薛 麒,侯力丹,黃小潔,秦義嫻,毛婭卿,孔冬妮,王 嘉,吳華偉,劉 丹

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)

雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis)是一種由雞傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus)引起的急性高度接觸性呼吸道疾病。該病常發(fā)生于雞或火雞,4周齡內(nèi)的雛雞最易發(fā)病,死亡率可高達(dá)90%,給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。我國IBV的主要流行毒株有呼吸型和腎型,由于IBV基因易發(fā)突變等因素給該病的防控帶來較大壓力[4-6]。IBV血清型眾多且不同血清型缺乏交叉保護(hù),其中N 蛋白在病毒復(fù)制中起到重要作用,其編碼的基因序列是IBV進(jìn)化最為保守的基因[7]。IB常規(guī)的檢測(cè)方法有病毒分離鑒定、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等,也是《中國獸藥典》規(guī)定必須檢測(cè)的外源病毒之一,通過雞胚接種,以雞胚死亡或感染發(fā)病作為判定依據(jù)作初步鑒定,也可用雞檢查法檢測(cè)IBV的抗體[8]。單克隆抗體技術(shù)已廣泛應(yīng)用于禽源病毒的抗原變異分析和檢測(cè)方法建立[9-10],本研究旨在采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化IBV N蛋白,并結(jié)合雜交瘤技術(shù)制備IBV特異性單克隆抗體,為雞傳染性支氣管炎病毒的檢測(cè)方法研究和生物學(xué)特性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 pET30a-N重組質(zhì)粒,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所構(gòu)建及鑒定;IBV H120株、M41株等由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備和保存;8周齡BALB/c雌性小鼠,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 表達(dá)菌株BL21購自北京全式金公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自上海百賽生物技術(shù)有限公司;Protein Marker、兔抗鼠IgG-HRP、一抗稀釋液、膜封閉液、HRP抗體稀釋液、增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒、TBST均購自索萊寶生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;HAT為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 N蛋白的原核表達(dá)及純化 將重組質(zhì)粒pET30a-N轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆,接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。將上述菌液以1∶100的比例再轉(zhuǎn)接含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600 nm為0.6～0.8,加入IPTG誘導(dǎo)置37 ℃搖床200 r/min培養(yǎng)6 h。取誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.4 重組N蛋白的可溶性分析及純化 將活化的菌液加到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600 nm為0.6～0.8,IPTG(0.5 mM)16 ℃誘導(dǎo)過夜。將誘導(dǎo)菌液、未誘導(dǎo)菌液、裂解菌液上清及沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。采用GST柱對(duì)重組N蛋白進(jìn)行純化。

1.5 單克隆抗體的制備 按照常規(guī)方法進(jìn)行小鼠免疫、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞篩選。將純化后的N蛋白作為免疫原,于背部皮下多點(diǎn)注射免疫小鼠,每次免疫接種間隔2周,第3次免疫1周后采血,分離血清檢測(cè)ELISA抗體效價(jià),第3次免疫后2周腹腔注射免疫原加強(qiáng)免疫1次。3 d后融合,于融合后第10 d取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行陽性克隆篩選,分別以N蛋白和His蛋白作為包被抗原,通過間接ELISA方法進(jìn)行篩選,共進(jìn)行3次亞克隆。

1.6 單克隆抗體的鑒定

1.6.1 單克隆抗體的亞類鑒定 取經(jīng)亞克隆定株后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清,根據(jù)小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書進(jìn)行,測(cè)定單克隆抗體的亞類。

1.6.2 Western-blot檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞 將滅活后的IBV H120株和M41株經(jīng)處理后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上;用適當(dāng)稀釋的雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗于室溫孵育1 h,用1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗于室溫孵育1 h并用增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1.6.3 IFA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞 將IBV H120株、M41株以及IBDV、ILT、EDSV和ND等常見的禽類病毒以200EID50/0.1 mL接種CEK細(xì)胞培養(yǎng)5 d,經(jīng)甲醇固定后,以雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗于37 ℃孵育1 h,用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗于37 ℃孵育1 h,置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,以評(píng)價(jià)單抗與IBV的反應(yīng)性和單克隆抗體的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET30a-N的誘導(dǎo)表達(dá) 取1 mL誘導(dǎo)表達(dá)的pET30a-N轉(zhuǎn)化至BL21的菌液進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果在45 kD處可見表達(dá)條帶,符合預(yù)期大小(圖1)。

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:未誘導(dǎo)對(duì)照(pET30a-N轉(zhuǎn)化至BL21);2-3:IPTG誘導(dǎo)(pET30a-N轉(zhuǎn)化至BL21)M:Protein molecular weight Marker;1:No induced control(BL21);2-3:IPTG induced(BL21)圖1 pET30a-N誘導(dǎo)表達(dá)Fig 1 The induced expression of pET30a-N

2.2 重組蛋白的可溶性分析 超聲裂解誘導(dǎo)后的菌液,將菌液上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果顯示,pET30a-N蛋白主要出現(xiàn)在沉淀中,表明該蛋白以包涵體形式表達(dá)(圖2)。

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:超聲后全菌;2:超聲后沉淀;3:超聲后上清M:Protein molecular weight Marker;1:Total bacteria after ultrasound;2:Precipitation after ultrasound;3:Ultrasound supernatant圖2 pET30a-N重組蛋白可溶性分析Fig 2 Soluble analysis of pET30a-N recombinant protein

2.3 雜交瘤細(xì)胞篩選 將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清用間接ELISA 方法在N蛋白和His蛋白包被板上進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè),將3次篩選均顯示陽性的細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)定株。共篩選出3株ELISA陽性雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1#、18#、19#(表1)。

表1 雜交瘤細(xì)胞株的ELISA分析Tab 1 ELISA analysis of hybridoma cell lines

2.4 單克隆抗體的鑒定

2.4.1 亞類的鑒定 用ELISA方法對(duì)三株雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示1#、18#、19#重鏈類型均為IgG1,輕鏈類型均為Kappa(表2)。

表2 ELISA法測(cè)定單克隆抗體類及亞類Tab 2 Detection of subclasses of McAbs by ELISA

2.4.2 Western-blot檢測(cè)單克隆抗體 將滅活后的IBV H120株進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,并轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用3株單抗作為一抗,進(jìn)行Western-blot鑒定,結(jié)果顯示3株單抗均與H120株產(chǎn)生特異性反應(yīng),在約52 kD大小處(N蛋白分子量)能特異性結(jié)合(圖3)。

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1:1#單克隆抗體;2:18#單克隆抗體;3:19#單克隆抗體M:Protein molecular weight Marker;1:1# monoclonal antibody;2:18# monoclonal antibody;3:19# monoclonal antibody圖3 Western-blot鑒定單克隆抗體Fig 3 Western-blot analysis of the monoclonal antibody

2.4.3 IFA方法檢測(cè)單克隆抗體 為獲得具有廣譜反應(yīng)性的群特異性單克隆抗體,選取18#單克隆抗體,進(jìn)行IFA方法檢測(cè)。結(jié)果顯示單克隆抗體僅與IBV H120株、M41株發(fā)生特異性反應(yīng),出現(xiàn)特異性綠色熒光,而與IBDV、ILT、EDSV和ND等常見的禽類病毒均不發(fā)生反應(yīng)(圖4)。說明單克隆抗體的特異性良好。

3 討 論

雞傳染性支氣管炎是危害我國禽類的重大傳染病之一,其病毒傳染性強(qiáng)、變異性高、血清型和基因型復(fù)雜,感染雞不僅會(huì)出現(xiàn)各種呼吸系統(tǒng)的癥狀,也會(huì)影響雞產(chǎn)蛋地?cái)?shù)量和質(zhì)量,對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的損失[11-13]。因此,建立有效的診斷和檢測(cè)方法對(duì)于更快的發(fā)現(xiàn)該病有著非常重要的意義。IBV有4種結(jié)構(gòu)蛋白,其中N蛋白是4種結(jié)構(gòu)蛋白中唯一位于病毒內(nèi)部的結(jié)構(gòu)蛋白,具有高度的保守性,且N蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[14-15]。此外不同IBV毒株之間N蛋白具有高度的同源性。周景明等針對(duì)IBV的N蛋白利用細(xì)胞融合法制備篩選出了8株能與所有基因型IBV結(jié)合的單克隆抗體,并對(duì)其中1株純化與鑒定,具有良好的特異性和較高的親和力[16]。杜旭彬等同樣針對(duì)IBV的N蛋白制備并篩選出8株能與所有基因型IBV結(jié)合的單克隆抗體,單抗具有良好的廣譜性[17]。但周景明等與杜旭彬等僅用ELISA方法和Western-blot方法鑒定單克隆抗體,均沒有使用IFA方法鑒定單抗。IFA方法由于IBV不易適應(yīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)存在較大的難度。其病毒在傳代細(xì)胞系上需要連續(xù)數(shù)次傳代才能使其適應(yīng)細(xì)胞生長,但大多數(shù)毒株可以在雞胚原代細(xì)胞(如CEF細(xì)胞、CEK細(xì)胞)上生長,然而僅在CEK細(xì)胞上會(huì)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變[18-19]。單克隆抗體技術(shù)廣泛地應(yīng)用于病毒的基因、蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究,在病毒的快速診斷和檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用,開展IBV單克隆抗體研制十分必要。

N蛋白在宿主體內(nèi)產(chǎn)生高水平的抗體,其抗體產(chǎn)生時(shí)間和免疫原性均優(yōu)于其他蛋白,因此,本研究對(duì)IBV H120株編碼N蛋白的基因序列進(jìn)行綜合性二級(jí)分析及抗原性分析,選擇親水性好且抗原性較好的41-391aa區(qū)域進(jìn)行后期抗原制備。利用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(BL21)表達(dá)并純化IBV NP蛋白,多次免疫小鼠后進(jìn)行細(xì)胞融合,采用ELISA方法和Western blot方法篩選出3株雜交瘤細(xì)胞株。可靠的篩選方法在制備單抗的過程中起到關(guān)鍵作用,ELISA方法篩選時(shí)選用表達(dá)NP蛋白和標(biāo)簽蛋白His作為包被抗原,進(jìn)行3輪雙篩選,此方法簡化了篩選過程并排除標(biāo)簽蛋白在篩選過程中的干擾。3株單克隆抗體經(jīng)Western-blot鑒定,能與常見基因型的IBV特異性結(jié)合。同時(shí)采用IFA方法檢測(cè)單抗的特異性,篩選出的3株單抗均與能H120毒株、H52毒株產(chǎn)生IFA反應(yīng),但1#和19#不與M41、疫苗株等產(chǎn)生IFA反應(yīng)。18#單抗能與H120毒株、H52毒株M41、疫苗株等產(chǎn)生IFA反應(yīng),說明其具有廣譜的反應(yīng)性。因此,后續(xù)可以選擇群特異性單克隆抗體18#,以期為IBV IFA快速檢測(cè)方法的建立打下基礎(chǔ)。該單克隆抗體僅與IBV發(fā)生特異性反應(yīng)而與NDV、IBD、AIV等禽類常見病毒均無交叉反應(yīng)。本研究成功制備了IBV單克隆抗體,為下一步開展IBV診斷試劑如IFA檢測(cè)試劑盒、ELISA檢測(cè)試劑盒等的研制和進(jìn)行IBV生物學(xué)特性研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。