徐婉婷,牛牧青,鄭永良,劉 暢,徐碧林,呂銳玲,范 霞,王 政*

(1.黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院,湖北黃岡 438000;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,武漢 430070;3.經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良及資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北黃岡 438000)

氟苯尼考(Florfenicol,FF),又名氟甲砜霉素,是動(dòng)物專(zhuān)用抗菌藥物。氟苯尼考能與細(xì)菌70 S核糖體的50 S亞基緊密結(jié)合,降低肽酰基轉(zhuǎn)移酶的活性,從而抑制肽鏈的延伸,干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成,對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌均有抑制作用[1]。因其良好的抑菌效果,氟苯尼考被廣泛應(yīng)用于治療牛、豬、雞等家禽和魚(yú)類(lèi)的細(xì)菌性疾病[2]。隨著氟苯尼考的廣泛使用,其殘留問(wèn)題也逐漸引起了人們的廣泛關(guān)注[3]。氟苯尼考的殘留主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面,一方面是食品中的殘留,在畜禽、水產(chǎn)等動(dòng)物性食品中殘留的氟苯尼考,可通過(guò)食物鏈傳遞,造成食品安全隱患,影響消費(fèi)者健康[4]。另一方面,動(dòng)物攝入的氟苯尼考不能被其完全吸收,會(huì)以母體或者代謝物的形式隨著糞便和尿液等排泄物排出體外進(jìn)入到環(huán)境中,造成氟苯尼考及其代謝物在水體、底泥和土壤等生態(tài)環(huán)境的殘留和累積[5]。與此同時(shí),環(huán)境中氟苯尼考的累積促進(jìn)了氟苯尼考耐藥菌的富集和傳播,對(duì)公共安全造成了威脅。根據(jù)我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》(GB31650-2019)中的規(guī)定,氟苯尼考的最大殘留限量為氟苯尼考及其代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺之和[6],研究人員建立了很多針對(duì)氟苯尼考及其代謝物的檢測(cè)方法,其中色譜分析法是各種檢測(cè)方法中的金標(biāo)準(zhǔn)。氟苯尼考的色譜分析法主要有氣相色譜法和液相色譜法。二者也可與質(zhì)譜串聯(lián)使用,稱(chēng)為氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,均有高效、靈敏的優(yōu)點(diǎn),在水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品和環(huán)境樣品檢測(cè)中都有應(yīng)用[7]。本文對(duì)氟苯尼考及其代謝物的色譜檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述,對(duì)各檢測(cè)方法的優(yōu)、缺點(diǎn)進(jìn)行了分析,并對(duì)不同的前處理方法進(jìn)行了比較,以期為氟苯尼考的殘留分析提供科學(xué)參考。

1 前處理方法比較分析

1.1 動(dòng)物產(chǎn)品的前處理分析 氟苯尼考的分析測(cè)定過(guò)程中,除了定量方法的選擇外,樣品前處理是至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。它將復(fù)雜體系中待測(cè)組分與基體進(jìn)行分離,除去對(duì)分析測(cè)定有干擾的雜質(zhì),通過(guò)純化和富集以提高濃度,制成便于測(cè)定的溶液形式[8]。樣品的前處理直接影響到分析的效率和結(jié)果,樣品的種類(lèi)和實(shí)驗(yàn)條件不同,所用的提取方法和凈化方法不同(表1)。合適的前處理技術(shù)結(jié)合高靈敏度的檢測(cè)方法,才能獲得良好的檢測(cè)結(jié)果。氟苯尼考易溶于有機(jī)溶劑,所以提取液大多選擇甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。有研究比較了不同提取試劑對(duì)豬肉中氟苯尼考回收率的影響,發(fā)現(xiàn)甲醇和乙腈提取率較差,回收率較低;乙酸乙酯提取效果最佳,帶入的干擾物質(zhì)較少,無(wú)須固相萃取小柱的凈化,簡(jiǎn)化凈化過(guò)程,節(jié)約了樣品前處理的成本[9-10]。對(duì)于禽蛋樣品,蛋白質(zhì)含量較高,而乙腈比乙酸乙酯的極性大,在提取目標(biāo)化合物的同時(shí)可以沉淀蛋白,是良好的蛋白沉淀劑,能有效提取氟苯尼考。曾勇等[11]比較了乙腈、乙酸乙酯、甲醇三種試劑對(duì)禽蛋中氟苯尼考的回收率情況,甲醇回收率較低,而在禽蛋中加入堿性乙酸乙酯后樣品基質(zhì)會(huì)變成果凍狀,無(wú)法充分提取,影響回收率。乙腈能有效提取藥物,再用正己烷去除脂肪等雜質(zhì),也可省去固相萃取步驟。樣品處理后用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)分析,氟苯尼考的檢測(cè)限(LOD)為0.5 μg/kg,定量限(LOQ)為2.0 μg/kg,回收率為73.5%～81.7%。雞爪是家禽的副產(chǎn)品,但關(guān)于氟苯尼考在雞爪中的殘留檢測(cè)研究很少。Pokrant等[12]用水和丙酮提取雞爪中的氟苯尼考和氟苯尼考胺,加入二氯甲烷液液萃取凈化,再用液相色譜-質(zhì)譜對(duì)分析物進(jìn)行檢測(cè)。氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率為88.91%～115.83%,LOD均為50 μg/kg,LOQ均為56.8 μg/kg。液液萃取(LPE)和固相萃取(SPE)作為樣品預(yù)處理技術(shù),主要用于樣品的分離和純化,但傳統(tǒng)的液液萃取和固相萃取技術(shù)具有持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、消耗有機(jī)溶劑等缺點(diǎn)。Imran等[13]測(cè)定雞肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺時(shí),先用氨化乙腈提取,乙酸乙酯二次提取。正己烷脫脂后,用封端C18材料進(jìn)行分散固相萃取(dSPE),進(jìn)一步對(duì)提取物凈化。氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率分別為91.6%～100.5%、86.4%～94.5%,LOD分別為0.73 μg/kg和0.58 μg/kg,LOQ分別為2.45 μg/kg和1.9 μg/kg。相比于傳統(tǒng)的固相萃取法,分散固相萃取具有快速、簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn),并且不需要大量的溶劑來(lái)從吸附劑中回收分析物。Wei等[14]采用磁性分子印跡固相萃取(M-MISPE)與高效液相色譜紫外檢測(cè)(HPLC-UV)相結(jié)合的方法檢測(cè)雞蛋和雞血中的氟苯尼考。磁性雙模板分子印跡聚合物(DMIP)具有磁響應(yīng)性,對(duì)氟苯尼考具有良好的吸附能力和選擇性。結(jié)果顯示,氟苯尼考的平均回收率為88.3%～99.1%,LOD為0.08 μg/kg。此檢測(cè)方法快速、靈敏度高、選擇性好,在動(dòng)物樣品檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。氟苯尼考的檢測(cè)方法一般是基于溶劑提取,然后去除雜質(zhì)。氟苯尼考代謝研究表明,在雞、豬、牛和魚(yú)的可食用組織中,一些代謝產(chǎn)物對(duì)蛋白質(zhì)等生物分子具有較強(qiáng)的結(jié)合親和力。這些結(jié)合的氟苯尼考?xì)埢荒鼙挥袡C(jī)溶劑直接提取,需要酸水解步驟來(lái)釋放結(jié)合殘基并將其轉(zhuǎn)化為氟苯尼考胺[15-16]。Shizuka等[17]開(kāi)發(fā)了一種新的方法,先從樣品中釋放結(jié)合殘留物,然后將氟苯尼考及其代謝物轉(zhuǎn)化為氟苯尼考胺,最后檢測(cè)氟苯尼考胺的濃度。Shizuka測(cè)定牛組織和鰻魚(yú)中氟苯尼考?xì)埩袅?結(jié)果顯示,氟苯尼考的回收率為93%～104%,LOD和LOQ分別為10 μg/kg和0.5 μg/kg。該研究通過(guò)仔細(xì)優(yōu)化樣品水解和凈化步驟,以最大限度地減少基質(zhì)效應(yīng)和分析物損失,開(kāi)發(fā)了一種可靠的總氟苯尼考?xì)埩魴z測(cè)方法,通過(guò)使用溶劑標(biāo)準(zhǔn)品的外部校準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量,既不需要同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo),也不需要基質(zhì)匹配校準(zhǔn),具有很好的應(yīng)用前景。Li等[18]通過(guò)酸水解與溶劑萃取相結(jié)合,對(duì)雞蛋中氟苯尼考總殘留量進(jìn)行定量分析。樣品酸水解后用乙酸乙酯洗滌去除干擾物質(zhì),在堿性條件下用乙酸乙酯萃取,MCX固相萃取柱凈化,雞蛋中氟苯尼考胺的回收率為91.2%～102.4%,LOD和LOQ分別為0.5 μg/kg和1.0 μg/kg。動(dòng)物產(chǎn)品中氟苯尼考的殘留檢測(cè)大多集中于可食用組織,而對(duì)于家禽羽毛研究較少。羽毛作為一種替代樣品材料,檢測(cè)家禽養(yǎng)殖中氟苯尼考的使用情況,可以在一定程度上解決干擾基質(zhì)多、收集不便等問(wèn)題。為了研究氟苯尼考及其代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺在肉雞羽毛中的殘留情況,Cornejo等[19]用丙酮和水作為提取溶劑,再加入二氯甲烷進(jìn)行液液萃取。氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率為99%～102%,LOD均為20 μg/kg,LOQ分別為24.4 μg/kg和24.5 μg/kg。

表1 不同類(lèi)型樣品的前處理方法比較分析Tab 1 Comparative analysis of pretreatment methods for different types of samples

1.2 環(huán)境類(lèi)樣品的前處理分析 環(huán)境樣品中抗生素檢測(cè)是評(píng)價(jià)環(huán)境安全的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[20]。土壤、水和畜禽糞便等環(huán)境樣品都已經(jīng)被檢測(cè)出來(lái)含有殘留的抗生素[21]。不同于動(dòng)物性產(chǎn)品,環(huán)境樣品成分復(fù)雜,其提取的雜質(zhì)更多,易對(duì)檢測(cè)分析造成干擾。對(duì)于土壤樣品中氟苯尼考的殘留檢測(cè),用乙酸乙酯提取的雜質(zhì)較多,凈化過(guò)程較為繁雜,而用甲醇、乙腈或丙酮提取,效果較好。張沖[22]建立了土壤中氟苯尼考?xì)埩舻臋z測(cè)方法,甲醇提取,LC-18固相萃取小柱凈化。實(shí)驗(yàn)比較了二氯甲烷、甲醇和乙睛對(duì)土壤中氟苯尼考的提取效果,其中甲醇提取效率最高,再輔以超聲提取,最終氟苯尼考回收率為82.5%。Xu等[23]同時(shí)檢測(cè)土壤中氟苯尼考及氟苯尼考胺。樣品用氨化乙腈提取,加入無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉除水,PSA和C18吸附劑凈化后,震蕩離心,取上清液上機(jī)測(cè)定。結(jié)果顯示,氟苯尼考和氟苯尼考胺的平均回收率為73.6%～94.9%。此方法不用固相萃取柱凈化,是一種簡(jiǎn)便,低成本,有效的測(cè)定方法。除土壤樣品外,還有一類(lèi)環(huán)境樣品——畜禽糞便,近年來(lái)也逐漸受到了人們的關(guān)注。畜禽糞便基質(zhì)復(fù)雜,前處理較為繁瑣,大多需要用固相萃取小柱凈化雜質(zhì)。Wang等[24]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)了畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中有機(jī)肥料中氟苯尼考的殘留濃度,用水:甲醇:丙酮(50∶25∶25,V/V/V)提取后,HLB萃取柱凈化。氟苯尼考的LOD為0.1 μg/kg,LOQ為0.5 μg/kg,平均回收率為76.6%～85.4%。Pokrant等[25]從糞便基質(zhì)中提取氟苯尼考。將樣品均質(zhì)后用乙腈和EDTA-McIlvaine緩沖液(pH 4.0)提取。無(wú)粘合劑的玻璃纖維濾紙過(guò)濾,HLB固相萃取柱凈化,氟苯尼考的LOD為11.2 μg/kg,LOQ為33.5 μg/kg,回收率為97.5%～99.2%。目前,關(guān)于畜禽糞便中氟苯尼考的殘留檢測(cè)文章較少,此方法可以為之后的殘留檢測(cè)提供參考。

總的來(lái)看,氟苯尼考提取液大多選擇甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑,但不同類(lèi)型的樣品中提取液的選擇不一樣。在動(dòng)物產(chǎn)品分析中,乙腈是良好的蛋白沉淀劑,提出的雜質(zhì)相對(duì)較少,可以省去固相萃取柱凈化這一步驟。對(duì)于土壤,糞便等環(huán)境樣品,提取過(guò)程中許多內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)法得到有效去除,凈化過(guò)程較為復(fù)雜,需固相萃取柱過(guò)濾純化。相較于傳統(tǒng)的固體萃取技術(shù),分散固相萃取技術(shù)快速、簡(jiǎn)單,并且不需要大量的溶劑來(lái)從吸附劑中回收分析物。磁性分子印跡固相萃取無(wú)需固相萃取柱填料,只需外置磁鐵即可快速分離,耗時(shí)短,準(zhǔn)確性高。

2 色譜分析

2.1 氣相色譜法 氣相色譜法(GC)是利用氣體作流動(dòng)相的色層分離分析方法,原理如圖1所示,試樣被載氣(流動(dòng)相)帶入色譜柱中,由于固定相對(duì)各組份的吸附或溶解能力不同,因此各組份從色譜柱流出的時(shí)間不同,組分彼此分離[26]。氟苯尼考含有硫酰基和亞氨基,有很強(qiáng)的極性且難揮發(fā),在采用氣相色譜法分析此類(lèi)化合物時(shí),需對(duì)其極性官能團(tuán)進(jìn)行酯化、硅烷化或?；?生成易揮發(fā)的衍生物[27]。如表2所示,氣相色譜對(duì)于氟苯尼考的殘留檢測(cè)在動(dòng)物組織中應(yīng)用廣泛。胡紅美等[28]用乙酸乙酯提取樣品,正己烷除脂,PSA吸附劑凈化,硅烷化試劑衍生化后通過(guò)氣相色譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中氟苯尼考,結(jié)果顯示氟苯尼考在鯽魚(yú)、青蟹、南美白對(duì)蝦中的回收率分別為82%～93%、89%～96%和91%～93%,LOD為0.3 μg/kg。該方法回收效果較好,準(zhǔn)確度也較高,可以滿(mǎn)足水產(chǎn)品中氟苯尼考的檢測(cè)要求。對(duì)于用乙酸乙酯提取,正己烷除脂后還是凈化不完全的樣品,則需要借助固相萃取柱,如MCX固相萃取柱、C18固相萃取柱來(lái)完成進(jìn)一步的凈化[29-30]。孫豐云等[29]同時(shí)檢測(cè)了蝦肉中的氟苯尼考和氟苯尼考胺,提取劑為氨化乙酸乙酯。氟苯尼考胺呈堿性,極性高,故采用MCX固相萃取柱凈化,弱堿性的氟苯尼考胺在酸性溶液中呈離子狀態(tài),通過(guò)陽(yáng)離子交換作用保留在柱上,而氟苯尼考通過(guò)反向交換作用保留在柱上。結(jié)果顯示,氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率分別為89.0%～93.3%和86.3%～119.6%,LOD分別為0.4 μg/kg和0.2 μg/kg,LOQ分別為1.3 μg/kg和0.8 μg/kg。在胡紅美和孫豐云的研究中,分別用PSA吸附劑和MCX柱凈化,二者回收率和檢測(cè)限相差不大。對(duì)于氟苯尼考的檢測(cè),PSA在乙酸乙酯中可吸附氟苯尼考,需用丙酮溶解提取物,在丙酮中用PSA凈化。MCX萃取柱能達(dá)到較好的凈化效果,但是,固相萃取需要進(jìn)行活化、上樣、淋洗、洗脫等過(guò)程,步驟較多、過(guò)柱時(shí)間較長(zhǎng),不利于大批量樣品的檢測(cè)。

圖1 氣相色譜原理Fig 1.principle of gas chromatography

表2 氣相色譜檢測(cè)樣品中的FFTab 2 Determination of FF in samples by gas chromatography

上述文獻(xiàn)都是用的是氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器(GC-ECD)來(lái)檢測(cè)氟苯尼考。ECD是一個(gè)高靈敏度的檢測(cè)器,但只對(duì)具有電負(fù)性的物質(zhì),如含鹵素、硫、磷、氮的物質(zhì)有信號(hào),而對(duì)電中性(無(wú)電負(fù)性)的物質(zhì),無(wú)信號(hào),這在一定程度上限制了它的使用[31]。質(zhì)譜儀靈敏度高,樣品用量少,分析速度快,與氣相色譜相連實(shí)現(xiàn)對(duì)未知成分的分離和定性。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)可根據(jù)樣品中待測(cè)組分在圖譜上的保留時(shí)間和此保留時(shí)間內(nèi)殘留藥物分子裂解的特征離子碎片,由質(zhì)譜儀對(duì)藥物進(jìn)行準(zhǔn)確定性,并以此作為定量的依據(jù),從而克服了因雜質(zhì)峰與藥物保留時(shí)間相同而將雜質(zhì)峰誤認(rèn)為藥物的缺點(diǎn),因此氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法廣泛用于復(fù)雜組分的分離和鑒定[32]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)之前,需對(duì)其凈化。水產(chǎn)品中殘留藥物的凈化一般采用液-液萃取法或固相萃取法。邵會(huì)[33]建立了氣相色譜法-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定6種水產(chǎn)品(中國(guó)對(duì)蝦、大菱鲆、鯽魚(yú)、鰻魚(yú)、蟹、甲魚(yú))中的氟苯尼考和氟苯尼考胺。氟苯尼考脂溶性強(qiáng),而代謝物氟苯尼考胺極性強(qiáng)。由于極性的差異,普通固相萃取柱對(duì)2種藥物同時(shí)凈化效果不太理想。他比較了陽(yáng)離子交換固相萃取柱PCX、MCX柱以及反相吸附萃取柱HLB柱的凈化效果。結(jié)果表明,MCX柱凈化效果較好,這與已有的研究結(jié)果相符[34-35]。氟苯尼考和氟苯尼考胺的加標(biāo)回收率為76.4%～94.3%,LOD均為1.0 μg/kg,LOQ均為3.0 μg/kg。氟苯尼考的檢測(cè)分析中,固相萃取柱的選擇很關(guān)鍵,固相萃取過(guò)程中洗脫劑的選擇和用量也十分重要。氟苯尼考一般用甲醇洗脫,洗脫劑量小,不足以把目標(biāo)物從小柱上洗脫下來(lái);洗脫劑量大,會(huì)導(dǎo)致弱極性雜質(zhì)洗脫出來(lái),影響檢驗(yàn)效果。喬青青等[36]探討了固相萃取柱洗脫劑的用量對(duì)藥物回收率的影響,當(dāng)洗脫劑甲醇用量小于5 mL時(shí),氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率在90%以下,而甲醇用量超過(guò)6 mL時(shí)才能充分洗脫,2種化合物回收率均在90%～110%,回收效果較好,LOD為0.5 μg/kg。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法結(jié)合了氣相色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn),因而具有靈敏度高、分析速度快、選擇性高等優(yōu)點(diǎn),可同時(shí)完成待測(cè)組分的分離和鑒定[37]。氟苯尼考在硅烷化后有幾個(gè)豐度較大的碎片離子,易于定性鑒別,所以氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)氟苯尼考的殘留檢測(cè)靈敏[32]。

2.2 液相色譜法目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的殘留檢測(cè)方法較多,原理如圖2所示,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測(cè)方法以高效液相色譜法為主[38]。氣相色譜是利用惰性氣體的流動(dòng)相進(jìn)行分析,它的檢測(cè)對(duì)象主要是具有一定揮發(fā)性的物質(zhì),而液相色譜不受樣品的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制[39],不需要較繁瑣的衍生化步驟。因此,在氟苯尼考的檢測(cè)分析中,液相色譜應(yīng)用范圍更廣泛[40]。高效液相色譜可根據(jù)待測(cè)樣品的特性以及實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇不同的檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)分析[41],如紫外檢測(cè)器(UVD)、熒光檢測(cè)器(FD)及二極管陣列檢測(cè)器(PDA)和質(zhì)譜檢測(cè)器(MSD)等,詳細(xì)內(nèi)容如表3所示。紫外檢測(cè)器是高效液相中常用的檢測(cè)器之一,靈敏度較高,線(xiàn)性范圍寬,噪聲低[42]。李濤等[43]用高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測(cè)器測(cè)定畜禽肉中氟苯尼考?xì)埩袅?樣品經(jīng)乙腈提取,正己烷除脂,濾膜過(guò)濾后直接高效液相色譜儀分析。平均加標(biāo)回收率為91.8%～95.2%,LOD為10 μg/kg,LOQ為30 μg/kg。此方法操作簡(jiǎn)單,成本較低,適合畜禽肉中氟苯尼考?xì)埩舻臋z測(cè)。相比于畜禽產(chǎn)品中氟苯尼考的檢測(cè),飼料這類(lèi)成分復(fù)雜的樣品,其凈化步驟也更加復(fù)雜,這增加了分析成本。Yang等[44]建立了薄層色譜-高效液相色譜法串聯(lián)紫外檢測(cè)器測(cè)定豬、雞、魚(yú)飼料中氟苯尼考的方法。氟苯尼考的回收率為80.6%～105.3%,LOD為20 μg/kg,LOQ為50 μg/kg。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了固相萃取柱和薄層色譜這兩種方法的凈化效果。結(jié)果顯示,凈化豬飼料樣品時(shí),固相萃取不能有效去除干擾,而薄層色譜具有較好的分離效率和較低的成本。紫外檢測(cè)器分析樣品時(shí),要求樣品必須有紫外吸收,且流動(dòng)相的紫外吸收應(yīng)盡可能的小,否則會(huì)有較大的本底吸收,影響結(jié)果。二極管陣列檢測(cè)器作為紫外檢測(cè)器的升級(jí),可以克服普通紫外檢測(cè)器的缺點(diǎn),給出的是色譜、光譜的三維譜圖,可以測(cè)出樣品中每一種物質(zhì)的最大吸收,實(shí)現(xiàn)三維定性與定量分析,為分析工作者提供十分豐富的定性定量信息[45]。楊方等[46]用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)鰻魚(yú)中氟苯尼考含量。采用乙酸乙酯提取樣品,在提取過(guò)程中,因鰻魚(yú)肉中有大量脂質(zhì)及類(lèi)脂物質(zhì)同時(shí)被提取出,用正已烷除脂,再采用C18小柱凈化以除去水溶性雜質(zhì)的干擾。結(jié)果表明,該方法的平均回收率為93%,LOD為9.1 μg/kg,LOQ為22.3 μg/kg。馬文瑾等[47]用液相色譜串聯(lián)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)土壤中氟苯尼考及氟苯尼考胺。樣品自然風(fēng)干后,用丙酮和水作為提取試劑,采用超聲輔助提取,再與二氯甲烷進(jìn)行液液萃取凈化雜質(zhì)。試驗(yàn)測(cè)得土壤樣品中氟苯尼考和氟苯尼考胺的加標(biāo)回收率分別為90.16%～99.37%、67.63%～96.86%,LOD分別為10、15 μg/kg,LOQ分別為45、50 μg/kg。與畜禽樣品的提取方法不同,土壤樣品選用丙酮和水來(lái)提取氟苯尼考,回收率相對(duì)較高,而且提取出的內(nèi)源性物質(zhì)少,減少了雜峰干擾。熒光檢測(cè)器也是常用的檢測(cè)器,采用激光作為熒光檢測(cè)器的光源而產(chǎn)生的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器極大地增強(qiáng)了熒光檢測(cè)的信噪比,具有良好的選擇性。熒光檢測(cè)器的靈敏度很高,比紫外檢測(cè)器約高兩個(gè)數(shù)量級(jí),其線(xiàn)性范圍比紫外檢測(cè)器窄。劉永濤等[48]和謝愷舟等[49]用高效液相色譜熒光檢測(cè)法分別檢測(cè)水產(chǎn)品和雞肉中氟苯尼考含量,最終LOD分別為5 μg/kg、1.5 μg/kg。二者樣品都用丙酮來(lái)提取,提取的內(nèi)源性雜質(zhì)較少,省去了固相萃取步驟,方法的藥物平均回收率分別為79%～90%和79.3%～82.5%。劉永濤和謝愷舟采用傳統(tǒng)的液-液萃取法提取氟苯尼考。為了簡(jiǎn)化樣品的預(yù)處理及提高效率,Wang等[50]采用加速溶劑萃取(ASE)從樣品中提取目標(biāo)分析物,結(jié)合超高效液相色譜-熒光檢測(cè)器測(cè)定禽蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的殘留量。氟苯尼考和氟苯尼考胺的加標(biāo)回收率分別為89.4%～98.6%、91.5%～98.0%,LOD分別為4.7、1.8 μg/kg,LOQ分別為10.5、4.3 μg/kg。此外,還比較了超聲提取、渦旋振蕩提取、ASE提取的效果。結(jié)果表明,ASE具有自動(dòng)化、試劑消耗少、回收率高以及適用于樣品的批量處理等優(yōu)點(diǎn)。比較上述三種檢測(cè)器,紫外檢測(cè)器目前在液相色譜方面應(yīng)用范圍廣。二極管陣列檢測(cè)器可以測(cè)出樣品中每一種物質(zhì)的最大吸收,這樣可以分別進(jìn)行靈敏度最高的檢測(cè),克服了普通紫外檢測(cè)器的缺點(diǎn)。但是,其價(jià)格相對(duì)昂貴,對(duì)于成熟的色譜條件分析沒(méi)有優(yōu)勢(shì),適合新產(chǎn)品的色譜條件開(kāi)發(fā)、摸索。熒光檢測(cè)器靈敏度最高,檢出限最低,其適用范圍比紫外檢測(cè)器窄,僅適用于被激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。并且,對(duì)發(fā)生在熒光測(cè)量中的一些干擾非常敏感,在進(jìn)行定量分析時(shí),有必要驗(yàn)證這些干擾是否存在,以及對(duì)樣品測(cè)定的影響程度,該缺點(diǎn)限制了熒光檢測(cè)器的應(yīng)用。

圖2 液相色譜原理Fig 2.Principle of liquid chromatography

表3 液相色譜檢測(cè)樣品中FFTab 3 Determination of FF in samples by liquid chromatograph

高效液相色譜是通過(guò)監(jiān)測(cè)與計(jì)算保留時(shí)間來(lái)對(duì)單個(gè)物質(zhì)進(jìn)行定性檢測(cè)的,但是兩個(gè)不同的物質(zhì)可能具有相同的保留時(shí)間,這就會(huì)導(dǎo)致高效液相色譜在物質(zhì)定性上可能存在不準(zhǔn)確的情況[35]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)是通過(guò)使待測(cè)物質(zhì)中各個(gè)組分在離子源中產(chǎn)生電離,通過(guò)質(zhì)荷比的差異來(lái)對(duì)各組分進(jìn)行定性分析,提高了檢測(cè)的靈敏度,也避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)[51]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定氟苯尼考含量時(shí),常用的定量方法有外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法,外標(biāo)法是用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì),以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量。張偉瑋等[52]用高效液相色譜-質(zhì)譜分析雞肉中殘留的氟苯尼考時(shí),用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示,氟苯尼考的峰面積與其濃度均呈良好線(xiàn)性關(guān)系。氟苯尼考的回收率為84.7%～95.2%,LOD為0.2 μg/kg,LOQ為0.5 μg/kg。內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法相對(duì),是在測(cè)定樣品中某組分含量時(shí),加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校準(zhǔn)和消除由于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響,以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。殷平等[53]用液相色譜-質(zhì)譜同位素稀釋法測(cè)定水產(chǎn)品中的氟苯尼考,采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量,此法有機(jī)試劑消耗量少、操作步驟少且測(cè)定周期短。氟苯尼考在魚(yú)肉中回收率為78.6%～102.7%,在蝦肉中為73.5%～109.6%。LOD為1.5 ng/mL,LOQ為0.5 ng/mL。Xie等[54]選用內(nèi)標(biāo)法定量,高液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(LC-ESI/MS/MS)同時(shí)分析雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺。在雞蛋樣品的預(yù)處理過(guò)程中,優(yōu)化了提取劑以及乙腈飽和正己烷的體積,以更好地去除蛋白質(zhì)和脂肪,從而提高了回收率,也節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。氟苯尼考和氟苯尼考胺的平均回收率為90.84%～107.84%,LOD分別為0.1、0.5 μg/kg,LOQ分別為0.3、1.5 μg/kg。外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法都是色譜分析中定量方法。外標(biāo)法簡(jiǎn)便,但對(duì)于進(jìn)樣量要求準(zhǔn)確,要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行,否則造成分析誤差,得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果;內(nèi)標(biāo)法在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差,因而測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確。但內(nèi)標(biāo)法的操作程序較為麻煩,有時(shí)尋找合適的內(nèi)標(biāo)物有困難。超高效液相色譜(UHPLC)是指一種采用小顆粒填料色譜柱和超高壓系統(tǒng)的新型液相色譜技術(shù),與傳統(tǒng)的高效液相技術(shù)相比,能大幅度改善液相色譜的分離度、靈敏度,極大地提高分析工作的效率和質(zhì)量[55]。Li等[56]建立了一種用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定中藥明膠中氟苯尼考?xì)埩袅康姆椒?。氨?乙腈提取藥物,加入胰蛋白酶來(lái)消除明膠藥物中蛋白質(zhì)成分引起的基質(zhì)效應(yīng),加入無(wú)水硫酸鈉、C18和PSA吸附劑來(lái)減少其他成分引起的基質(zhì)效應(yīng)。氟苯尼考的回收率為92.8%～102.7%。樣品中氟苯尼考的LOD和LOQ分別為0.4 μg/kg和1.5 μg/kg。Faulkner等[57]提出了一種有效檢測(cè)牛奶中氟苯尼考及其代謝物的方法,該方法采用MRM3采集技術(shù),超高效液相色譜-質(zhì)譜分析檢測(cè)。牛奶樣品鹽酸水解后調(diào)節(jié)pH到10以上,再用乙酸乙酯提取,分散式固相萃取進(jìn)一步萃取凈化。氟苯尼考胺的回收率為92%～113%,CCα(Decision limit)為0.2 μg/kg,CCβ(detection capability)為0.34 μg/kg。與MRM(Multi Reaction Monitor)相比,MRM3改進(jìn)了牛奶中較低水平氟苯尼考胺的選擇性檢測(cè)和定量。

3 展 望

不同色譜檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。用儀器分析法檢測(cè)氟苯尼考時(shí),氣相色譜法應(yīng)用相對(duì)較少,主要是由于氟苯尼考不易揮發(fā),在使用氣相色譜法分析時(shí)需要進(jìn)行衍生化處理,樣品處理的成本較高。相比較而言,液相色譜法更適合氟苯尼考的檢測(cè)。液相色譜可與多種檢測(cè)器連接。其中,紫外檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器操作簡(jiǎn)單,但靈敏度比熒光檢測(cè)器低。熒光檢測(cè)器靈敏度高,檢出限低,但只對(duì)熒光物質(zhì)有響應(yīng)。隨著科技的發(fā)展,高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)提高了檢測(cè)效率,對(duì)于復(fù)雜的環(huán)境樣品,可以增加額外的分析能力,消除基質(zhì)的干擾,準(zhǔn)確鑒定和定量氟苯尼考,且檢出限低,靈敏度高。

對(duì)于復(fù)雜樣品,前處理是影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵因素。關(guān)于氟苯尼考的前處理方法,還有待進(jìn)一步改進(jìn),如通過(guò)轉(zhuǎn)化只檢測(cè)氟苯尼考胺一種檢測(cè)物,以提高檢測(cè)效率。與此同時(shí),簡(jiǎn)化色譜分析流程以縮短檢測(cè)時(shí)間也是實(shí)際檢測(cè)的需要,根據(jù)需要有效結(jié)合快速檢測(cè)方法與色譜分析方法也是未來(lái)的分析趨勢(shì)。總的來(lái)看,色譜法在動(dòng)物產(chǎn)品和環(huán)境樣品的氟苯尼考檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用,進(jìn)一步完善色譜方法是食品安全檢測(cè)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的需要。