崔靖，王靖宇，韋薇

國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京100022

近年來嵌合抗原受體T 細胞（chimericantigen receptor T-cell，CAR-T）產(chǎn)品在腫瘤治療領域呈現(xiàn)較突出的優(yōu)勢，且已經(jīng)成為細胞和基因治療領域商業(yè)化進展較為快速的一類產(chǎn)品。截至2023 年7 月，全球共有9個CAR-T產(chǎn)品獲批上市，其中國外批準上市的6個CAR-T產(chǎn)品包括：NovartisPharmaceuticals Corporation 的Kymriah［1］、Kite Pharma 的Yescarta［1］、Kite Pharma的Tecartus［1］、Bristol-Myers Squibb Company的Breyanzi［1］、Celgene Corporation／Bristol-Myers Squibb Company 的Abecma［1］、傳奇生物的Carvykti［2］。國內(nèi)批準上市的3 個CAR-T 產(chǎn)品包括：復星凱特生物科技有限公司的阿基侖賽注射液（奕凱達）［3］、藥明巨諾生物科技有限公司的瑞基奧侖賽注射液（倍諾達）［4］、南京馴鹿生物醫(yī)藥有限公司的伊基奧侖賽注射液（福可蘇）。另外，國內(nèi)目前還有多個CAR-T 產(chǎn)品在上市審評中。

CAR-T 是不同于傳統(tǒng)小分子和成熟生物制品的一類個體化細胞治療產(chǎn)品，有效成分為經(jīng)過體外基因修飾／編輯的活細胞，其生產(chǎn)工藝較復雜，生產(chǎn)設備自動化水平有限，生產(chǎn)過程中諸多環(huán)節(jié)可能存在微生物污染的風險，且其無法采用終端滅菌或除菌過濾實現(xiàn)無菌保障。目前CAR-T產(chǎn)品的微生物安全主要通過對生產(chǎn)用原材料的檢測和控制、生產(chǎn)過程嚴格按照《生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》相關要求以及對工藝中間體和／或終產(chǎn)品進行微生物檢測予以保證。無菌檢查作為微生物安全的一個質(zhì)量項目，對于確保產(chǎn)品安全性至關重要，因此有必要開展全面研究和檢測。目前《中國藥典》三部（2020 版）“1101 無菌檢查法”規(guī)定的無菌檢測方法有薄膜過濾法和直接接種法兩種，檢測周期通常需14 d，且對檢驗取樣量有一定要求，但由于CAR-T產(chǎn)品批量較小，且大部分產(chǎn)品作為新鮮制劑供人體使用，采用傳統(tǒng)的藥典方法可能存在一定局限性。因此越來越多的產(chǎn)品采用無菌快速放行檢測方法用于工藝中間體和／或終產(chǎn)品檢測，但采用快速檢查法是否能與藥典方法具有相同的靈敏度是監(jiān)管機構非常關注的問題。

本文簡述了中國、美國、歐洲監(jiān)管機構對無菌快速檢查法的要求，并基于個人理解分析了不同監(jiān)管機構對于無菌快速檢查法相關要求的差異。同時結合個人審評實踐總結了無菌快速檢查法用于CAR-T產(chǎn)品工藝中間體和／或終產(chǎn)品檢測的常見問題，結合審評思考提出一般性技術要求，以供研發(fā)者借鑒及參考。

1 國內(nèi)外監(jiān)管技術要求

《中國藥典》三部（2020 版）“1101 無菌檢查法”、《美國藥典》“71 sterility tests”和《歐洲藥典》“2.6.1 sterility”均對基于培養(yǎng)法的無菌檢測方法提出了相應的技術要求，從選擇方法、供試品檢驗量及結果判定時間方面未見明顯差異［5-7］。但考慮到CAR-T 產(chǎn)品的特殊性，比如有效期短、批量小、臨床使用急迫性等，采用以上檢測方法可能具有一定局限性，因此國內(nèi)外監(jiān)管機構陸續(xù)更新了一些新的指南。以下將針對不同監(jiān)管機構目前在征求意見或已試行的指南情況和具體技術要求進行闡述［8-14］。不同監(jiān)管機構的技術指南情況見表1。

表1 不同監(jiān)管機構技術指南

2021 年10 月國家藥典委員會公示了《中國細胞類制品微生物檢查法草案》，2022 年12 月國家藥典委員會再次針對《細胞類制品微生物檢查指導原則草案》（以下簡稱草案）對外公開征求意見。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，兩輪意見針對基于呼吸信號法的技術要求基本一致，內(nèi)容方面增加了關于細胞類制品定義、無菌快速替代方法必要性以及不同原理檢測方法的簡單概述，另外將原公示稿中細胞類制品微生物檢查風險評估內(nèi)容進行調(diào)整，并納入到一般原則中，并且還增加了檢驗環(huán)境的要求以及制品出現(xiàn)污染菌、結果爭議時的處理原則等［8-9］。另外，原公示稿與草案在供試品檢驗量的要求上略有差異，原公示稿要求取樣量為接入每種培養(yǎng)基的最少量應按照總體積的1%取樣，按照要求應至少有2 種適宜培養(yǎng)基用于檢測真菌、需氧菌和厭氧菌，但草案關于供試品檢測量要求進行了修改，要求按照總體積的1%取樣，分別接種至需氧培養(yǎng)基和厭氧培養(yǎng)基。

雖然目前草案尚未正式實施，但其技術要求為CAR-T 產(chǎn)品的無菌快速放行提供了一定依據(jù)。首先，從供試品選擇和檢驗量上提出要求，供試品應能代表細胞產(chǎn)品的所有組分，并從成品中取樣，如果成品取樣不適用情況下可采用替代取樣，如選擇在處理細胞最后接觸的液體中取樣，并且采用本法進行生產(chǎn)過程的中間質(zhì)控時需從相應質(zhì)控點取樣。該草案明確提出供試品的檢驗量應不低于表2，不同于傳統(tǒng)的無菌檢測方法取樣量的要求，該取樣量降低了終產(chǎn)品的消耗。其次，該草案對培養(yǎng)基選擇、方法適用性試驗（樣品批次、重復試驗數(shù)量、菌種及菌液制備）、接種培養(yǎng)、結果判斷等均進行了詳細的要求。第三，該草案明確指出，采用快速微生物檢查法應按照《9201 藥品微生物檢驗替代方法驗證指導》（以下簡稱＜9201＞）［10］進行方法學驗證，并在應用于具體品種前進行方法適用性試驗，用以考察方法是否適用于該制品的檢查。而且，該草案明確指出，采用本指導原則所述的呼吸信號法時，可直接進行方法適用性試驗。根據(jù)＜9201＞要求，目前將微生物檢驗替代方法分成2 類，包括定性和定量試驗，并明確了定性和定量試驗的驗證項目和驗證要求。

表2 供試品的最少檢測量

＜1071＞對于有效期短或需要立即使用的產(chǎn)品的無菌快速方法提出了一般性技術要求［11］，其適用產(chǎn)品類型包括復合無菌制劑、正電子發(fā)射斷層掃描產(chǎn)品以及細胞和基因治療產(chǎn)品等。該指南主要是針對無菌快速放行檢測方法基于風險控制的理念進行闡述，同時概述了目前不同原理的無菌快速檢查法，如ATP 生物發(fā)光、流式細胞術、核酸擴增技術、呼吸、固相細胞術等方法原理、檢測靈敏度、檢測時間等。該指南未對采用無菌快速檢查法時的取樣量、方法驗證提出具體要求，但對于取樣量的要求引用了＜2.6.27＞的相關要求。＜1223＞是針對替代微生物檢測方法驗證要求的技術指南［12］，其從微生物檢測儀器設備要求、替代方法的驗證要求以及方法適用性均提出了較為廣泛和充分的建議。

＜2.6.27＞是針對有效期短、批量小，采用傳統(tǒng)的無菌檢測方法無法滿足放行檢測要求的細胞類產(chǎn)品無菌檢測制定的技術指南［13］，但不適用于人血或人血液制品的微生物檢查。該指南對檢測樣品的選擇、檢驗量、檢測方法驗證等提出了相應建議。檢測樣品選擇應來自終產(chǎn)品且必須能代表制品的所有成分，當不能實現(xiàn)時，需進行替代品測試，如與被處理細胞持續(xù)接觸的液體，但應證明替代物的代表性。檢驗量的要求見表2。另外，指南中對于基于微生物生長的自動化檢查方法的驗證內(nèi)容提出了較為詳細的建議，如促生長試驗的要求，方法適用性要求，供試品檢驗量要求，結果判定等。＜2.6.27＞同時也對于基于非生長的替代方法進行了簡單列舉，并指出替代方法驗證的要求可參考＜5.1.6＞。＜5.1.6＞詳細闡述了不同的替代檢測方法的原理、方法優(yōu)缺點以及驗證的要求［14］，常見方法分為3 類，基于微生物生長的測定方法（如電化學法、氣體消耗和產(chǎn)生的測量、生物發(fā)光法、比濁法、選擇性和／或指示性培養(yǎng)基法）、直接測定法（如固相細胞術、流式細胞儀法、直接熒光過濾技術、自身熒光法）、細胞成分分析（如根據(jù)微生物表型和基因型特點開發(fā)的方法）。方法驗證方面針對定性和定量方法的驗證項目提出了要求。

綜合以上指南情況，各國監(jiān)管機構對無菌快速檢查法適用的范圍要求基本一致，均是針對有效期短、批量小，采用傳統(tǒng)藥典方法無法在使用前滿足放行檢測要求的產(chǎn)品。供試品的檢驗量方面，草案和＜2.6.27＞均予以明確，但＜1071＞未提出具體要求，該指南中引用了＜2.6.27＞取樣量的要求。綜合以上情況認為，目前各國監(jiān)管機構關于無菌快速檢查法要求的檢測量基本保持一致。檢測方法方面，草案和＜2.6.27＞均提出了較為詳細的要求，如檢測樣品、重復試驗次數(shù)、陽性菌選擇、接種量、結果判定標準，但＜1071＞僅列舉了幾種方法的原理和優(yōu)缺點等，未提出具體的檢測要求。另外，草案相比＜2.6.27＞在培養(yǎng)基的適用性確認方面選擇的陽性菌種類不完全一致，草案中針對需氧菌種類相比＜2.6.27＞增加了大腸埃希菌，其他陽性菌要求基本一致。微生物檢測替代方法驗證方面，各國監(jiān)管機構均是針對定性和定量方法的驗證項目提出了相應的要求，雖然在驗證項目的要求上略有不同，內(nèi)容詳略程度略有不同，但整體理念未見較大差異。

2 存在問題和基本考慮

CAR-T 產(chǎn)品的微生物控制主要通過對生產(chǎn)用原材料的檢測和控制、生產(chǎn)過程檢測和／或終產(chǎn)品放行檢測，以及按照《生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》相關要求進行生產(chǎn)等一系列控制措施予以保障。我們在這類產(chǎn)品審評中發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)過程檢測和／或終產(chǎn)品放行檢測的無菌檢查存在諸多問題，以下針對目前存在的一些共性問題及基本考慮進行闡述。

2.1檢測樣品選擇 CAR-T 生產(chǎn)過程比較復雜，通常包括單采血采集、T細胞分選和激活、病毒轉導、細胞培養(yǎng)和擴增、細胞收獲及制劑制備等一系列操作，且CAR-T 細胞產(chǎn)品的有效成份為活細胞，產(chǎn)品為無菌制劑但不能采用終端滅菌工藝及除菌過濾工藝，因此采用過程控制和終產(chǎn)品放行檢測相結合的控制策略對確保這類產(chǎn)品的微生物安全性至關重要。

目前普遍存在的問題是僅在最終CAR-T產(chǎn)品階段進行無菌檢測，生產(chǎn)工藝過程中缺少必要的無菌檢測和控制?？紤]到CAR-T 產(chǎn)品的特殊性，僅采用終產(chǎn)品進行無菌檢測可能存在一定風險，一方面，CAR-T 產(chǎn)品生產(chǎn)中可能使用動物／人源性材料，且產(chǎn)品本身屬于活細胞，其生產(chǎn)過程微生物污染的風險相對較高，因此單純的采用終點無菌檢測放行的控制策略可能存在一定風險；另一方面，由于CAR-T終產(chǎn)品難以采用傳統(tǒng)藥典方法獲得檢測結果后再用于臨床受試者，通常需采用經(jīng)過驗證的無菌快速檢查法，但由于無菌快速檢查法的成熟程度比較有限，因此為了確保臨床使用樣品的安全性，建議除了對原材料進行嚴格的審核和基于風險制定合理的企業(yè)內(nèi)控標準外，還需在CAR-T 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝過程中進行取樣和檢測，取樣點的設定需要根據(jù)工藝特點及工藝驗證的結果確定。通常情況下，應結合起始物料的來源和微生物控制情況、生產(chǎn)工藝的自動化水平和密閉操作情況、細胞培養(yǎng)工藝復雜程度和培養(yǎng)時間、其他與生產(chǎn)或物料相關的因素進行風險評估，選擇適宜的工藝中間體進行無菌檢測，基于常規(guī)的CAR-T 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝建議在如下階段考慮進行無菌檢測，如單采血階段、外周血單個核細胞復蘇階段、細胞收獲液階段（如適用）和／或終產(chǎn)品階段進行無菌檢測。

2.2無菌快速檢測方法驗證 目前大部分的CAR-T

產(chǎn)品的無菌快速檢測方法主要是基于微生物生長原理的方法，其中檢測微生物呼吸信號的方法較為常見，如BacT／ALERT 30 全自動微生物檢測系統(tǒng)，該方法通常作為微生物檢測的定性方法，在使用該方法前需進行驗證，以確保無菌快速檢查法的效果優(yōu)于或等同于藥典方法。驗證項目的選擇可參照＜9201＞關于定性和定量方法的一般驗證要求，通常情況下定性方法驗證項目包括專屬性、檢測限、重現(xiàn)性和耐用性等。

目前在無菌快速驗證方法中存在的問題包括以下幾個方面：①方法驗證項目不全面；②方法檢測限驗證中陽性菌種類不全，或加入陽性菌的濃度未進行充分研究和驗證，直接采用某一特定濃度陽性菌進行試驗并作為方法的檢測限；③方法中未設置合理的陰性對照；④無菌快速方法驗證時未與藥典方法進行等效性對比等。針對以上問題，方法學驗證項目的不完善可能無法證明替代方法的可行性，從而導致檢測結果的可信性受影響，建議參照＜9201＞對定性和定量試驗方法驗證項目和驗證目的的要求開展規(guī)范的驗證，同時也可參考＜1223＞和＜5.1.6＞相關要求。如針對定性方法的專屬性驗證一方面需要開展培養(yǎng)基的促生長試驗以確保培養(yǎng)瓶中加入的培養(yǎng)基適宜與微生物生長；另一方面還需考慮供試品對檢測結果的干擾作用（微生物的生長抑制）。檢測限驗證方面僅采用1 個較高濃度的試驗菌進行驗證很難反映出替代方法的檢測靈敏度，更無法證明替代方法與藥典方法等效或優(yōu)于藥典方法，一般情況下，根據(jù)實驗確定接種量并采用較低濃度的試驗菌接種，然后分別采用藥典方法和替代方法對試驗菌進行檢驗，以證明替代方法檢測限不大于藥典方法檢測限。雖然草案提出采用指導原則中呼吸信號法進行無菌檢測時，可直接進行方法適用性試驗，但由于該草案尚未正式實施，因此目前階段仍建議進行替代方法和藥典方法的等效性對比。目前＜9201＞和＜5.1.6＞中雖然提及可采用較低濃度的試驗菌如每單位不超過5 CFU 進行檢測限的驗證，但該數(shù)值并不是一個固定的驗證限度值，還需結合方法的檢測靈敏度以及微生物生長特性情況予以綜合考慮。另外，檢測限驗證試驗需考慮采用足夠數(shù)量的獨立試驗和重復次數(shù)以證明方法的可靠性。方法驗證試驗中應設置合理的陽性對照、陰性對照，陽性對照的選擇種類和加入量可參照《中國藥典》和／或草案相關要求，陰性對照可考慮采用培養(yǎng)基、凍存液、稀釋液等。等效性驗證在＜1223＞和＜5.1.6＞均有提及，雖然＜9201＞中未作為1 個驗證項目單獨列出，但在檢測限和重現(xiàn)性驗證項目中明確提出需采用統(tǒng)計學方法評價兩種方法是否存在差異。因此，在開展無菌快速檢測方法驗證時，需特別關注藥典方法和替代方法的等效性對比，確保替代方法檢測能力不低于或優(yōu)于藥典方法；另外，還需開展多次重復試驗以確保獲得的試驗結果滿足統(tǒng)計學要求。

3 技術要求

無菌快速檢查法的應用為CAR-T產(chǎn)品的快速放行提供了便利，但在其廣泛應用的同時也帶來了監(jiān)管方面的擔憂，一方面是由于整個工藝過程控制和／或終產(chǎn)品放行僅采用無菌快速檢測法進行檢測和控制，而缺少基于整體風險的控制策略，如未進行留樣并增加藥典方法的復核，未結合工藝特點和產(chǎn)品特點充分評估無菌檢測策略的全面性和完整性；另一方面，不同原理的替代方法可能均存在一定局限性，且在未開展充分和全面的方法驗證時直接作為藥典方法的替代可能存在一定安全性風險。因此為確保受試者安全性，建議在可行的情況下，首選藥典方法用于無菌檢查，但考慮到CAR-T細胞產(chǎn)品的特殊性，也鼓勵研究者開發(fā)快速無菌檢查法作為中間過程監(jiān)測或放行檢測方法，且在開展臨床試驗前按照《中國藥典》要求以及參考其他監(jiān)管機構要求對無菌快速檢查法進行充分驗證／確認?？焖贌o菌檢查法在完成替代方法學驗證后，可采用該方法進行產(chǎn)品檢驗，但仍建議同步實施藥典方法檢測，持續(xù)積累數(shù)據(jù)。同時一旦發(fā)現(xiàn)藥典方法和快速無菌檢查法檢驗結果不一致時，應對檢驗過程予以充分的調(diào)查，分析造成無菌檢查結果不一致的原因，以藥典檢測結果作為最終判定依據(jù)。同時針對結果不一致的情況，還需鑒定檢驗過程中發(fā)現(xiàn)的污染微生物種類，并建立相應的控制策略。而且在臨床使用時做好微生物污染的臨床應急處理方案，一旦出現(xiàn)無菌檢測陽性結果，建議及時通知臨床醫(yī)生進行后續(xù)應急處理和治療。

4 結語

無菌檢查是CAR-T產(chǎn)品質(zhì)量控制項目中非常重要的安全性控制指標，越來越多的基于不同原理的替代方法在該類產(chǎn)品的檢測中得到應用。雖然不同國家監(jiān)管機構為替代方法的應用和驗證要求提出了一些要求，但由于這些替代方法通常依賴于供應商提供的自動化的儀器設備，且目前沒有一種國際上公認的可替代傳統(tǒng)的無菌檢測方法的無菌快速檢查法。因此，采用替代方法用于無菌檢測時，建議申請人按照《中國藥典》和國際相關指南的要求規(guī)范開展替代方法的驗證，在前期研究階段采用藥典方法和替代方法進行并行檢測，持續(xù)積累兩種方法檢測一致性的數(shù)據(jù)。另外，希望申請人加強與監(jiān)管機構的溝通，在采用新型的替代方法用于無菌檢查時，需提供充分的研究數(shù)據(jù)和資料，以確保替代方法的可靠性和準確性。