溫嘉納，李婧妍，姬光，廖宏瑋，李燕，段維國，何春艷，孫明波，顧琴

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650118

白喉（diphtheria）是由白喉棒狀桿菌（C.diphtheriae）引起的急性呼吸道傳染病。在不發(fā)達(dá)戰(zhàn)亂頻發(fā)國家或免疫率較低地區(qū)仍有流行傳播風(fēng)險［1-2］，我國局部地區(qū)部分人群抗體濃度處于較低水平［3］。白喉毒素（diphtherotoxin）是白喉棒狀桿菌主要致病因素，可致感染者呼吸道阻塞，甚至窒息死亡；毒素進(jìn)入血液系統(tǒng)可引起全身中毒癥狀，部分患者出現(xiàn)心肌受損，成為白喉感染后期死亡原因。使用標(biāo)準(zhǔn)白喉產(chǎn)毒菌株進(jìn)行培養(yǎng)，收獲白喉毒素，制備疫苗免疫人群，是目前預(yù)防白喉最有效的手段［4］。

據(jù)文獻(xiàn)報道，白喉棒狀桿菌培養(yǎng)中，產(chǎn)毒過程與培養(yǎng)基中鐵離子有關(guān)，毒素必須在低鐵條件下生成［5-7］，白喉棒狀桿菌在含鐵為0.14 mg／L 的培養(yǎng)基中毒素產(chǎn)量最高，鐵濃度達(dá)0.6 mg／L 時，則完全不產(chǎn)毒［8］。因此，在疫苗研發(fā)過程中應(yīng)建立合理、有效的方法檢測培養(yǎng)基中鐵離子含量。分光光度法是實驗室檢測痕量鐵最常用的方法之一，相較于市售鄰菲啰啉、菲啰嗪等鐵檢測試劑盒，磺基水楊酸分光光度法具有簡便快捷、準(zhǔn)確可靠、成本低等優(yōu)點(diǎn)［9-12］。在氫氧化氨堿性（pH 8 ～11）介質(zhì)中，鐵離子與磺基水楊酸生成穩(wěn)定的黃色絡(luò)合物，該絡(luò)合物的吸光度與樣品中鐵含量成正比，因此可采用分光光度法對樣品中的鐵離子含量進(jìn)行測定［12］。根據(jù)該原理，本研究測定了鐵-磺基水楊酸絡(luò)合物特異性吸收峰，并參照《中國藥典》三部（2020版）分析方法驗證指導(dǎo)原則［13］，建立白喉產(chǎn)毒培養(yǎng)基中鐵離子含量檢測方法，并對方法進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 硫酸鐵銨［NH4Fe（SO4）2］·12H2O（分析純）購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；磺基水楊酸（C7H6O6S·2H2O，分析純）購自天津博迪化工股份有限公司；氫氧化銨（分析純）購自廣東光華科技股份有限公司；牛肉胰酶消化液培養(yǎng)基為自制；多聚蛋白胨購自美國BD 公司，配制5%蛋白胨培養(yǎng)基；Sartorius BP211D 電子分析天平購自德國Sartorius 公司；ThermoscientificVarioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific公司。

1.2Fe3+標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及稀釋 溶解0.431 7 g NH4Fe（SO4）2·12H2O 于10 mL 體積比1∶1 的鹽酸溶液中，以注射用水為稀釋劑（WFI）定容至500 mL，此溶液鐵離子含量為100 μg／mL；使用96 孔板對Fe3+標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg／mL）進(jìn)行稀釋，每孔終體積100μL，制備試驗所需含量標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3顯色條件 20%磺基水楊酸顯色劑15μL／孔，體積比1∶1氫氧化銨50μL／孔，室溫顯色10 min，以注射用水（WFI）為空白對照。

1.4反應(yīng)物及鐵-磺基水楊酸絡(luò)合物全光譜掃描Fe3+標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg／mL）1∶3 稀釋后加入顯色劑反應(yīng)，于多功能酶標(biāo)儀上進(jìn)行全光譜掃描，掃描范圍為200 ～1 000 nm，步長1 nm，檢測絡(luò)合物特異吸收峰值；同時對參與反應(yīng)的Fe3+標(biāo)準(zhǔn)溶液、20%磺基水楊酸、1∶1氫氧化銨進(jìn)行全光譜掃描。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 制備Fe3+標(biāo)準(zhǔn)溶液（100、50、10、1、0.5、0.1、0.05、0.01 μg／mL），分光光度法測定A425值，確定線性回歸關(guān)系。

1.6線性范圍及檢測限的確定 制備Fe3+標(biāo)準(zhǔn)溶液（1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.04、0.03、0.01μg／mL），分光光度法測定A425值，確定線性范圍及檢測限。

1.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗證 使用多功能酶標(biāo)儀測定波長425 nm 處不同F(xiàn)e3+含量（1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05μg／mL）A值，以A425進(jìn)行線性回歸，連續(xù)10 次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，統(tǒng)計A425、R2值，評價建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的成功率。

1.8方法的驗證

參照《中國藥典》三部（2020 版）9101 分析方法驗證指導(dǎo)原則對建立的方法進(jìn)行驗證。

1.8.1穩(wěn)定性 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后，每隔5 min 測定1次A425，連續(xù)測定8 次，計算變異系數(shù)（CV），驗證方法的穩(wěn)定性。

1.8.2準(zhǔn)確性和精密性 配制高（1 μg／mL）、中（0.5 μg／mL）、低（0.05 μg／mL）含量的Fe3+溶液，測定鐵離子含量，每個樣品平行測定9組，重復(fù)3次，計算回收率和CV，驗證方法的準(zhǔn)確性和精密性。

1.9干擾性試驗 根據(jù)DB 公司蛋白胨產(chǎn)品Poplypeptone 中Ca2+、Mg2+、K+、Na+離子含量配制4 種過量離子溶液，加入顯色劑后檢測A425值；分別檢測15 μL磺基水楊酸（20%）和50 μL 氫氧化氨（1∶1）的A425值，以WFI 為空白對照。4 種過量離子溶液各配制3組樣品，每組重復(fù)測定3次，判定干擾性試驗結(jié)果。

1.10白喉產(chǎn)毒培養(yǎng)基中總鐵含量及白喉毒素測定100 mL三角瓶中加入不同培養(yǎng)基（牛肉胰酶消化液、5%多聚蛋白胨），取樣，活性炭脫色后檢測鐵含量，按白喉生產(chǎn)規(guī)程，接種細(xì)菌，于恒溫箱中靜止培養(yǎng)72 h 后停止培養(yǎng)，觀察細(xì)菌生長情況，按照《中國藥典》三部（2020 版）通則3506 類毒素絮狀單位測定法檢測細(xì)菌產(chǎn)毒量。3個批次每批次測定3次。

1.11磺基水楊酸分光光度法與常用鐵含量檢測方法的比較 分別采用磺基水楊酸分光度法及常用方法亞鐵嗪比色法、鄰菲啰啉分光光度法檢測兩種培養(yǎng)基（牛肉胰酶消化液、5%多聚蛋白胨）中鐵含量，比較3種方法的檢測結(jié)果。

1.12統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用樣品均值t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。準(zhǔn)曲線方程為：Y= 0.027 9X+ 0.046 1，R2＞0.99，見圖3。

2 結(jié)果

2.1反應(yīng)物及鐵-磺基水楊酸絡(luò)合物光譜掃描 光譜掃描發(fā)現(xiàn)，鐵-磺基水楊酸絡(luò)合物在425 nm 處有特異紫外吸收峰，參與反應(yīng)物不對特異紫外吸收峰產(chǎn)生影響。見圖1。

圖1 反應(yīng)物及絡(luò)合物吸收光譜曲線Fig.1 Absorption spectrum curves of reactants and complex

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 Fe3+（100 ～0.01 μg／mL）與磺基水楊酸生成的絡(luò)合物與A425值呈直線回歸關(guān)系，見圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y= 0.027 9X+ 0.044，R2＞0.99。表明可通過檢測A425值測定Fe3+含量。

圖2 鐵-磺基水楊酸絡(luò)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.05 ～100μg／mL）Fig. 2 Standard curve of iron-sulfosalicylic acid complex（0.05 ～100μg／mL）

圖3 鐵-磺基水楊酸絡(luò)合物標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.05 ～1μg／mL）Fig. 3 Standard curve of iron-sulfosalicylic acid complex（0.05 ～1μg／mL）

選取符合白喉產(chǎn)毒培養(yǎng)基中鐵離子含量區(qū)間段進(jìn)行測定：Fe3+含量在1 ～0.05μg／mL之間，與磺基水楊酸生成的絡(luò)合物A425值呈直線回歸關(guān)系，標(biāo)

2.3鐵-磺基水楊酸絡(luò)合物的線性范圍及檢測限 試驗結(jié)果顯示，F(xiàn)e3+（1 ～0.05μg／mL）與磺基水楊酸生成的絡(luò)合物A425值從高到低，線性良好。但Fe3+含量低于0.05 μg／mL 后，A425值趨同于WFI（0.046 3），見圖4。綜合考慮確定利用鐵-磺基水楊酸絡(luò)合物的A425值測定鐵離子含量的線性范圍為1 ～0.05μg／mL，檢測限為0.05μg／mL。

圖4 鐵-磺基水楊酸絡(luò)合物吸光度值Fig.4 Absorbance values of iron-sulfosalicylic acid complex

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗證 驗證結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足以下條件時，試驗結(jié)果可靠：1μg／mL Fe3+標(biāo)準(zhǔn)品A425≥0.073；0.05 μg／mL Fe3+標(biāo)準(zhǔn)品A425≥0.047；標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＞0.99。連續(xù)10 次測定結(jié)果表明，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合條件，見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗證結(jié)果Tab.1 Verification results of standard curve

2.5方法的驗證

2.5.1穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后，每隔5 min 測定1 次A425值，A425值隨時間的增加有波動趨勢，但幅度較小，且各濃度標(biāo)準(zhǔn)品A425值的CV均小于5%，見表2。表明標(biāo)準(zhǔn)品顯色后40 min內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.2 Results of stability test

2.5.2準(zhǔn)確性和精密性 試驗結(jié)果顯示，低、中、高濃度Fe3+標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)測定3 次，每個濃度平行測定9組的CV均＜5%，回收率均＞95%，見表3。表明該方法準(zhǔn)確性較高，精密性良好。

表3 準(zhǔn)確性和精密性試驗結(jié)果Tab.3 Results of accuracy and precision test

2.6干擾性試驗 4 種過量離子溶液、15 μL 磺基水楊酸（20%）和50μL 氫氧化氨（1∶1）A425值均小于空白對照，不對檢測方法構(gòu)成干擾。見表4。

表4 干擾性試驗結(jié)果Tab.4 Results of disruptive test

2.7白喉產(chǎn)毒培養(yǎng)基中鐵含量及細(xì)菌產(chǎn)毒情況 牛肉胰酶消化液培養(yǎng)基中鐵含量平均值為0.09μg／mL，培養(yǎng)物檢測到毒素；而鐵含量較高的5%多聚蛋白胨培養(yǎng)基細(xì)菌能夠生長但不產(chǎn)毒。兩種培養(yǎng)基中鐵含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= -63. 694，P＜0.05）。見表5。

表5 白喉產(chǎn)毒培養(yǎng)基中鐵含量與細(xì)菌產(chǎn)毒統(tǒng)計Tab.5 Statistics of iron content in diphtheria toxin producing medium and bacterial toxin production

2.8磺基水楊酸分光光度法與常用鐵含量檢測方法的比較 3 種檢測方法結(jié)果一致，見表6。表明磺基水楊酸分光光度法可用于培養(yǎng)基中鐵含量檢測。

表6 不同方法的檢測結(jié)果Tab.6 Results of different detection methods

3 討論

本實驗對鐵-磺基水楊酸絡(luò)合物光譜掃描表明，該絡(luò)合物在425 nm處有最大特異紫外吸收峰，因此可通過檢測425 nm 處的吸光度值來測定鐵離子含量。根據(jù)適合白喉桿菌產(chǎn)毒條件的鐵離子含量，課題組研究了Fe3+濃度與鐵-磺基水楊酸絡(luò)合物A425值的關(guān)系，確定線性范圍為1 ～0.05 μg／mL，檢測限為0.05 μg／mL；參照《中國藥典》三部（2020 版）《分析方法驗證指導(dǎo)原則》對建立的磺基水楊酸分光光度法進(jìn)行了穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、精密性驗證，結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定性高、準(zhǔn)確性和精密性良好。實驗通過對自制及市售培養(yǎng)基中鐵含量的檢測及細(xì)菌產(chǎn)毒結(jié)果比較，得到與亞鐵嗪比色法及鄰菲啰啉分光光度法一致的檢測結(jié)果，驗證了在低鐵含量培養(yǎng)基中白喉桿菌可以產(chǎn)毒，但產(chǎn)毒量與鐵含量之間的關(guān)系仍值得探討。

《中國藥典》中鐵離子檢測方法有硫代硫酸鈉滴定法、分光度計比色法以及電感耦合等離子體質(zhì)譜法，但均存在一定的局限性。滴定法由人員進(jìn)行反應(yīng)終點(diǎn)判斷，不同人員操作存在誤差可能，且該方法操作繁瑣，不利于對多個樣品的檢測；傳統(tǒng)的分光度計比色法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但同樣存在操作繁瑣、檢驗量少、所需樣品量大等弊端；電感耦合等離子體質(zhì)譜法用于中藥樣品中多元素的同時測定，但由于投入成本高，不利于推廣。課題組使用96 孔板、多功能酶標(biāo)儀建立的磺基水楊酸分光光度法測定培養(yǎng)基中微量鐵含量，具有檢測速度快、操作簡便、樣品微量、一次可檢測多個樣品、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

終上所述，本實驗建立了磺基水楊酸分光光度法測定培養(yǎng)基中微量鐵含量，該方法快速簡便，經(jīng)初步方法學(xué)驗證表明，可用于白喉產(chǎn)毒培養(yǎng)基中鐵離子含量檢測。