陳錫龍,楊秀玉,趙 貴,孫真崢,王慶紅,謝麗麗,楊 強(qiáng),張秀英*

(1.貴州省獸藥飼料檢測(cè)所,貴陽 550003;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

恩諾沙星注射液和呋塞米注射液均收載于《中國獸藥典》2020年版一部[1]。恩諾沙星注射液為喹諾酮類獸醫(yī)專用抗菌藥,主要用于畜禽細(xì)菌性疾病和支原體感染,臨床應(yīng)用廣泛;呋塞米注射液為利尿藥,臨床主要用于治療各種水腫癥。實(shí)踐中聯(lián)合使用恩諾沙星和呋塞米治療仔豬水腫病[2-3],據(jù)稱效果明顯。恩諾沙星和呋塞米復(fù)方注射液曾申請(qǐng)國家發(fā)明專利[4-5],但未獲授權(quán),同時(shí),該制劑不符合國家獸藥管理相關(guān)政策,也未獲生產(chǎn)許可,故在恩諾沙星注射液及其相應(yīng)制劑中添加呋塞米或在呋塞米注射液及其相應(yīng)制劑中添加恩諾沙星均屬非法添加。2022年第二季度,貴州省獸藥飼料檢測(cè)所發(fā)現(xiàn)1批獸藥恩諾沙星注射液中疑似添加呋塞米,違反《獸藥管理?xiàng)l例》,存在較大安全隱患。功能食品[6]、保健食品[7]、中成藥[8-10]、酵素[11]、減肥藥[12]和減肥食品[13-17]等均有報(bào)道可能存在非法添加呋塞米的情況,并建立了相應(yīng)的檢測(cè)方法。非法添加呋塞米的檢測(cè)方法主要為超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法,此外,還有電噴霧-離子遷移譜法[15]、薄層色譜-近紅外光譜(TLC-NIRS)檢測(cè)方法[18]、酶聯(lián)免疫法[19]等。在此之前,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部尚未發(fā)布獸藥中非法添加呋塞米的檢查方法。據(jù)此,貴州省獸藥飼料檢測(cè)所首先對(duì)其相關(guān)檢測(cè)方法進(jìn)行了探索研究,并函請(qǐng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所對(duì)方法和結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第289號(hào)“附件1:獸藥中非特定添加物質(zhì)檢查方法”,同時(shí)參考《中國獸藥典》2020年版一部 “呋塞米注射液”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法,選擇呋塞米為測(cè)試藥物,恩諾沙星注射液為目標(biāo)制劑,建立了恩諾沙星注射液中非法添加呋塞米的檢查方法(液相色譜-二極管陣列法),為嚴(yán)厲打擊非法添加呋塞米提供技術(shù)支撐。該方法已經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第611號(hào)發(fā)布。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑 乙腈為色譜純,水為超純水,四氫呋喃、冰醋酸為分析純。

1.1.2 試藥

1.1.2.1 測(cè)試藥物 呋塞米對(duì)照品,中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):100544-202104,含量:99.8%。

1.1.2.2 制劑空白樣品 恩諾沙星注射液;生產(chǎn)單位:安徽天安生物科技有限公司;批號(hào)為20210625;規(guī)格:10 mL:0.25 g。

1.1.2.3 供試品 恩諾沙星注射液,生產(chǎn)單位:X公司;批號(hào):20210501,規(guī)格:10 mL:0.25 g。經(jīng)檢測(cè)含有呋塞米。

1.1.2.4 陽性模擬樣品 制劑空白樣品(1.1.2.2)中添加測(cè)試藥物(1.1.2.1)呋塞米,作為陽性模擬樣品。

1.2 儀器與設(shè)備 Thermo Scientific U3000高效液相色譜儀(配DAD檢測(cè)器);分析天平(XSR205DU型,分度值0.01 mg, Mettler)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil GOLD C18,4.6×250 mm 5 μm;流動(dòng)相:水-四氫呋喃-冰醋酸(70∶30∶1);檢測(cè)波長:二極管陣列檢測(cè)器采集波長范圍為200～400 nm;分辨率為1.0 nm;記錄272 nm波長處的色譜圖;柱溫:30 ℃;流速:1.0 ml/min;進(jìn)樣量:20 μL。

1.3.2 試驗(yàn)溶液

1.3.2.1 溶媒 參考《中國獸藥典》2020年版一部中呋塞米注射液含量測(cè)定方法用的混合溶液,即冰醋酸-乙腈-水(22∶489∶489),作為呋塞米的溶媒。

1.3.2.2 各種溶液的制備

1.3.2.2.1 空白溶液 ①制劑空白溶液:取恩諾沙星注射液空白制劑1.00 mL,置20 mL量瓶中,加混合溶劑[取冰醋酸22 mL,加乙腈-水(1∶1)至1000 mL,混勻]稀釋定容;另取2.00 mL,置20 mL量瓶中,加混合溶劑稀釋至刻度,搖勻,即得;② 溶劑空白:混合溶液。

1.3.2.2.2 對(duì)照品溶液 ① 呋塞米對(duì)照品貯備液:取呋塞米對(duì)照品約25 mg,精密稱定,置50 mL量瓶中,加混合溶液使溶解并稀釋至刻度,搖勻(0.5 mg/mL);② 呋塞米對(duì)照品溶液:取呋塞米對(duì)照品貯備液2.00 mL,置20 mL量瓶中,用混合溶液使溶解并稀釋至刻度,搖勻(0.05 mg/mL);③ 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液的配制:精密量取呋塞米對(duì)照品貯備液適量,加混合溶劑分別制成2.0、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。

1.3.2.2.3 供試品溶液 取供試品1.00 mL,置20 mL量瓶中,加混合溶劑[取冰醋酸22 mL,加乙腈-水(1∶1)至1000 mL,混勻]稀釋定容;另取2.00 mL,置20 mL量瓶中,加混合溶劑稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。

1.3.2.2.4 陽性模擬樣品溶液 陽性添加樣品溶液的配制:取制劑空白樣品1.00 mL,置20 mL量瓶中,按高(H)、中(M)、低(L)三個(gè)濃度水平分別加入10、8和6 mL濃度為0.5 mg/mL的呋塞米對(duì)照品貯備液,混勻,加混合溶劑稀釋至刻度,搖勻;另取2.00 mL,置20 mL量瓶中,加混合溶劑稀釋至刻度,搖勻,作為陽性添加樣品溶液。

1.3.2.2.5 檢測(cè)限溶液的配制 取制劑空白樣品1.00 mL,置20 mL量瓶中,分別加入0.5 mg/mL的呋塞米對(duì)照品貯備液0.2、0.4 和0.8 mL,混勻,加混合溶劑稀釋至刻度,搖勻;分別另取2.00 mL,置20 mL量瓶中,加混合溶劑稀釋至刻度,搖勻,分別制成0.5、1.0、2.0 μg/mL的檢測(cè)限溶液。

1.3.3 測(cè)定法 精密量取各試驗(yàn)溶液20 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定,同時(shí)記錄色譜圖與光譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

2.1.1 流動(dòng)相 采用《中國獸藥典》2020年版一部中呋塞米注射液的含量測(cè)定的高效液相色譜法的流動(dòng)相“水-四氫呋喃-冰醋酸(70∶30∶1)”系統(tǒng)作為試驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.1.2 提取波長 照1.3.1項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣呋塞米對(duì)照品溶液,得到的光譜圖中有三個(gè)最大吸收波長,分別為236、274和344 nm,考慮到《中國獸藥典》2020年版一部中呋塞米注射液的含量測(cè)定波長為272 nm,故以272 nm為提取波長。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性試驗(yàn) 干擾考察。分別取溶劑空白、制劑空白溶液、供試品溶液、陽性模擬樣品溶液和對(duì)照品溶液各20 μL,照1.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,恩諾沙星注射液本底及溶劑對(duì)被測(cè)物呋塞米的測(cè)定沒有干擾。按擬定檢查方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明在呋塞米出峰處無干擾峰,且達(dá)到基線分離,專屬性良好(圖1)。

圖1 溶劑空白、制劑空白、呋塞米對(duì)照品、供試品及陽性模擬樣品色譜圖Fig 1 Chromatograms of solvent、Enrofloxacin Injection、reference furosemide、sample and positive simulation sample

2.2.2 峰純度和光譜相似度檢查 通過供試品和呋塞米對(duì)照品溶液試驗(yàn)進(jìn)行峰純度和光譜相似度檢查。分別精密量取1.3.2.2.3項(xiàng)下的供試品溶液和1.3.2.2.2項(xiàng)下的呋塞米對(duì)照品溶液各20 μL,按1.3.1項(xiàng)下的色譜條件,注入高效液相色譜儀,采集3D數(shù)據(jù),記錄光譜圖(圖2、圖3)。結(jié)果表明,峰純度分析顯示,供試品和對(duì)照品峰匹配(表示峰最大值處的光譜與前沿和拖尾上光譜的相似度)值均為1000(匹配值大于980可以基本確認(rèn)是同一組分),說明呋塞米峰為單一組分。經(jīng)目測(cè)比較,可知供試品和對(duì)照品光譜圖一致(最大吸收波長偏差不超過2 nm)?；蛘?通過執(zhí)行光譜跟蹤把供試品和對(duì)照品的光譜圖與用呋塞米對(duì)照品溶液建立的光譜庫進(jìn)行匹配,相似度閾值設(shè)為980,可知供試品和對(duì)照品與呋塞米光譜庫的相似度分別為1000和998,即它們的紫外光譜一致。

圖2 呋塞米對(duì)照品光譜圖Fig 2 The spectrum of reference furosemide

圖3 供試品光譜圖Fig 3 The specrum of the sample

2.2.3 線性與范圍 線性關(guān)系考察:吸取1.3.2.2.2項(xiàng)③中的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液20 μL進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)濃度平行進(jìn)樣兩次。以呋塞米峰面積Y為縱坐標(biāo),相應(yīng)濃度X為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為:Y=1.0629X+0.0685,R2=1.0000。結(jié)果表明,呋塞米在2.0～100.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見表1和圖4。

表1 線性關(guān)系結(jié)果(n=2)Tab 1 Linear relationship results(n=2)

圖4 呋塞米含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 4 Standard curve of furosemide

2.2.4 檢測(cè)限 按1.3.2.2.5項(xiàng)下配制檢測(cè)限溶液進(jìn)行測(cè)定,以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢測(cè)限,結(jié)果見圖5。結(jié)果表明恩諾沙星注射液制劑中呋塞米的檢測(cè)限為1.0 μg/mL。

圖5 檢測(cè)限測(cè)定色譜光譜圖Fig 5 The chromatogram and spectrum of the LOD solution

2.2.5 準(zhǔn)確度 通過對(duì)制劑空白樣品中添加呋塞米對(duì)照品進(jìn)行回收率試驗(yàn),考察方法的準(zhǔn)確度。按1.3.2.2.4項(xiàng)下每個(gè)濃度水平分別平行配制3份陽性模擬添加樣品溶液,進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)平行進(jìn)樣2次,計(jì)算回收率,結(jié)果見表2。結(jié)果表明,制劑空白樣品中添加呋塞米的平均回收率為100.8%,RSD=1.0%。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Recovery test results

2.2.6 耐用性 以對(duì)照品溶液作為耐用性試驗(yàn)溶液,通過改變柱溫、流速兩個(gè)方面考察方法的耐用性,結(jié)果見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)柱溫升高、流速增加時(shí),保留時(shí)間會(huì)提前,同時(shí),分離度均滿足檢測(cè)要求,說明方法耐用性良好。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Durability test results

2.2.7 供試品測(cè)定 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和貴州省獸藥飼料檢測(cè)所兩家單位根據(jù)擬定的恩諾沙星注射液中非法添加呋塞米檢查方法(1.3.1項(xiàng))對(duì)供試品分別進(jìn)行測(cè)定,均確認(rèn)本批次恩諾沙星注射液(批號(hào)為20210501)中非法添加了呋塞米,并測(cè)得呋塞米的量分別為:4.8 g/L(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所),4.2 g/L(貴州省獸藥飼料檢測(cè)所),兩家單位結(jié)果基本一致。

3 討論與小結(jié)

3.1 溶媒和流動(dòng)相的選擇 陳啟友[2]采用酸沉乙醚萃取分離恩諾沙星和呋塞米;儲(chǔ)蓉等[14]使用甲醇結(jié)合超聲處理提取功能食品中的呋塞米;《中國藥典》和《中國獸藥典》使用冰醋酸-乙腈-水(22∶489∶489)作為溶媒提取呋塞米。而采用高效液相色譜法測(cè)量呋塞米含量的流動(dòng)相主要有“水-四氫呋喃-冰醋酸”和“水-甲醇-磷酸鹽緩沖液”兩種系統(tǒng)。為保持方法的延續(xù)性,選擇《中國藥典》和《中國獸藥典》使用的溶媒“冰醋酸-乙腈-水(22∶489∶489)”及流動(dòng)相“水-四氫呋喃-冰醋酸(70∶30∶1)”作為方法的溶媒和流動(dòng)相。

3.2 提取波長選擇 試驗(yàn)色譜條件下,呋塞米對(duì)照品的光譜圖中有三個(gè)最大吸收波長,分別為236、274和344 nm。《中國藥典》和《中國獸藥典》中呋塞米注射液的含量測(cè)定波長均為272 nm。試驗(yàn)獲得的274 nm和《中國藥典》及《中國獸藥典》中的272 nm雖然具有2 nm的偏差,但屬于允許的偏差范圍,故最終選擇272 nm作為方法的提取波長。

3.3 測(cè)量方法的選擇 查閱文獻(xiàn)可知,測(cè)量呋塞米的方法主要有可見-紫外分光光度法、高效液相色譜法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法?？梢?紫外分光光度法方法雖然簡單、快捷,但測(cè)量時(shí)需要分離出純凈的呋塞米,前處理方法較復(fù)雜、繁瑣;高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)量呋塞米的樣品前處理方法簡單,一般只需采用甲醇直接提取,但設(shè)備昂貴,要求操作人員須具備較高的技術(shù)水平;高效液相色譜法則相對(duì)簡單快捷,還可同時(shí)分離和測(cè)量多個(gè)復(fù)雜的組分,故選擇高效液相色譜法。

該方法準(zhǔn)確可靠,可以作為恩諾沙星注射液非法添加呋塞米的檢查方法。