方軻　沈敬華

摘要：單克隆抗體的應(yīng)用是一項迅速發(fā)展的技術(shù)。本文闡述了單克隆抗體制備前雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)條件和應(yīng)用，包括細(xì)胞的培養(yǎng)、培養(yǎng)基的選擇，融合時期的選擇，從而指導(dǎo)和優(yōu)化實驗室中雜交瘤的培養(yǎng)，促進(jìn)融合細(xì)胞的融合率和后繼單克隆抗體篩選實驗的順利進(jìn)行。

關(guān)鍵詞：雜交瘤；細(xì)胞培養(yǎng)；單克隆抗體

隨著雜交瘤細(xì)胞株不斷的建立和生產(chǎn)單克隆抗體的日益廣泛應(yīng)用，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和優(yōu)化不斷得到改善，但是國內(nèi)實驗室設(shè)備和條件有限，多數(shù)的單克隆抗體的篩選還是應(yīng)用基礎(chǔ)的免疫抗原包被，結(jié)合Elisa方法聯(lián)合有限稀釋法來篩選單克隆抗體。為了獲得特異性較強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞株，融合前后細(xì)胞的培養(yǎng)以及雜交瘤的培養(yǎng)和儲存，仍是基礎(chǔ)實驗室中必須注意和重視的技術(shù)。

1雜交瘤的起源和生產(chǎn)

1.1雜交瘤所用的骨髓瘤細(xì)胞系 1966年P(guān)etingel等在體外培養(yǎng)小鼠漿細(xì)胞成功。Milstein等1972年由P3中用20μg 8-氮雜鳥嘌呤（8-azaguanine）篩選出缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的新細(xì)胞系，稱之為P3-X63-Ag8。由于X63本身分泌IgG1，形成的雜交瘤除分泌B細(xì)胞的特異性抗體外，同時分泌X63產(chǎn)生的抗體，因其抗體不純，現(xiàn)多改用不分泌型骨髓瘤細(xì)胞系。國內(nèi)現(xiàn)已引進(jìn)NS-1，SP2/0，F(xiàn)O，X63-Ag8-653等小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。最常使用的是SP2/0及NS-1[1]。

1.2人骨髓瘤細(xì)胞系 為產(chǎn)生穩(wěn)定的人免疫球蛋白的雜交瘤，需要人的缺某種酶的骨髓瘤細(xì)胞系。國外已篩選了一些人骨髓瘤細(xì)胞，但融合率不高，還沒有推廣使用。目前人一人雜交瘤技術(shù)仍存在著雜交瘤在不同培養(yǎng)基中的生長速度問題。細(xì)胞生長緩慢，抗體分泌力弱及效價較低，且難于克隆化等困難[2]，限制了人骨髓瘤細(xì)胞的應(yīng)用。

1.3淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的關(guān)系 B淋巴細(xì)胞容易與漿細(xì)胞瘤融合，而T細(xì)胞則需要同胸腺淋巴肉瘤融合（Kohler， et al. 1977；Schwaber， 1977）。脾臟是大量T或B細(xì)胞的來源，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合時，最常用的是小鼠的脾細(xì)胞。按照Burnet的細(xì)胞系選擇學(xué)說，一個B淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體，其"后代"也只能產(chǎn)生此種抗體，因為抗體是由DNA上的基因所決定，基因是可以遺傳的。在正常情況下，小鼠脾中含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B細(xì)胞，一只純種小鼠體內(nèi)可有（1～5）×107種不同的抗體，即有（1～5）×107種不同的B細(xì)胞。為了提高獲得某種雜交瘤的機(jī)會，就需要設(shè)法增加小鼠體內(nèi)分泌該種抗體的B細(xì)胞的數(shù)量。最常用的方法是用特定抗原多次免疫小鼠，使之產(chǎn)生特異性抗體。通過將免疫小鼠的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞的融合，然后經(jīng)過多次篩選，從而得到特異性的雜交瘤細(xì)胞。這樣所獲得的特異性的雜交瘤細(xì)胞在既具有脾細(xì)胞分泌抗體的能力的同時，又具有小鼠骨髓瘤細(xì)胞永生的特性，從而可以無限制地提供結(jié)構(gòu)與性質(zhì)完全相同的單克隆抗體[3]。

1.4生產(chǎn) 人用鼠源的單抗的生產(chǎn)方法分為體內(nèi)法和體外法2種。體內(nèi)法即腹水法，腹水中抗體濃度高，可達(dá)2～10mg/ml。我國對體內(nèi)法生產(chǎn)的人用鼠源單克隆抗體的質(zhì)檢項目繁多，要求嚴(yán)格，打腹水的BALB/c小鼠必須達(dá)到SPF（Specific Pathogen Free無特定病原體級實驗動物級）的要求，其飼養(yǎng)，繁殖和生產(chǎn)腹水以及純化抗體的廠房也必須符合GMP（Good Manufacturing Practice良好的生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范），限制了體內(nèi)法在人用鼠源單抗生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用；單抗的體外生產(chǎn)方法是通過雜交瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)法，它的特點(diǎn)是生產(chǎn)的產(chǎn)品純度高，避免了鼠類病毒的污染，質(zhì)檢項目方面有很大的簡化，可推廣用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，是人用鼠源單抗生產(chǎn)方式的主要發(fā)展方向[4]。

2融合細(xì)胞實驗，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)和保存注意事項

2.1單克隆抗體制備時SP2/0細(xì)胞復(fù)蘇和融合時間 融合前SP2/0需要提前1w復(fù)蘇，因為在融合前可以發(fā)生細(xì)胞反復(fù)傳代導(dǎo)致細(xì)胞生長活性下降，或是因為細(xì)胞活力的問題或是污染問題而被迫推遲細(xì)胞融合時間，所以融合前小鼠的加強(qiáng)時間一定要是在細(xì)胞傳代后，確認(rèn)細(xì)胞沒有問題再進(jìn)行小鼠的加強(qiáng)免疫。通常小鼠加強(qiáng)免疫后第4d（包括免疫的當(dāng)天），進(jìn)行細(xì)胞融合，可以取得更高的融合率。不分泌抗體的特異性B淋巴母細(xì)胞是B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合的最適時期。最后一次免疫2～4d后，脾內(nèi)特異性B細(xì)胞大量增殖時進(jìn)行融合，可得較多的雜交瘤。

筆者進(jìn)行觀察后，發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞在復(fù)蘇后培養(yǎng)第2代的時候可以進(jìn)入細(xì)胞的旺盛生長期，在這個時期進(jìn)行細(xì)胞的融合可以提高雜交瘤細(xì)胞的融合率，注意進(jìn)行融合前一天必須進(jìn)行一次細(xì)胞的換液。

2.2關(guān)于培養(yǎng)液的配置 雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液采用的是10～20%胎牛血清添加至DME或RPMI-1640中作為基礎(chǔ)的培養(yǎng)液。因為血清之間質(zhì)量差異甚大，影響試驗結(jié)果穩(wěn)定性，常需多次篩選，在篩選穩(wěn)定后，應(yīng)采用統(tǒng)一批次的血清和培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞融合，從而避免血清和培養(yǎng)液的問題導(dǎo)致的試驗結(jié)果不穩(wěn)定。筆者曾碰到過因為更換培養(yǎng)液而導(dǎo)致融合細(xì)胞后雜交瘤細(xì)胞大量死亡的事故。實驗過程中此類問題應(yīng)該盡量避免。

2.3關(guān)于培養(yǎng) 動物細(xì)胞在體外增殖的方式可以分為兩種：一種是在培養(yǎng)液中自由懸浮生長的懸浮細(xì)胞；另外一種是貼附在固相基質(zhì)表面生長的貼壁細(xì)胞（ADC，Anchoragedepen-dentcen）。雜交瘤細(xì)胞系是由骨髓瘤細(xì)胞與免疫動物的脾細(xì)胞融合形成的，不是一種嚴(yán)格的ADC細(xì)胞。不同的細(xì)胞系，細(xì)胞之間的貼壁依賴性有較大差異[5]。雜交瘤細(xì)胞是半懸浮細(xì)胞，更換培養(yǎng)液時只需要每次更換反應(yīng)器中培養(yǎng)液體積的3/4即可，保持剩余培養(yǎng)液中的細(xì)胞作為種子，可以維持反復(fù)培養(yǎng)， 減少雜交瘤細(xì)胞因受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，保證細(xì)胞活性，同時擴(kuò)大培養(yǎng)的時候也可將漂浮的部分細(xì)胞繼續(xù)單獨(dú)培養(yǎng)。

2.4關(guān)于傳代 擴(kuò)大培養(yǎng)時避免用1ml的加樣槍吹吸細(xì)胞，這樣可以避免細(xì)胞由于強(qiáng)烈的吹打?qū)е录?xì)胞的破碎和碎裂。盡量采取無損傷1.5ml的玻璃吸管吹打和傳代，可以減少細(xì)胞在傳代時導(dǎo)致的機(jī)械性損傷。

2.5關(guān)于飼養(yǎng)層細(xì)胞 飼養(yǎng)層細(xì)胞（小鼠腹腔滲出細(xì)胞）的加入有助于促進(jìn)雜交瘤的生長并可以增加雜交瘤的產(chǎn)量。飼養(yǎng)細(xì)胞可以是成纖維細(xì)胞，胸腺或脾臟淋巴細(xì)胞，但常用的是從同系健康小鼠腹腔中收集的腹腔滲出細(xì)胞，主要是巨噬細(xì)胞。

2.6關(guān)于凍存溫度 細(xì)胞凍存的過程要經(jīng)歷液體溶液的固化和水分子通過細(xì)胞膜的滲透過程，凍存細(xì)胞的溶液一旦形成冰晶，高滲透壓的環(huán)境會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變，會增加防凍劑對細(xì)胞毒性造成細(xì)胞的損傷。這是由于細(xì)胞內(nèi)形成冰晶促使電解質(zhì)濃度升高引起細(xì)胞脫水而使細(xì)胞失活。當(dāng)凍存的降溫速率過快或復(fù)溫速度過慢，都會使細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和死亡。通常溫度越低，酶活力也越低，細(xì)胞新陳代謝也隨著降低，保存時間相對延長。

傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存有程序性的降溫液氮凍存法和非程序性的降溫液氮凍存法。程序性降溫液氮凍存法需要購置專用儀器，優(yōu)點(diǎn)是溫度控制較好，對細(xì)胞損傷小，有條件的實驗室應(yīng)考慮首選該法；缺點(diǎn)是操作步驟復(fù)雜費(fèi)時，再加上成本昂貴，普及困難。

本實驗室，采用的是在添加10%比例的DMSO保護(hù)劑后，將細(xì)胞懸掛于液氮罐和液氮之間，距離液氮平面大于15cm，2～3h后放入液氮凍存或隔夜放入液氮凍存，都可以保證良好的細(xì)胞凍存效果；雜交瘤細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞凍存液里的血清濃度保持在20%的比例。凍存時選擇培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，在收集細(xì)胞前一天換新鮮培養(yǎng)液，第二天收集細(xì)胞凍存[6]。凍存液中血清含量不應(yīng)低于20%，最高可用90%的血清和10%的二甲亞砜混合的凍存液。血清濃度越高，凍存效果越好[7]。

3結(jié)論

盡管雜交瘤細(xì)胞大量培養(yǎng)和單克隆抗體制備的研究方面已經(jīng)取得很大進(jìn)展，但由于設(shè)備條件和技術(shù)的限制，國內(nèi)各實驗室大部分仍然是以少量培養(yǎng)和制備為主，還存在著很多優(yōu)化和改善的空間，以增加后期實驗單克隆抗體制備的成功率，從而使單克隆抗體的制備得到更廣泛的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]方福德.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗技巧全書[M].下冊.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，1999：06.

[2]James K and Bell GT[J]. J Immunol Methods，1987，100：5.

[3]董志偉，王琰.抗體工程[M].第二版.北京大學(xué)出版，2002：54.

[4]王祥斌，孔健.體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)人用鼠源單克隆抗體[J].中國生物制品學(xué)雜志，2002，15（5）：315.

[5]汪美先，辛顏彬，薛小平，等.雜交瘤細(xì)胞體外大量培養(yǎng)研究的進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，1990（02）：63-67.

[6]馮樂平，劉志國.基因工程試驗教程[M].第一版.科學(xué)出版社，2013：90.

[7]張贇，溫偉紅.細(xì)胞核分子免疫學(xué)實用實驗技術(shù)[M].第一版.第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2013：16.

編輯/申磊