洪 璐,劉書余,郭亞文,高鵬飛,朱雅麗,謝愷舟*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009; 2.揚(yáng)州大學(xué),教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225009)

近幾年我國肉制品的需求增長很快,隨著人均收入的提高及肉產(chǎn)品成本的下降,人們對于日常所需肉制品的數(shù)量及質(zhì)量增高明顯,其中,禽類產(chǎn)品是優(yōu)質(zhì)蛋白的重要來源之一[1],其含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素及礦物元素,容易被人體吸收利用,雞蛋中更是富含卵磷脂,有營養(yǎng)大腦神經(jīng)以及減輕肝損害等的作用,是人們?nèi)粘ｏ嬍持胁豢扇鄙俚囊徊糠帧Ｍ瑫r,伴隨而來的食品安全問題也就越加嚴(yán)峻。在養(yǎng)殖業(yè)中,獸藥是畜禽疾病防治過程中最基礎(chǔ)且最關(guān)鍵的一道環(huán)節(jié),它可以保證動物健康生長和生命安全,同時決定著一個企業(yè)的興衰以及消費(fèi)者的健康。合理、科學(xué)地使用獸藥是每一個養(yǎng)殖企業(yè)經(jīng)營的基本原則。但隨著人們對禽類產(chǎn)品的需求日漸增長,部分養(yǎng)殖企業(yè),尤其是小型養(yǎng)殖戶為了謀取利益,不遵守休藥期、不按規(guī)定用藥以及在飼料中過度添加某些藥物而導(dǎo)致禽類產(chǎn)品中獸藥殘留超標(biāo)問題日益加重[2]。為了監(jiān)測和控制禽蛋和禽肉中有害物質(zhì)的殘留,發(fā)展了不同的樣品前處理技術(shù)及獸藥殘留檢測技術(shù),為大眾和環(huán)境的安全作保障。綜上所述,本文綜述了禽蛋和禽肉中獸藥殘留常用的前處理方法和測定方法,并對獸藥殘留檢測技術(shù)未來的發(fā)展進(jìn)行了展望。

1 我國禽蛋和禽肉的獸藥殘留現(xiàn)狀

獸藥殘留種類主要包括抗生素類、磺胺類、呋喃類、抗寄生蟲類、激素和β-興奮劑等藥物的殘留[3]。其中,以促進(jìn)禽類生長的激素、抗生素、磺胺類等藥物的殘留最為常見[4]。獸藥殘留的超標(biāo),可能引發(fā)慢性中毒和腸道菌群失調(diào),甚至?xí)a(chǎn)生“三致”(致畸形、致癌變、致突變)作用[5]。

禽蛋、禽肉中獸藥殘留主要來自家禽促生長時期和疾病防控時期,在這兩個期間,很多養(yǎng)殖戶因未按規(guī)定用藥,未嚴(yán)格執(zhí)行休藥期等原因,導(dǎo)致動物源性食品中的獸藥殘留問題愈演愈烈,從而使藥物原型及其代謝物蓄積在家禽體內(nèi),并轉(zhuǎn)移到禽肉及禽蛋產(chǎn)品中[6]。

2022年,在我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織開展了的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測工作中,抽檢了31個省份的屠宰場和養(yǎng)殖場共833個、農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場1191個。抽檢結(jié)果顯示,畜禽產(chǎn)品的合格率為99.1%。其中,禽肉和禽蛋類的抽檢合格率分別為98.7%和98.1%,合格率較其他的農(nóng)產(chǎn)品低。

禽蛋、禽肉中的獸藥殘留種類繁多,問題不斷加劇的原因還包括養(yǎng)殖規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大、獸藥成分問題、檢測水平不夠及市場監(jiān)管不到位等幾個方面[7]。本文結(jié)合GB 31650-2019、GB 31650-2022對禽蛋、禽肉中殘留獸藥及藥物的最大殘留限量進(jìn)行了總結(jié),如表1。

表1 GB 31650-2019、GB 31650-2022 中規(guī)定的禽蛋和禽肉中獸藥殘留的最大殘留限量Tab 1 MRLs of veterinary drug residues in poultry eggs and poultry meat in GB 31650-2019 GB、31650-2022

2 樣品前處理方法

禽類產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量較高,尤以雞蛋中蛋白質(zhì)含量最為豐富,在檢測過程中會對目標(biāo)物的萃取凈化造成干擾,因此,選擇適宜的樣品前處理方法對殘留藥物的定性和定量至關(guān)重要[8]。前處理的步驟主要包括萃取、純化、分離、濃縮和復(fù)溶等。萃取和純化是最為關(guān)鍵的兩步。

目前,在禽類產(chǎn)品中運(yùn)用較多的有液-液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、加速溶劑萃取(ASE)、QuEChERS[9]和基質(zhì)固相分散萃取(MSPDE)等。

2.1 液-液萃取 液-液萃取,也稱兩相溶液提取,因樣品中各成分在兩種互不相容的溶液中存在著分配系數(shù)差異而能達(dá)成分離效果的萃取方法。萃取基本過程是將萃取液加入到樣品溶液中充分混合后,因濃度高低促使這些成分從樣品溶液中向萃取液中擴(kuò)散,從而達(dá)到分離效果。曲良嬌等[10]用5%三氯醋酸來萃取雞肉中的五氯酚,經(jīng)過五氯酚鈉(SLC)專用柱進(jìn)化后,再用氣相色譜-質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行樣品分析。五氯酚在5.05～202 μg/L濃度內(nèi)線性良好,r=1.000,檢出限為0.06 μg/kg。Wang 等[11]利用乙酸乙酯提取雞蛋中喹諾酮類和磺胺類藥物,經(jīng)過兩次濃縮過濾后,再用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對樣品進(jìn)行檢測分析,結(jié)果顯示,線性相關(guān)系數(shù)均在 0.9990以上,檢出限為 2～10 μg/kg-1。該法具有分離效果好、回收率高和適用性高等優(yōu)點(diǎn),但繁瑣費(fèi)時,萃取溶劑易揮發(fā),因此常與其他前處理方法配合應(yīng)用。

2.2 固相萃取 固相萃取是一種液相色譜分離技術(shù),是采用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)物與干擾物分離,從而達(dá)到目標(biāo)物的分離和集合。此方法已被許多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。傅紅雪等[12]運(yùn)用1∶1的乙腈-1%三氯乙酸溶液混合液為提取劑, 經(jīng)Hilic Plus親水色譜柱凈化后, 運(yùn)用全自動固相萃取結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了雞肉中7種抗病毒藥物殘留。秦宇等[13]建立了用1% 甲酸乙腈為萃取劑,經(jīng)新型固相萃取柱凈化后結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了雞蛋中克倫特羅、恩諾沙星和金剛烷胺等 12 種禁用獸藥的殘留量,為雞蛋中多種獸藥殘留分析檢測提供了規(guī)范的依據(jù)。該法具備簡單、快速和通量高等優(yōu)點(diǎn),但固相萃取柱成本高且對環(huán)境有一定的污染。

2.3 加速溶劑萃取 加速溶劑萃取是一種只需利用少量基質(zhì),在一定的高溫和壓力下自動萃取基質(zhì)中有機(jī)物的技術(shù)[14]。張健威等[15]建立了一種以甲醇和0.1 mol/L Mcllvaine緩沖液為萃取溶劑,利用加速溶劑萃取-固相萃取-超高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜法測定沉淀物中10種磺胺類抗生素的分析方法,結(jié)果表明,該方法檢出限為0.034～0.396 ng/g;平均回收率67.8%～109.8%之間,可應(yīng)用于沉淀物中磺胺類抗生素的殘留檢測。該法具有操作簡單、省時、回收率顯著和對基質(zhì)破壞度小等優(yōu)點(diǎn)[16],但設(shè)備價格昂貴,成本較高[17]。

2.4 QuEChERS QuEChERS是由美國農(nóng)業(yè)部開發(fā)的一種樣品前處理方法,廣泛應(yīng)用于農(nóng)畜產(chǎn)品的檢測,具有快速、高效和安全等特點(diǎn)[18],但過程中易受基質(zhì)干擾。QuEChERS法凈化的基本過程是向水溶液中的固體樣品加鹽后經(jīng)過乙腈萃取,接著經(jīng)過液固萃取(也稱分散機(jī)制萃取)去除乙腈中存在的大部分干擾物,將萃取后的樣品直接進(jìn)行質(zhì)譜分析。呂警[19]以QuEChERS法萃取和凈化雞肉樣品,并結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)對樣品進(jìn)行檢測分析,建立了一種可以快速測定雞肉中8種喹諾酮類藥物殘留量的方法。該法簡單、高敏、凈化效果明顯、所得平均回收率為89.7%～97.7%。圖雅等[20]用QuEChERS前處理法,結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜法,建立了一種能夠快速篩查禽蛋(雞蛋、鴨蛋和鵝蛋等)中2種四環(huán)素類藥物殘留的方法,該方法靈敏度及準(zhǔn)確度良好,所得平均回收率為80.5%～104.2%。

2.5 基質(zhì)固相分散萃取 基質(zhì)固相分散萃取(MSPDE)是一種將萃取物與待測樣品置于同一容器內(nèi)研磨為半干狀態(tài)的混合物后作為材料裝柱,然后用不同的溶劑洗脫待測的殘留物[21]。該法是美國的Barker教授提出并進(jìn)行了理論解釋的一種樣品前處理技術(shù)[22]。Zhang等[23]以分子印跡基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)并結(jié)合高效液相色譜(HPLC)法對樣品進(jìn)行檢測分析,建立了一種可以系統(tǒng)監(jiān)測雞肉中奧拉喹多克的便捷有效的分析技術(shù),該法具有很好的識別性和選擇性,奧拉喹多司在1.0和2.0 μg/g-1水平的回收率范圍在85.3%～93.2%之間。該法具有操作簡單,高效和試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn),在處理過程中可有效的減少樣品損失,但成本高、局限性高。表2總結(jié)了以上五種前處理方法的優(yōu)缺點(diǎn)對比。

表2 不同樣品前處理方法優(yōu)缺點(diǎn)對比Tab 2 Comparison of advantages and disadvantages of different sample pretreatment methods methods

2.6 其他樣品前處理方法 現(xiàn)今,隨著獸藥殘留檢測技術(shù)的不斷發(fā)展,已廣泛應(yīng)用的樣品前處理方法還包括震蕩萃取(OE)、超聲萃取(UE)、旋渦混合萃取和沉淀法等[24]。這些方法都有精確度高,耗時短及成本低的優(yōu)點(diǎn)。

3 常用檢測方法

目前,禽蛋、禽肉中獸藥殘留常用的傳統(tǒng)檢測方法有(超)高效液相色譜法[(U)HPLC]、(超)高效液相色譜-質(zhì)譜法[(U)HPLC-MS]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)等[25]。

3.1 (超)高效液相色譜法 (超)高效液相色譜對于分子量高、氣化難度大、熱波動不穩(wěn)定及高沸點(diǎn)獸藥的測定效果好。該法具備靈敏度高、分離效果好和對溫度變化不敏感等優(yōu)點(diǎn)。高效液相色譜-檢測器主要有紫外線檢測器(UV)、熒光檢測器(FD)、化學(xué)發(fā)光檢測器(CD)和蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)等,可根據(jù)檢測目標(biāo)選擇合適的檢測器。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)雞可食性組織中地克珠利殘留量的測定高效液相色譜法》(農(nóng)業(yè)部1927號公告-21-2013)[26]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)雞可食性組織中尼卡巴嗪殘留量的測定高效液相色譜法》(農(nóng)業(yè)部1927號公告-11-2013)[27]中規(guī)定對雞蛋中氟喹諾酮類藥物、磺胺喹噁啉和泰樂菌素的殘留測定運(yùn)用高效液相色譜法。劉暢等[28]以三氯乙酸-乙腈為提取劑,運(yùn)用固相萃取結(jié)合高效液相色譜測定了禽類可食性組織和蛋中氨丙啉殘留,該方法精準(zhǔn)度高,可用于禽肉及禽蛋中氨丙啉殘留的檢測。

3.2 (超)高效液相色譜-質(zhì)譜法 近年來,(超)高效液相色譜-質(zhì)譜法的發(fā)展很快,具有靈敏度高、分析速度快、樣品用量少和專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[29],因此,應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛,隨著該技術(shù)的發(fā)展,我國相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中對獸藥殘留的檢測大多運(yùn)用液質(zhì)聯(lián)用。隨著動物源性食品中的獸藥殘留越發(fā)復(fù)雜,出現(xiàn)多種或未被發(fā)現(xiàn)的化學(xué)物質(zhì)殘留,我國需要發(fā)展更加全面的檢測技術(shù)和儀器,提升識別手段。陳濤等[30]建立了一種基于超高效液相色譜-質(zhì)譜法同時測定雞蛋、雞肉、豬肉中酰胺醇類藥物殘留量的方法。晏亮等[31]運(yùn)用5%甲酸乙腈溶液為提取劑,運(yùn)用QuEChERS法結(jié)合超高效液相色譜四極桿飛行時間質(zhì)譜法,建立了同時測定蛋及蛋制品中 5 大類 49 種藥物殘留的方法。該方法快速又簡便,大大提高了工作效率。奚照壽等[32]以乙酸乙酯-乙腈-氨水為提取劑結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,建立了鵪鶉蛋和鴿蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺多殘留的同時檢測方法。

3.3 氣相色譜-質(zhì)譜法 氣相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合了氣相色譜和質(zhì)譜的不同特性以鑒別樣品中不同物質(zhì),其原理是將待測樣本分子電離成不同質(zhì)量電荷比的帶電離子進(jìn)行分離[33]。目前,該法主要用于檢測食品中易揮發(fā)的小分子痕量化合物,其在獸藥殘留方面的應(yīng)用沒有上述兩種方法廣泛。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 雞肌肉組織中氯羥吡啶殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜法》(GB 29699-2013)[34]規(guī)定了雞肌肉組織中氯羥吡啶殘留量的檢測標(biāo)準(zhǔn)。邢銀英等[35]以三重四極桿氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS法,建立了禽源類肉及其肉制品中氟蟲腈及3種代謝藥物殘留的分析方法,該法準(zhǔn)確度和靈敏度均很高。

4 其他檢測方法

常用的檢測方法所需儀器較大,耗費(fèi)高且檢測環(huán)境有很大的局限性。如今,獸藥殘留檢測技術(shù)不斷的向著新的方向發(fā)展,國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于食品中的快速檢測技術(shù)包括免疫學(xué)檢測法、分子印跡技術(shù)、生物芯片技術(shù)、生物傳感器檢測法等。

4.1 免疫學(xué)檢測法 免疫學(xué)檢測法是一種廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的檢測的方法,該法包括聯(lián)酶免疫檢測法、熒光免疫檢測法、膠體金免疫檢測法和免疫傳感器技術(shù)[36]。以酶聯(lián)免疫檢測法為例,其檢測原理如圖1,該法具有操作簡單、省時和準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)[37]。何方洋等[38]運(yùn)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法和膠體金免疫層析法三種免疫學(xué)檢測法對動物源性食品(雞肉等)中的呋喃唑酮進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、膠體金免疫層析法對呋喃唑酮代謝物的檢測限分別為0.01、0.02、50 ng/L,發(fā)光免疫分析法和酶聯(lián)免疫分析法添加回收試驗(yàn)的變異系數(shù)范圍分別為小于15.0%和小于8.0%。因此,不論是實(shí)驗(yàn)室檢測還是戶外的批量樣本檢測,不同的免疫學(xué)檢測法在不同的應(yīng)用條件下各有優(yōu)勢。

4.2 分子印跡技術(shù) 分子印跡技術(shù)(MIT)是指用化學(xué)方法合成對目標(biāo)物具有特異選擇性聚合物的過程[39],是利用模板記憶在聚合物基質(zhì)中形成選擇性位點(diǎn)創(chuàng)建分子印跡聚合物(MIPs)的技術(shù)[40]。其檢測原理如圖2,該法具有靈敏度高、操作便捷、成本低、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[41]。李橋[42]等運(yùn)用分子印跡技術(shù),以金屬有機(jī)骨架為穩(wěn)定離子,通過皮克林乳液法制備了分子印跡中空微球,可用于檢測動物性食品中的阿莫西林,結(jié)果表明,分子印跡中空微球?qū)Π⒛髁钟休^大的吸附容量,吸附容量在318 K,100 mg/L的阿莫西林溶液中達(dá)到0.1376 mmol/g。Ma等[43]用二甲胺四環(huán)素的分子印跡納米聚合物聚合在金屬有機(jī)骨架材料表面,以該種新型復(fù)合材料為吸附劑,建立了分散固相微萃取方法,用于雞肉中7種四環(huán)素的超高效液相色譜測定方法。該復(fù)合材料對7種四環(huán)素具有較高的吸收能力,回收率可達(dá)92%以上,可重復(fù)使用8次。7種藥物的檢出限為0.2～0.6 ng/g,因此,該方法可用于肉類中四環(huán)素殘留量的多重檢測。

圖2 分子印跡技術(shù)原理圖Fig 2 Schematic diagram of molecular imprinting technology

4.3 生物芯片技術(shù) 生物芯片技術(shù)是一種利用雜交技術(shù)對食品基因進(jìn)行檢測的方法[44],此項(xiàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了便攜微型自動化處理[45],已廣泛的應(yīng)用于食品安全檢測領(lǐng)域中。生物芯片的種類包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片和細(xì)胞芯片等[46]。以蛋白質(zhì)芯片為例,其檢測步驟如圖3,相比其他生物技術(shù),生物芯片技術(shù)具有消耗試劑少、結(jié)果可比性高等特點(diǎn)[47]。郭志紅[48]運(yùn)用蛋白芯片技術(shù)檢測了雞肉中鹽酸克侖特羅、恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶等的殘留,結(jié)果表明每種藥物在雞肉中的回收率均在60%～120%,變異系數(shù)在25%以內(nèi)。

圖3 蛋白質(zhì)芯片檢測流程圖Fig 3 Protein chip detection flowchart

4.4 生物傳感器檢測法 生物傳感器主要是由識別元件(如抗原抗體)和信號轉(zhuǎn)換器組成[49],可形象的如圖4所示。該法具有準(zhǔn)確性高、處理時間短和成本低等特點(diǎn),該技術(shù)在國外發(fā)展很快,基本已廣泛應(yīng)用到各行各業(yè)中[50]。劉衛(wèi)華[51]等運(yùn)用氟苯尼考多克隆抗體成功構(gòu)建了一種基于石墨烯-殼聚糖復(fù)合修飾材料的電化學(xué)免疫傳感器技術(shù)檢測雞肉、雞蛋中的氟苯尼考?xì)埩?結(jié)果表明,每次的回收率均在76.90%～94.30%之間。由此可見,生物傳感器檢測法可應(yīng)用于大批量的樣本檢測,且檢測的地域局限小。

圖4 生物傳感器檢測法原理圖Fig 4 Schematic diagram of biosensor detection method

5 展 望

獸藥殘留種類和途徑十分復(fù)雜,目前已廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測的技術(shù)中,不論是前處理技術(shù),還是樣品的檢測技術(shù),都存在著一些如儀器體積大,造價高,檢測地受限等缺點(diǎn)。我國雖已逐漸開始普及生態(tài)養(yǎng)殖,但現(xiàn)下這些綠色養(yǎng)殖法因成本、時間和技術(shù)等問題還未完全普及,應(yīng)用并不廣泛。因此,規(guī)范養(yǎng)殖、嚴(yán)格按規(guī)定使用獸藥、加強(qiáng)市場監(jiān)管和發(fā)展獸藥殘留檢測技術(shù)手段仍然十分重要。微型、高通量、低耗材、低成本的獸藥殘留快速檢測技術(shù)亟待完善,應(yīng)用的領(lǐng)域也將更加廣泛。