郝曉甜，李克堅綜述，周誠，毛群穎審校

中國食品藥品檢定研究院，北京100050

手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）是一種由腸道病毒感染引起的常見傳染病，多發(fā)于5 歲以下嬰幼兒，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)皰疹為主要臨床特征［1-2］。HFMD 通過消化道、呼吸道及直接或間接接觸等方式傳播，多數(shù)患者表現(xiàn)為自限性臨床癥狀，少數(shù)患者會繼發(fā)肺水腫、心肌炎、腦膜炎等并發(fā)癥，嚴重時可導(dǎo)致死亡［3］。一般認為，HFMD主要由腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A 組16 型（Coxsackievirus A16，CVA16）引起［4］。但近年，柯薩奇病毒A組6型（Coxsackievirus A6，CVA6）在全球范圍內(nèi)引起多次HFMD 暴發(fā)或流行，CVA6逐漸成為全球多個國家和地區(qū)引起HFMD 的優(yōu)勢病原體［5-6］。CVA6導(dǎo)致的HFMD常引發(fā)一系列非典型臨床表現(xiàn)，即非典型手足口?。╝typical HFMD，aHFMD），患者皮疹分布范圍更廣泛，如軀干、臀部等部位，且會出現(xiàn)脫皮、脫甲等癥狀。本文就CVA6 的病原學(xué)、流行病學(xué)、感染后臨床癥狀、實驗室診斷及疫苗相關(guān)研究作一綜述，以期為CVA6 相關(guān)疾病的防控、診斷和治療提供依據(jù)。

1 病原學(xué)

CVA6 屬于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus），為單股正鏈RNA 病毒［7］。CVA6 基因組全長約7 400 bp，包含1 個開放閱讀框（open reading frame，ORF）和2 個非編碼區(qū)（5'UTR 和3'UTR）。ORF 編碼1 個多聚前體蛋白，可進一步水解為P1～P3 3 個前體蛋白。P1 編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP4），P2 和P3 編碼7 種非結(jié)構(gòu)蛋白（2A～2C和3A～3D）［8］。4 種結(jié)構(gòu)蛋白中，VP4 位于病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接，VP1、VP2、VP3 分布在病毒顆粒表面，包含了主要的抗原決定簇，其中，VP1 是識別、鑒定病毒的重要區(qū)域，可作為不同血清型分類的依據(jù)［5］。

2 流行病學(xué)

2.1流行概況

CVA6 原型株為Gdula 株，于1949 年在美國首次分離。2008 年前，CVA6 感染主要引起皰疹性咽峽炎［9］。自2008 年芬蘭首次報道了CVA6 感染引發(fā)HFMD 以來［10］，歐洲、美洲、亞洲均出現(xiàn)多次由CVA6引起的HFMD暴發(fā)或流行。

2.1.1歐洲 2010—2012年，西班牙發(fā)生多起HFMD暴發(fā)及散發(fā)流行，80 份HFMD 或非典型皮疹患者的臨床樣本中，柯薩奇病毒（Coxsackievirus，CV）陽性樣本為53 份，CVA6 陽性樣本占60.0%［11］。2014 及2015 年，法國暴發(fā)大規(guī)模HFMD 疫情，CVA6 陽性樣本分別占CV 陽性樣本的28.4%和53.9%［12］。2014年，英國愛丁堡報告1 起與CVA6 相關(guān)的aHFMD，共16例感染者［13］。

2.1.2美洲 2011—2012年，美國發(fā)生大規(guī)模HFMD流行，34份CV陽性臨床樣本中，CVA6陽性率為73.5%［14］。2011—2013 年，古巴發(fā)現(xiàn)35 例HFMD 患者，收集獲得11 份CV 陽性標本，其中9 份檢出CVA6，2 份檢出EVA71［15］。2015 年，阿根廷發(fā)現(xiàn)兩組由CVA6 感染引起的aHFMD病例（包括來自丘布特省的14例患者及來自圣路易斯省的12 例患者），這是阿根廷也是南美洲首次報告CVA6感染與aHFMD相關(guān)［16］。

2.1.3亞洲 2008 年，新加坡暴發(fā)了史上最大規(guī)模HFMD 疫情，共有29 686例感染者，收集的51份臨床標本中，CVA6和CVA10感染者共占35.3%［17］。2012年，泰國暴發(fā)大范圍HFMD，CVA6 陽性患者占HFMD 患者的32.9%［18］。2011—2015 年，越南3 家醫(yī)院收治的HFMD 患者中，CVA6 檢出率占23.0%［19］。1 項對日本大阪市HFMD 病原分析發(fā)現(xiàn)，2011 年，CVA6 開始成為主要病原體，2011、2013、2015 年CVA6 陽性檢出率分別為57.1%、42.9%、64.0%［20］。

近年，中國發(fā)生多起CVA6引起的HFMD暴發(fā)或流行。2013年，吉林省長春市暴發(fā)HFMD疫情，CVA6檢出率達66.9%［21］。2013—2017 年，天津市HFMD病例中，CVA6陽性率為29.6%，超過EVA71和CVA16，表明CVA6 已成為天津市HFMD 的優(yōu)勢病原體［22］。2011—2018年，上海市金山區(qū)采集HFMD 病例標本顯示，自2014 年起，CVA6 逐漸成為優(yōu)勢病原，2018年占病原學(xué)構(gòu)成的85.4%［23］。2017—2019年，廣東省HFMD 普通病例中，CVA6 感染率分別為57.1%、23.0%、47.4%［24］。另外，浙江、云南、黑龍江、新疆、福建及澳門等地均出現(xiàn)與CVA6 感染相關(guān)的HFMD疫情［25-30］。

2.2分子流行病學(xué) 目前，國際上對CVA6 的分型尚無統(tǒng)一標準，主要是利用VP1 區(qū)進行分型。ANH等［19］根據(jù)VP1 序列進行系統(tǒng)進化分析，將CVA6 分為A ～F 6 個基因型。SONG 等［31］對CVA6 中國毒株（807株）和國際毒株（19株）VP1序列進行分析，結(jié)果表明，CVA6 可分為A～D 4 個基因型，并可進一步細分為B1～B2、C1～C2 和D1～D3 亞型，其中D3 亞型是近年來中國大陸流行的主要型別。2009 — 2015年，HE 等［29］對廈門CVA6 毒株及與國內(nèi)外其他地區(qū)參考毒株VP1 序列進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果顯示，CVA6可分為4 種基因型（A～D），D型可分為D1～D5亞型，中國大陸以D5亞型為主。LIU等［32］通過對HFMD樣本獲得的101 個CVA6 VP1 全長序列及從NCBI 中獲取的200 個CVA6 VP1 序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果顯示，CVA6 同樣可分為A～D 4 個基因型，B 型分為B1 和B2 亞型，D 型分為D1～D3 亞型，2008 年后，全球范圍流行株主要為D3亞型。

3 臨床癥狀

CVA6 感染兒童的臨床癥狀多表現(xiàn)皰疹性咽峽炎和HFMD。另外，CVA6 感染可引起濕疹惡化、水痘-帶狀皰疹、附睪炎等癥狀［33］。在某些情況下，CVA6 感染也可導(dǎo)致重癥腦膜炎和腦炎。與EVA71和CVA16 不同，CVA6 不僅容易感染兒童，免疫功能正常的成年人也有較高的感染率，且多表現(xiàn)為aHFMD［34］。以色列報道5 例感染CVA6 的成年病例均出現(xiàn)發(fā)熱和嚴重的血管炎樣皮疹等癥狀［35］。意大利10 例成年人因接觸患兒感染CVA6 導(dǎo)致HFMD，其中1 例患者出現(xiàn)脫甲癥和附睪炎［36］。另外，美國報道1例65歲成人感染CVA6引起急性心肌炎［37］。

4 實驗室診斷

4.1診斷方法

4.1.1病毒分離培養(yǎng) 病毒分離培養(yǎng)是病毒感染性疾病診斷的金標準，通常采用傳統(tǒng)的細胞病變法進行。2008 年，新加坡學(xué)者將HFMD 患者標本接種至人橫紋肌肉瘤細胞，獲得了CVA6 陽性分離株［17］。但該方法費時、耗力，且與EVA71和CVA16相比，CVA6在培養(yǎng)細胞中生長較差，該方法較難分離出CVA6，不適合臨床的快速檢測［38］。

4.1.2血清學(xué)檢測 血清學(xué)檢測是CV 診斷的常規(guī)方法，主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和中和抗體試驗。ELISA法主要用于檢測病毒的抗原和抗體，通常采用患者急性期和恢復(fù)期血清的滴度來判斷，抗體滴度升高大于4 倍時，證明病毒感染［39］。中和抗體試驗是將健康人或患者血清與CV 標準株中和，測定抗體水平，但抗體中和時間較長。有研究表明，假病毒中和抗體檢測方法具有安全、高效、高靈敏度等優(yōu)點，適用于高通量的中和抗體檢測試驗，可用于CVA6疫苗效價的評估和流行病學(xué)監(jiān)測［40-41］。

4.1.3分子生物學(xué)檢測 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）具有簡單、快速、特異性強等特點，已成為CV 診斷的重要手段。有研究建立了一種可同時檢測CVA6和CVA10兩種病原體的雙重RT-PCR 法，該方法具有簡單、快速、高效的特點，有望應(yīng)用于常規(guī)的實驗室診斷［42］。另外，基因芯片技術(shù)和高通量測序技術(shù)作為新的病原學(xué)檢測手段，具有較高的靈敏度，也可用于CVA6診斷，但檢測成本較高［43-44］。

4.2診斷試劑 國內(nèi)市場上CVA6 診斷試劑主要為核酸檢測試劑。目前，共有6 家CVA6 核酸檢測試劑生產(chǎn)企業(yè)已完成注冊，均為PCR-熒光探針法，其中1家生產(chǎn)CVA6核酸檢測試劑盒，4家生產(chǎn)CVA6／CVA10型核酸檢測試劑盒，另外1家生產(chǎn)CV通用型、EVA71和CVA16 型／10 型／6 型核酸檢測試劑盒［45］。另外，還有多家企業(yè)處于產(chǎn)品研發(fā)階段。由于尚無CVA6國際標準物質(zhì)及國家標準物質(zhì)，以上企業(yè)均采用企業(yè)參考品進行性能驗證。中國食品藥品檢定研究院先后研制了EVA71 和CVA16 核酸檢測試劑國家參考品，用于相關(guān)試劑的質(zhì)量控制和評價。因此，亟需研制CVA6 核酸檢測試劑國家參考品，用于CVA6、CVA6／CVA10 型及CV 通用型核酸檢測試劑盒中CVA6項目的檢驗。

5 疫苗相關(guān)研究

疫苗是預(yù)防傳染病的最重要措施之一，目前尚無針對CVA6 引起HFMD 疫苗上市的報道［46］。因此，研發(fā)疫苗是預(yù)防和控制CVA6感染的重要途徑之一。

5.1動物模型 動物模型是疫苗有效性評價的重要工具，建立一個可穩(wěn)定呈現(xiàn)人類臨床癥狀甚至可導(dǎo)致死亡的動物模型可極大促進疫苗的研發(fā)及應(yīng)用［47］。目前，用于CV 疫苗評價的動物模型大多采用小鼠模型。YANG 等［48］利用CVA6／141 毒株攻擊1 日齡BALB／c乳鼠，乳鼠出現(xiàn)了消瘦、后肢癱瘓甚至死亡等臨床癥狀，病理檢查顯示，CVA6 對骨骼肌和皮膚有特殊的趨向性，CVA6對皮膚的強烈趨向性與嬰兒的臨床特征相近。ZHANG等［49］用CVA6／WF057R毒株感染5 日齡ICR 乳鼠，乳鼠出現(xiàn)體重減輕、四肢癱瘓等癥狀。WU 等［50］選擇4 周齡BALB／c 小鼠建立了可視化假病毒感染模型，可直接通過活體成像觀察病毒的分布情況及評價疫苗免疫效果。綜上所述，動物模型將為未來研究CVA6疫苗提供有利工具。

5.2疫苗研究 目前，針對CVA6 疫苗的研究主要包括滅活疫苗和病毒樣顆粒（virus-likeparticles，VLPs）疫苗。由于HFMD 主要致病血清型的不斷變化，對HFMD 疫苗提出新的需求，研制高效的多價HFMD疫苗受到廣泛關(guān)注［51］。

ZHANG等［52］研究證實，經(jīng)皮下注射CVA6／CVA10二價全病毒滅活疫苗可使新生小鼠出現(xiàn)抗原特異性的全身免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)主動免疫。LIM 等［53］使用不同滅活方法制備了CVA6／CVA10／CVA16 三價滅活疫苗，并進行了免疫原性評價，結(jié)果表明，CV多價疫苗可作為HFMD 候選疫苗。SHEN 等［54］利用共表達CVA6 P1和3CD 的桿狀病毒感染昆蟲細胞制備了CVA6 重組VLPs 疫苗，該疫苗免疫小鼠后能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價抗體，可保護小鼠免受CVA6 的感染。在此基礎(chǔ)上，該團隊還構(gòu)建了EV71／CVA16／CVA6／CVA10 四價VLPs 疫苗，該疫苗免疫小鼠后的免疫血清可對4 種病毒的單一或混合感染提供有效的保護作用，表明四價VLPs 疫苗是一種有前景的廣譜HFMD候選疫苗［55］。

6 小結(jié)與展望

CVA6已成為引發(fā)HFMD 的主要病原體之一，易導(dǎo)致嬰幼兒及成人HFMD 的流行，對HFMD 的防控提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。目前針對CVA6 感染的抗病毒藥物及疫苗的相關(guān)基礎(chǔ)研究較少［56］。因此，應(yīng)加強對HFMD病原學(xué)監(jiān)測，關(guān)注CVA6致病性和流行病學(xué)特征，并盡快研制CVA6診斷試劑用國家標準物質(zhì)及開展CVA6 疫苗和藥物的研發(fā)，為CVA6 相關(guān)疾病的防控、診斷和治療提供保障。