉病菌核糖體的ITS區(qū)，經(jīng)38個循環(huán)后得到553 bp的目的片段（圖3）。將ITS序列上傳至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中，得到艾草白粉病

菌ITS序列的登錄號為KF056818。在NCBI中進(jìn)行BLAST，與其他同源序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，周口地區(qū)艾草白粉病病原菌ITS區(qū)段核苷酸編碼序列中，1～178位為ITS1區(qū)段序列，179～331位為5.8S rDNA全序列，332～493位為ITS2區(qū)段序列，494～553位為28S rDNA序列。

2.4系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中，對艾草白粉病菌G. artemisiae進(jìn)行BLASTn同源序列搜索，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)目的序列KF056818與來自韓國的青蒿（登錄號KJ136112）、日本的杭白菊（登錄號AB077654）的白粉病菌親緣關(guān)系最近，聚在1個進(jìn)化支上；同時與來自美國艾草和日本魁蒿、山地蒿、濱菊上的白粉病菌（登錄號分別為AB077659、AB077649、AB769433）均達(dá)到99%同源，而與來自阿根廷茜草科蓬子菜上的G. riedlianus（登錄號AB769420）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，同源性僅為93%（圖4）。

3討論

據(jù)報道，艾草葉片中含有天然藥物活性成分，加工的艾葉具有血管舒張[5]、抑制血小板聚集[6]、抗誘變、抗真菌活性、抗灰霉病等作用[7]。另外，蒿類植物中的黃酮提取物已被證實有抗炎、抗氧化、抗菌等多種功效[8]。在藥用植物的生產(chǎn)過程中，病蟲害問題已日漸突出，因此掌握藥用植物病害的種類及危害情況對于開展防治及深入研究具有極其重要的意義。

在真菌的鑒定過程中，通常采用形態(tài)學(xué)方法，通過觀察真菌的形態(tài)大小、形狀來進(jìn)行分類，但此法往往受人為、環(huán)境因素影響導(dǎo)致不能準(zhǔn)確判斷物種之間的進(jìn)化關(guān)系[9]。真菌 rDNA-ITS 序列在進(jìn)化過程中保守性較強，有助于各種族之間親緣關(guān)系的確定。但更多學(xué)者認(rèn)為，rDNA-ITS序列分析雖有優(yōu)點，但并不能單獨以這種方法鑒定出所有真菌種類，宜采用與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合的方法鑒定真菌種類[10]。

本研究利用rDNA-ITS序列在真菌鑒定上的應(yīng)用，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可得，周口地區(qū)的艾草白粉病菌與韓國青蒿（KJ136112）、日本杭白菊（AB077654）的白粉病菌同源性均達(dá)到99%，但艾草白粉病菌卻未能與其寄主為同一屬的青蒿聚在同一支，來自日本寄主為魁蒿（AB077659）、山地蒿（AB077649）和立陶宛的中亞苦蒿（AB769430）均為蒿屬的不同小種，卻未能聚在1支，不同屬的青蒿、杭白菊卻聚在同一支，因此推測白粉病菌進(jìn)化與自身小種進(jìn)化有關(guān)。然而劉先寶等學(xué)者對海南的野艾蒿白粉病菌進(jìn)行rDNA-ITS序列鑒定認(rèn)為，其與菊科黃瓜菜的叉絲單囊殼白粉菌高度同源[11]，這與本研究結(jié)果有一定的差異。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，白粉病菌雖具有?；訹12-14]，但不一定只侵染某一種特定的植物，如番茄白粉病菌可侵染除茄科以外的葫蘆科的部分植物[15-16]，同時地域差異也可能造成白粉病菌的變異。

本研究運用顯微形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，對河南周口地區(qū)艾草白粉病菌進(jìn)行分析鑒定，對河南省艾草白粉病病菌的分類及防治艾草白粉病具有重要的意義。

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