王研研，曹欣，林浩卿，汪輝，徐永學(xué)，劉艷麗，李金陽，劉建凱

北京民海生物科技有限公司結(jié)合疫苗新技術(shù)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗室，北京102600

肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae，Spn）在自然界廣泛分布，常寄居在正常人的鼻咽腔中［1-2］。根據(jù)Spn的莢膜成分不同，可分為不同的血清型，目前已分離出的Spn 血清型且已經(jīng)鑒定的不少于90 種［3-5］。Spn引起的疾病為人類常見疾病，主要有腦膜炎、肺炎、敗血癥和中耳炎等，目前仍為全球關(guān)注的熱點(diǎn)［6-7］。接種多價Spn 多糖及結(jié)合疫苗是目前降低Spn 感染率及耐藥率的最經(jīng)濟(jì)、有效的手段［1，6］。

Spn的生長對營養(yǎng)物質(zhì)要求較高，通常在含有血液或血清的培養(yǎng)基中才能很好的生長［7］。在疫苗生產(chǎn)過程中，動物源性材料往往是影響疫苗安全的重要因素，動物源性材料的使用不僅增加了引入外源因子的風(fēng)險，而且增加了物料控制的難度［8］。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）及《歐洲藥典》建議在生物制品和藥品生產(chǎn)中應(yīng)盡可能避免使用動物源性材料，而選用替代材料［9］。通常情況下，Spn發(fā)酵培養(yǎng)過程中使用的物料備受關(guān)注，有較多研究利用植物來源成分替代動物源材料［10-11］，而菌種復(fù)蘇培養(yǎng)過程卻往往被忽視。目前，菌種復(fù)蘇培養(yǎng)與菌種建庫基本上均使用傳統(tǒng)的羊血固體培養(yǎng)基［7，12-13］，尚無無動物源性Spn菌種培養(yǎng)基的研究報道。

本研究旨在篩選一種無動物源性用于Spn 菌種復(fù)蘇、擴(kuò)增培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，并分析其用于菌種傳代培養(yǎng)的穩(wěn)定性及生產(chǎn)適用性，為Spn 在建庫、培養(yǎng)的整個階段徹底去除動物源性物料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株 Spn 1型（菌號：31404）、2型（菌號：31427）、3 型（菌號：31441）、4 型（菌號：31448）、5 型（菌號：31457）、6A型（菌號：31476）、6B型（菌號：31490）、7F型（菌號：31510）、8 型（菌號：31532）、9N 型（菌號：31510）、9V 型（菌號：31547）、10A 型（菌號：31218）、11A型（菌號：31572）、12F型（菌號：31586）、14型（菌號：31608）、15B 型（菌號：31638）、17F 型（菌號：31663）、18C 型（菌號：31688）、19A 型（菌號：31709）、19F 型（菌號：31693）、20 型（菌號：31727）、22F 型（菌號：31244）、23F 型（菌號：31760）、33F 型（菌號：31847），共24 株，均由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（Center for Medical Culture Collections，CMCC）提供，經(jīng)中國食品藥品檢定研究院檢定合格。

1.2培養(yǎng)基 配方1系根據(jù)10%羊血固體培養(yǎng)基的配方［12-13］，將其中的動物源物料羊血更換為氯化血紅素；配方2 ～9系根據(jù)C+Y培養(yǎng)基［5，12］進(jìn)行調(diào)整，主要是去除C+Y培養(yǎng)基中牛肉膏、胰酪胨等動物源性物料，并根據(jù)Spn生長需要調(diào)整維生素、氨基酸、無機(jī)鹽、過氧化氫酶［14-15］或血紅素等進(jìn)行配制。見表1。菌種傳代液體培養(yǎng)基和發(fā)酵用培養(yǎng)基為常規(guī)生產(chǎn)的培養(yǎng)基。

表1 培養(yǎng)基配方Tab.1 Composition of culture media

1.3主要試劑及儀器 大豆蛋白胨購自美國BD 公司；羊血（脫纖維）購自青島海博生物科技有限公司；四聯(lián)機(jī)械攪拌玻璃發(fā)酵罐購自上海百侖生物科技有限公司；超濾系統(tǒng)購自德國Merk Millipore公司。

1.4菌種復(fù)蘇用固體培養(yǎng)基的篩選

1.4.1初步篩選 取0.5 mL 19F型菌液，分別接種于各配方固體培養(yǎng)基，涂布均勻，每種配方做3個平行，置于37 ℃，10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，用10 mL生理鹽水沖洗菌苔，分光光度計檢測菌液A694。取菌液0.5 mL，用生理鹽水10倍梯度稀釋，各取100 μL稀釋菌液接種于羊血固體培養(yǎng)基，置于37 ℃，10%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。選擇菌落在50 ～300 CFU／平皿進(jìn)行統(tǒng)計計數(shù)。

1.4.2驗證 將其他血清型肺炎球菌（除19F 型）一代菌液分別接種于配方9 固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至9、11、13、15、17、19 h時，用10 mL生理鹽水沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的菌苔，檢測其濃度（A694），對照羊血固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至9、11、13 h取樣，并取各點(diǎn)菌液稀釋涂布進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.5傳代穩(wěn)定性檢測

根據(jù)Spn 莢膜多糖合成機(jī)制的不同及其合成基因的同源性分析［16-18］，將24 株Spn 分為5 類，每一類中各選取1 個血清型（3、5、9N、19F 和33F）進(jìn)行傳代穩(wěn)定性試驗。

1.5.1菌種檢定 將Spn 菌種接種于固體菌種培養(yǎng)基與羊血固體培養(yǎng)基（對照），連續(xù)傳代培養(yǎng)至15代。用生理鹽水沖洗第15 代菌苔，并向菌液中加入體積分?jǐn)?shù)30%的甘油，-70 ℃保存［6］；并根據(jù)《中國藥典》三部（2020 版）各論23 價肺炎球菌多糖疫苗中提供的方法對第15 代菌種進(jìn)行檢定。菌種檢定項目包括培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化反應(yīng)、膽汁溶菌試驗、奧普托欣試驗、莢膜腫脹試驗。

1.5.2莢膜多糖相關(guān)基因測序 10 000×g離心收集第15 代菌體，利用ONT 測序技術(shù)進(jìn)行第3 代全基因組測序。比對各血清型莢膜多糖合成相關(guān)的基因序列。

1.6生產(chǎn)適用性試驗

選取3、5、9N、19F 和33F 型Spn進(jìn)行生產(chǎn)適用性試驗。

1.6.1發(fā)酵 將Spn 菌種接種于固體菌種培養(yǎng)基（01批）與羊血固體培養(yǎng)基（對照，02 批）中，經(jīng)一代復(fù)蘇后，分別轉(zhuǎn)種于液體培養(yǎng)基（150 mL）中進(jìn)行二代培養(yǎng)［7，12］，菌濃度（A694）達(dá)0.4 ～0.6 后，分別轉(zhuǎn)種至發(fā)酵罐（2 500 mL）中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)［19］。

1.6.2多糖純化 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，加入0.1%脫氧膽酸鈉殺菌；15 000 ×g離心去菌體，上清液經(jīng)超濾后進(jìn)行酸沉、醇沉，再經(jīng)10 倍洗濾后得到精制多糖原液。根據(jù)《中國藥典》三部（2020 版）通則3429 免疫化學(xué)法速率散射比濁法測定多糖含量。參照《中國藥典》三部（2020版）相關(guān)方法，對多糖原液進(jìn)行檢測，包括固體總量、蛋白質(zhì)含量（Lorry 法）、核酸含量（分光光度法）、總氮（凱氏定氮法）、總磷（鉬酸銨法）、分子大?。–L-4B 凝膠過濾法）、氨基已糖（二氨基苯甲醛顯色法）、甲基戊糖（半胱氨酸顯色法）。

1.7數(shù)據(jù)采集與分析 應(yīng)用Excel 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。

2 結(jié)果

2.1菌種復(fù)蘇用固體培養(yǎng)基的篩選

2.1.1初步篩選 配方1 ～9 培養(yǎng)基平均菌液濃度（A694）分別為0.523、0.724、0.633、1.012、0.552、1.178、1.512、1.462 和1.924，配方7、8、9 培養(yǎng)基菌液濃度接近或超過對照菌濃度（1.678）。

配方7、8 培養(yǎng)基的菌濃度最高點(diǎn)均高于對照，配方9 培養(yǎng)基在各時間節(jié)點(diǎn)的菌濃度均高于對照。3 種配方培養(yǎng)基的菌濃度達(dá)到峰值后，均有下降趨勢，Spn 出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。配方9 培養(yǎng)基各時間點(diǎn)的活菌數(shù)與其菌濃度呈正相關(guān)。見圖1。因此，用配方9培養(yǎng)基復(fù)蘇19F 型Spn 時，培養(yǎng)至11 ～15 h，細(xì)菌活性較高。

圖1 配方7、8、9 培養(yǎng)基菌濃度對比與配方9 培養(yǎng)基活菌計數(shù)Fig.1 Comparison of bacterial concentration of formula 7，8，9 and viable count of formula 9

2.1.2驗證 不同血清型在各時間點(diǎn)的活菌數(shù)量與菌濃度均呈正相關(guān)，培養(yǎng)至第11 h時，菌濃度與活菌數(shù)量明顯增大，培養(yǎng)至第15 h（包括第15 h）后，菌濃度與活菌數(shù)量均出現(xiàn)峰值，峰值過后，菌濃度與活菌數(shù)量均有所下降。見圖2。表明配方9 培養(yǎng)基適合復(fù)蘇、擴(kuò)增培養(yǎng)Spn，且培養(yǎng)至11 ～15 h 細(xì)菌的活性較高。

圖2 各時間點(diǎn)不同血清型的菌濃度及活菌數(shù)量Fig.2 Bacterial concentration and viable count of various serotypes at each time node

2.2傳代穩(wěn)定性

2.2.1菌種檢定 固體菌種培養(yǎng)基與羊血固體培養(yǎng)基（對照）傳代的各血清型菌種檢定結(jié)果均合格（培養(yǎng)特性試驗均符合規(guī)定；染色鏡檢均為革蘭陽性球菌；生化反應(yīng)葡萄糖、菊糖、棉子糖、蜜二塘均為陽性，山梨醇為陰性；膽汁溶菌試驗菌液均變透明；奧普托欣試驗除33F 血清型對照試紙抑菌圈直徑為16 mm，其余試紙抑菌圈直徑均為15 mm；莢膜腫脹試驗菌體周圍均可見明顯無色莢膜），表明固體菌種培養(yǎng)基復(fù)蘇并傳代的菌種對Spn無任何影響。

2.2.2基因序列 固體菌種培養(yǎng)基與羊血固體培養(yǎng)基（對照）傳代的3、5、9N、19F、33F 型第15 代Spn 基因測序后，對靶位點(diǎn)基因序列進(jìn)行對比，相似度均為100%。表明無動物源性固體菌種培養(yǎng)基對Spn的靶位基因序列無影響。

2.3生產(chǎn)適用性

2.3.1分批補(bǔ)料發(fā)酵試驗 3、5、9N、19F、33F 型Spn分別用固體菌種培養(yǎng)基（01 批）與羊血固體培養(yǎng)基（02 批）復(fù)蘇后，用相同的發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，同一血清型兩發(fā)酵生長曲線的遲緩期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期均無明顯差異，01 批最高菌濃度略高于02批。見圖3。

圖3 Spn發(fā)酵生長曲線Fig.3 Fermentation growth curve of Spn

2.3.2多糖含量及多糖原液檢測結(jié)果 固體菌種培養(yǎng)基復(fù)蘇菌種的發(fā)酵表達(dá)量略高于對照，見表2。3、5、9N、19F、33F 型Spn 的01 批與02 批多糖原液各項檢測指標(biāo)均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，見表3。

表2 發(fā)酵表達(dá)量對比Tab.2 Comparison of fermentation expression

表3 Spn多糖原液檢測結(jié)果Tab.3 Test results of Spn polysaccharide stock solution

3 討論

在現(xiàn)有疫苗生產(chǎn)工藝中，培養(yǎng)階段使用含有動物源成分的物料不僅易引入病毒等外源因子，物料的均一性也難以控制［8］。因此，避免使用含有動物源性的物料可減少其帶來的安全隱患，同時也是國際生物制品行業(yè)發(fā)展的趨勢。本研究首先選取19F血清型Spn 對無動物源材料的9 種配方培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選，再對其他23 個疫苗血清型Spn 進(jìn)行培養(yǎng)測試驗證，并確定了培養(yǎng)至11 ～15 h時，細(xì)菌活性較高，從而完成了菌種復(fù)蘇用固體培養(yǎng)基的篩選。在菌種傳代過程中，菌種的培養(yǎng)特性與遺傳基因可能會由于培養(yǎng)條件與培養(yǎng)基的不同而發(fā)生變化，因此進(jìn)一步用篩選出的無動物源性固體培養(yǎng)基進(jìn)了Spn的傳代穩(wěn)定性試驗，對第15 代終末代次菌種進(jìn)行檢定與莢膜多糖基因測序，經(jīng)對比，復(fù)蘇并傳代的菌種與對照無差異。發(fā)酵生長曲線可反映Spn 在發(fā)酵時的生長情況，遲緩期一般在發(fā)酵前的2 h 左右，發(fā)酵2 h 以后基本進(jìn)入對數(shù)期，發(fā)酵至5 ～6 h 時，進(jìn)入發(fā)酵對數(shù)后期或穩(wěn)定期前期，此時可對發(fā)酵液進(jìn)行殺菌并收獲。Spn夾膜多糖作為保護(hù)性抗原，安全性和有效性是疫苗產(chǎn)品最重要的兩個基本屬性，Spn多糖疫苗中蛋白雜質(zhì)含量、核酸含量是影響疫苗安全性的重要因素之一，而特異糖或特異基團(tuán)決定疫苗的免疫原性，是保證疫苗有效性的前提條件。在用篩選出的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，菌體生長與莢膜多糖產(chǎn)量略有提高，且莢膜多糖相關(guān)檢定指標(biāo)均符合《中國藥典》三部（2020版）標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，無動物源性物料固體培養(yǎng)基適合復(fù)蘇Spn 菌種，且可用于工業(yè)生產(chǎn)中復(fù)蘇與擴(kuò)增Spn。本研究為Spn 在建庫、培養(yǎng)的整個階段徹底去除動物源性物料奠定了基礎(chǔ)。