李嫚琪，魏麗萍，李英奇，陶巧玉，許瀚林，3，何偉偉，湯納平，汪溪潔 綜述，王慶利，常艷 審校

1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230012；3.上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 201620；4.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京100022

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）指由細(xì)胞主動釋放到細(xì)胞外環(huán)境的，選擇性包裹蛋白質(zhì)、DNA片段、RNA、脂質(zhì)和代謝物等各種分子的脂質(zhì)雙層囊泡［1］。EV 不含功能核，不能增殖和分化［2］。根據(jù)其生物發(fā)生機(jī)制、大小和生物物理學(xué)特性的不同，EV可大致分為3 類：外泌體（exosomes）、微囊泡（microvesicles，MV）、凋亡小體（apoptotic bodies，AB），目前絕大多數(shù)研究為外泌體相關(guān)研究。EV 在生理和病理過程中的功能取決于其與受體細(xì)胞相互作用以傳遞其蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA 等內(nèi)容物的能力［3］。EV 表面蛋白信號分子可識別并靶向受體細(xì)胞，一旦連接上靶細(xì)胞，可通過受體-配體相互作用誘導(dǎo)信號傳遞，或通過胞吞作用內(nèi)化，也可直接與靶細(xì)胞的膜融合，將其內(nèi)容物傳遞至靶細(xì)胞的胞漿中［4］。當(dāng)EV 內(nèi)容物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即可通過信使RNA（messenger RNA，mRNA）的翻譯、微小RNA（microRNA，miRNA）的基因沉默及生物活性脂質(zhì)的作用引發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)及表觀遺傳學(xué)的改變［5］，從而改變受體細(xì)胞的生理狀態(tài)。EV 最初僅被視為細(xì)胞向外分泌的廢棄物，但近年來，研究者發(fā)現(xiàn)，EV 作為細(xì)胞間重要的運載體，是細(xì)胞間通訊的重要方式［6］，可作為一種無細(xì)胞治療手段進(jìn)行臨床治療，同時還具有作為天然藥物遞送載體的潛在能力。本文就基于EV 療法的研發(fā)概況、特點，監(jiān)管要求及非臨床評價策略作一綜述。

1 基于EV療法的研發(fā)概況

近10年來，EV相關(guān)的各項研究大量涌現(xiàn)。目前尚無獲得批準(zhǔn)的基于EV 治療的上市藥物，但已有較多產(chǎn)品進(jìn)入臨床研究階段。截至2022 年3 月，clinicaltrials.gov 平臺中有34 項EV 作為治療藥物的臨床試驗，有10 項EV 作為載體的臨床試驗。截至2022年5 月，clinicaltrials.gov 平臺（https：／／clinicaltrials.gov）中EV 作為治療藥物的臨床試驗見表1，EV 作為載體的臨床試驗見表2。其中適應(yīng)證涉及炎癥、癌癥、眼部疾病和呼吸系統(tǒng)疾病等多個領(lǐng)域，EV 的來源多為間充質(zhì)干細(xì)胞，也有少數(shù)來源為腫瘤細(xì)胞，給藥方式多為局部用藥，系統(tǒng)用藥相對較少。

表1 EV作為治療藥物的臨床試驗Tab.1 Clinical trials of EV as therapeutic drugs

表2 EV作為載體的臨床試驗Tab.2 Clinical trials of EV as vectors

1.1EV 作為治療藥物 內(nèi)源性釋放的EV 可參與許多病理和生理學(xué)過程，在免疫調(diào)節(jié)和組織再生中具有重要作用［7］，其本身就具有治療潛力。其中應(yīng)用最廣泛是來自間充質(zhì)干細(xì)胞的EV，已有大量基礎(chǔ)實驗證明，EV 在軟骨、骨、皮膚、血管、味蕾、神經(jīng)組織、牙、骨骼肌、心肌、肝、腎和肺等組織再生方面具有巨大的應(yīng)用潛能。此外，免疫細(xì)胞分泌的EV 可通過促進(jìn)調(diào)節(jié)反應(yīng)或調(diào)節(jié)周圍細(xì)胞，減少炎癥來直接控制外周免疫功能［8］。EV 還能抑制自身免疫。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cell，Treg）的主要功能是通過促進(jìn)免疫系統(tǒng)的自我耐受來預(yù)防自身免疫，Treg 利用EV 抑制其他免疫細(xì)胞的活性。有研究表明，Treg 衍生的EV 包含多個miRNA 和miRNA 前體［9-11］，樹突狀細(xì)胞攝取含有miR-142-3p 和miR-150-5p 的EV 會導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6 表達(dá)降低，并導(dǎo)致免疫抑制性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10 表達(dá)升高［9］。這些miRNA 干擾樹突狀細(xì)胞中的抗原加工和呈遞，從而抑制了免疫激活［8］。自COVID-19疫情暴發(fā)以來，EV也為治療COVID-19提供了新的思路。

1.2EV 作為藥物載體 EV 作為介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的媒介，可被用作有效遞送載體，裝載基因類、蛋白類和小分子藥物等，已成為目前最為關(guān)注的EV 研究方向。目前研究多集中于EV 包載RNA 或小分子藥物的抗腫瘤研究。EV的生化特性可用于靶向遞送藥物至某些細(xì)胞群［12］，實現(xiàn)選擇性遞送，由于EV是由細(xì)胞產(chǎn)生的，具有跨膜蛋白和表面受體等特異性蛋白，可避免或促進(jìn)靶細(xì)胞的識別和相互作用。EV的裝載方式分為主動裝載和被動裝載兩種。主動裝載包括：電穿孔、化學(xué)轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染EV 或轉(zhuǎn)染EV 親本細(xì)胞）、物理轉(zhuǎn)染（超聲法、擠出法、反復(fù)凍融法）、點擊化學(xué)；被動裝載指孵育（EV 或EV 的親本細(xì)胞與藥物孵育）。不同細(xì)胞來源的EV 成分不同，其潛在的生物功能也有較大差異：腫瘤細(xì)胞分泌的EV 作為藥物載體時，可較好地歸巢至腫瘤部位；巨噬細(xì)胞分泌的EV 具有良好的炎癥趨向作用，且可跨越血腦屏障用于腦部疾病的治療；樹突狀細(xì)胞分泌的EV 則具有良好的免疫效應(yīng)。此外，EV與核酸分子有更好的親和性，能顯著提高包封效率。EV 結(jié)構(gòu)具有可改造性，膜修飾方式多樣，如基因修飾EV 表面功能化蛋白，增強靶向性，提高EV遞送效率。EV還可與病毒載體結(jié)合使用，如外泌體與腺相關(guān)病毒（adeno-associa-ted virus，AAV）雜交可顯著降低免疫原性［12］。天然EV進(jìn)行工程改造可提高質(zhì)粒的效率和容量，如外泌體與脂質(zhì)體雜交可包裹和遞送CRISPR-Cas9，并減輕脂質(zhì)體的毒性［13］。大多數(shù)注射的EV會優(yōu)先聚集在肝、腎和脾，被迅速清除，從而限制了外源性EV在靶組織中的濃度［14］。有研究通過基因修飾或結(jié)合靶向配體、抗體、刺激因子或免疫逃逸因子進(jìn)行EV改造［15-16］，如在EV表面修飾能與腫瘤組織特異性結(jié)合的多肽，增加抗腫瘤藥物的運送效率和療效。同時，藥物在EV 內(nèi)的運輸可產(chǎn)生不同于游離藥物的藥理學(xué)特征，保護(hù)傳統(tǒng)藥物免受腫瘤微環(huán)境的影響，從而增強藥效和改變脫靶效應(yīng)。

2 基于EV療法的研發(fā)特點

2.1基于EV 療法的優(yōu)勢 EV 來源廣泛，無生命但具有生物活性，由于其生物相容性、穩(wěn)定性、靶向性、歸巢性和可擴(kuò)展性［8］，并且可反映細(xì)胞起源，是藥物開發(fā)和遞送的理想候選者。

相比于傳統(tǒng)藥物治療和細(xì)胞治療，EV 作為一種無細(xì)胞療法具有獨特的優(yōu)勢。EV 富含黏附分子和信號分子，能夠識別靶細(xì)胞并刺激攝取，比游離型藥物具有更強的細(xì)胞靶向性和攝取性［17］。與更易被免疫清除的游離型藥物和細(xì)胞療法相比，跨膜CD47的存在允許EV 通過CD47-Sirpα 發(fā)出“不要吃我”的信號來避免免疫排斥反應(yīng)［18］，有助于延長EV在體內(nèi)的循環(huán)時間，延長半衰期［8］。EV的膜結(jié)構(gòu)可提供保護(hù)，防止其被分子組成中的酶和非酶物質(zhì)降解。此外，與細(xì)胞療法相比，EV 比親本細(xì)胞更小、更簡單、更穩(wěn)定，相對容易修改和制造，來源豐富且產(chǎn)量高，能夠適應(yīng)專業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)，比細(xì)胞更適合長期儲存，功能損失較小。有研究表明，給因?qū)嶒炐孕呐K病發(fā)作而導(dǎo)致心肌受損的幼年豬注射人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）產(chǎn)生的心臟細(xì)胞（hiPSC-CC）或hiPSC-CC 細(xì)胞來源的外泌體后，藥效學(xué)作用未見明顯差異，但外泌體治療并未增加心律失常的頻率，具有更好的安全性［19］。與傳統(tǒng)的細(xì)胞移植相比，EV 作為一種簡單的微小囊泡結(jié)構(gòu)，不含細(xì)胞核，不能異常增殖和分化［20］，致瘤性和免疫原性風(fēng)險較低，具有更高的治療安全性。

EV 作為載體，能夠保護(hù)包載的藥物在人體復(fù)雜的環(huán)境中不被降解，隨后通過膜融合將藥物直接運輸至細(xì)胞質(zhì)中，使藥物攝取量更大、循環(huán)時間更久、藥物釋放更加持續(xù)。相比于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、AAV 等病毒載體，EV 毒性低，無整合及致畸致瘤風(fēng)險。與合成納米載體相比，EV 輸送系統(tǒng)在靶向性和藥代動力學(xué)方面具有顯著優(yōu)勢。內(nèi)源性納米載體具有更好的體內(nèi)生物相容性，清除率低。納米尺度的EV 可通過包括血腦屏障在內(nèi)的絕大多數(shù)生物屏障系統(tǒng)，其表面存在一些特殊的蛋白，能避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕獲，逃脫單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的快速清除，引起的有害免疫反應(yīng)極低，納米級分子的EV 可利用增強滲透滯留效應(yīng)滲入到腫瘤內(nèi)發(fā)揮作用。EV 也可遷移至無血液供應(yīng)的組織或區(qū)域，如致密的軟骨基質(zhì)［21］。此外，可通過改造EV的表面蛋白實現(xiàn)多種目的，例可將靶向細(xì)胞或組織的肽附加在EV 表面，以實現(xiàn)針對特定組織的選擇性靶向，避免在其他器官中不必要的積累，從而降低全身毒性［14］。

2.2基于EV 療法的存在的問題 EV 的臨床轉(zhuǎn)化受到大規(guī)模生產(chǎn)、純化、修飾和儲存的挑戰(zhàn)，且EV 亞群之間的異質(zhì)性對于生產(chǎn)制造和臨床轉(zhuǎn)化的質(zhì)量控制提出了要求。EV 作為載體也面臨著許多問題，如載藥效率較低、封裝率低；殘留的轉(zhuǎn)染試劑可能會影響封裝過程和改變EV 的細(xì)胞功能；電穿孔法易引起EV 聚集，對藥物和EV 的完整性會產(chǎn)生影響等。腫瘤細(xì)胞分泌的EV 存在促進(jìn)腫瘤生長及免疫抑制的風(fēng)險，含有的腫瘤相關(guān)抗原和免疫抑制分子能夠下調(diào)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，還能傳遞某些抑制信號，在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞形成免疫耐受。促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)和RNA 也可利用EV 作為逃逸載體而免受機(jī)體的免疫應(yīng)答作用。此外，基因修飾后的EV 是否會引起機(jī)體免疫反應(yīng)、是否保持原有功能尚不確定。目前，人們對EV 的了解尚不足，天然外泌體難以體內(nèi)示蹤，其在人和動物體內(nèi)的生物分布仍有待闡明。

3 EV的監(jiān)管

EV 領(lǐng)域相對較新，其來源廣、種類繁雜，難以統(tǒng)一歸類并研究，相關(guān)知識涉及多個領(lǐng)域和學(xué)科。目前的技術(shù)手段對于EV 這樣納米級的非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的操作尚存在一定困難。不同的操作人員、儀器、實驗系統(tǒng)以及生物標(biāo)本來源均會引起實驗結(jié)果的差異［22］。明確分類、規(guī)范實驗方法、保證實驗的嚴(yán)謹(jǐn)性和可重復(fù)性成為行業(yè)內(nèi)亟需了解并亟待解決的問題。

2011年，國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會（International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）成立，并與歐盟歐洲科技合作組織（European Cooperation in Science and Technology，COST）組成了歐洲健康與疾病微囊和外泌體網(wǎng)絡(luò)（European Network on Microvesicles and Exosomes in Health and Disease，ME-HaD）［23］。ISEV 和ME-HaD的成立旨在規(guī)范EV領(lǐng)域的研究，促進(jìn)學(xué)術(shù)、臨床轉(zhuǎn)化及工業(yè)化生產(chǎn)之間的交流，以加強對EV 的基本理解和臨床轉(zhuǎn)化潛力。ISEV 和ME-HaD 發(fā)表了多份立場聲明和文件，為EV 的基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化提供了信息，并提出基本指導(dǎo)要求。美國FDA 明確將外泌體納入動物細(xì)胞、組織以及基于細(xì)胞和組織的產(chǎn)品（Animal Cells，Tissues，and Cell-and Tissue-Based Products，ACTPs）。

3.1ISEV和ME-HaD立場聲明及文件 為了提高實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，ISEV 于2014 年發(fā)表了一篇立場聲明MISEV2014［22］，內(nèi)容是“細(xì)胞外囊泡研究的最低實驗要求”，包括EV 的分離、鑒定和功能研究。2015 年，ME-HaD 與ISEV 聯(lián)合發(fā)表立場聲明［7］，重點介紹了EV 生產(chǎn)和臨床應(yīng)用必須考慮的安全和監(jiān)管要求。隨著研究者對EV 的研究不斷深入，EV領(lǐng)域的知識不斷演變，ISVE 在2017年［24］和2018年［2］分別對MISEV2014 中的內(nèi)容進(jìn)行了更新和補充，MISEV2018 還增加了規(guī)范EV 命名的建議。MISEV作為業(yè)內(nèi)研究者的共識，是目前國際公認(rèn)的EV 指導(dǎo)要求。

此外，ISEV在2013年發(fā)表立場文件［25］，指出了EV樣品采集、分離和分析方法標(biāo)準(zhǔn)化建議；2013年［26］和2017 年［27］發(fā)表的立場文件中概述了EV RNA 領(lǐng)域的知識現(xiàn)狀，討論了EV RNA 分析和生物信息學(xué)；2019年發(fā)表了關(guān)于EV生物膜的立場文件［28］，列舉了EV生物膜的生物發(fā)生、穩(wěn)定性、攝取、內(nèi)容物轉(zhuǎn)移、研究技術(shù)和功能分析；2021年5月，最新發(fā)表了關(guān)于尿液EV的立場文件［29］，介紹了EV的生物學(xué)信息以及當(dāng)前收集、分離、表征尿液EV 的技術(shù)手段，分析了基于尿液EV 臨床應(yīng)用分析中的發(fā)展趨勢和挑戰(zhàn)，并提出在尿液EV研究中標(biāo)準(zhǔn)化，提高嚴(yán)謹(jǐn)性和可重復(fù)性的建議。

3.2ISEV建議分類及基于EV療法的監(jiān)管建議 由于當(dāng)前對于EV的了解尚不夠深入，目前尚無專門針對基于EV 療法的相關(guān)政策和法規(guī)出臺。EV 可歸類為生物制品，基于EV 的療法受到歐盟、美國、澳大利亞、日本和中國有關(guān)生物制品的監(jiān)管。ISEV 建議對基于EV的療法進(jìn)行分類［10］：①來自未經(jīng)基因修飾的細(xì)胞的天然EV；②來自基因修飾的細(xì)胞的非轉(zhuǎn)基因天然EV；③來自基因修飾的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因天然EV，分類屬于生物制品中的基因治療產(chǎn)品；④EV 作為化學(xué)藥物或其他分子成分的藥物遞送系統(tǒng)，屬于生物和化學(xué)聯(lián)合治療，歸類為生物藥物。必須確定EV 是否為有效成分，若不是有效成分，則被視為“賦形劑”。

由于EV 的特殊性，可能需要專門針對基于EV療法的指導(dǎo)原則［10］。EV 領(lǐng)域發(fā)展迅速，建議各國藥監(jiān)部門對EV 類產(chǎn)品引起重視、及時跟進(jìn)，希望通過出臺技術(shù)指導(dǎo)文件來規(guī)范和指導(dǎo)EV 產(chǎn)品的研發(fā)上市，促進(jìn)EV產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

4 EV的非臨床評價策略

隨著EV 臨床試驗的大量開展，基于EV 療法的安全性和有效性是關(guān)注重點。EV 多來源于細(xì)胞，在復(fù)雜性、組成和生物學(xué)作用方面可能與其來源材料有許多相似之處，基于EV 的治療藥物將與基于細(xì)胞治療產(chǎn)品密切相關(guān)。與細(xì)胞治療產(chǎn)品相同，傳統(tǒng)的非臨床評價方法及標(biāo)準(zhǔn)在EV 的評價上具有一定的局限性。因此，在EV 的非臨床研究中，研究者應(yīng)設(shè)計合理的試驗，證明其有效性并觀察潛在毒性，為臨床試驗提供更多參考依據(jù)。EV 的非臨床研究可能包括體內(nèi)外藥效研究、藥代動力學(xué)研究以及非臨床安全性研究。

4.1非臨床研究的一般原則 EV 非臨床研究尚無特定指導(dǎo)原則，臨床前評價經(jīng)驗較少，結(jié)合ME-HaD對基于EV 療法安全性研究的建議，應(yīng)按照“product by product”的原則進(jìn)行試驗設(shè)計。需重視概念驗證（proof of concept，POC）試驗，并通過POC研究初步驗證藥效、作用機(jī)制及靶點，探索量效關(guān)系，優(yōu)化給藥途徑和方案，為臨床試驗提供可行性和有效性的非臨床證據(jù)。進(jìn)行非臨床研究應(yīng)關(guān)注EV 是否修飾。受試物需盡量采用具有臨床代表性的產(chǎn)品進(jìn)行非臨床研究。動物模型的選擇上應(yīng)明確疾病特異性和物種特異性，根據(jù)研究目的來選擇適當(dāng)?shù)膭游锓N屬［12］。所選擇的動物生物反應(yīng)與預(yù)期人體反應(yīng)相似，必要時可考慮選擇疾病模型動物進(jìn)行安全性研究。在合適的情況下，其藥理學(xué)、藥代動力學(xué)、毒理學(xué)試驗可考慮聯(lián)合開展。給藥方式應(yīng)能最大程度模擬臨床擬用給藥方式。此外還應(yīng)關(guān)注系統(tǒng)給藥或局部給藥的毒性風(fēng)險，以及給藥方式的潛在風(fēng)險。應(yīng)用同種異體EV 時，必須考慮組織相容性的潛在影響［10］。此外，有研究結(jié)果顯示，脂肪組織來源和心臟來源的EV比骨髓來源的EV 顯示出更強的血管生成能力［30-31］。骨髓來源的EV 的產(chǎn)生能力和分泌譜高于脂肪來源的EV［32］，表明不同組織來源的EV 具有不同的活性。但目前尚未研究比較不同物種的EV?；贓V 療法的非臨床研究必須考慮到不同物種及不同來源（自體、同種異體、異體、異種）的EV的生物學(xué)差異。

4.2藥學(xué)研究 EV 的生產(chǎn)使用活細(xì)胞，制備過程中的微小變化可能會對EV 的產(chǎn)品特性產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在評估產(chǎn)品的整體風(fēng)險時，應(yīng)考慮各種因素對產(chǎn)品風(fēng)險的影響，如細(xì)胞的來源、操作程度、培養(yǎng)時間、存活情況和代次，EV 的儲存條件，物理性及化學(xué)性處理或基因修飾／改造對EV 特性的改變程度，使用方式以及預(yù)處理等多方面因素。

對于EV 的質(zhì)量控制，需定義關(guān)鍵質(zhì)量屬性。評估這些屬性的方法可包括評估親代細(xì)胞特性（如評估生存力和表面標(biāo)記表達(dá)以評估表型）、EV 特征（如評估數(shù)量、大小、表面標(biāo)記表達(dá)和內(nèi)容物）、微生物污染（如檢測內(nèi)毒素和支原體）和功能活性［33］。對于批間差異性的評估，可引入生物類似藥研究中的概念，即受試物的分析特性應(yīng)與參照藥高度相似［34］。

EV 的表征是安全性、有效性的先決條件。目前尚無特定的指導(dǎo)原則用于指導(dǎo)EV 制劑的表征，參考國家藥品監(jiān)督管理局2008 年頒布的《多組分生化藥注射劑基本技術(shù)要求（試行）》執(zhí)行，應(yīng)盡可能對所含組分進(jìn)行特征性鑒別，如組成過于復(fù)雜，應(yīng)至少明確所含的起藥效的主要成分。MISEV2018 中指出了EV 表征的最低實驗要求和檢測技術(shù)，包括量化、整體和單個特征描述及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的表征要求（表3）［2］。MISEV2018 中雖未提及對EV 作為載體時的包封率要求，但EV作為藥品仍需關(guān)注包封率。

表3 MISEV2018中對EV表征的最低實驗要求Tab.3 Minimum experimental requirements for characterization of EV in MISEV 2018

4.3藥效學(xué)和藥代動力學(xué)研究 大多數(shù)EV 是在體外獲得，其在體內(nèi)的分泌、轉(zhuǎn)移和蓄積部位并不清楚［35］，EV 可在遞送部位和周圍被細(xì)胞相對較快地內(nèi)化，通常進(jìn)入非特定的細(xì)胞類型和全身循環(huán)。結(jié)合生物分布實驗，可以研究EV 的半衰期和降解情況，監(jiān)測周期應(yīng)設(shè)合適的時間間隔，來顯示“EV 命運”。若EV 表面設(shè)計了靶向的工程改造，關(guān)注靶組織和非靶組織分布特點有利于進(jìn)一步研究該產(chǎn)品的有效性和安全性。但EV 中生物活性成分的多樣性使得臨床前藥效和藥代動力學(xué)研究更為復(fù)雜。因此，需找出可量化的方式來進(jìn)行EV 的生物分布研究，目前已研究通過采用放射性同位素標(biāo)記成像技術(shù)［36］、活體成像技術(shù)［37］、聚合酶鏈反應(yīng)分析［37-38］以及流式細(xì)胞術(shù)［39-40］等方式開展相關(guān)研究。若對EV 標(biāo)記進(jìn)行體內(nèi)示蹤，則必須考慮染料等標(biāo)記方式對EV 組分功能的影響［7］，且需排除游離染料本身信號的風(fēng)險［37］，可綜合運用一種或多種合適的細(xì)胞追蹤方法，并進(jìn)行必要的驗證。

當(dāng)采用EV 作為藥物載體時，參考國家藥品監(jiān)督管理局2021 年8 月頒布的《納米藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》和2008 年頒布的《化學(xué)藥品注射劑基本技術(shù)要求（試行）》中特殊注射制劑（如脂質(zhì)體、微球、微乳等）的要求，盡量解析載藥粒子和裝載藥物等多種形態(tài)成分在體內(nèi)的相互關(guān)系。如為改良型生物制品，建議進(jìn)行普通注射劑型和EV 載體藥物的比較藥代動力學(xué)研究，根據(jù)研究結(jié)果確定如何開展進(jìn)一步的毒理研究。

4.4非臨床安全性研究 目前國內(nèi)尚無EV 相關(guān)產(chǎn)品的非臨床研究指導(dǎo)性文件，但因EV 主要來源于細(xì)胞，當(dāng)EV 作為治療藥物時，臨床前試驗設(shè)計需參考細(xì)胞治療產(chǎn)品相關(guān)指導(dǎo)原則要求［41-42］，若同時存在基因編輯操作，則兼具了基因治療產(chǎn)品特點，還需參考基因治療產(chǎn)品相關(guān)指導(dǎo)原則［43-45］進(jìn)行臨床前研究設(shè)計。當(dāng)EV 作為藥物載體時，除EV 本身關(guān)注因素外，還需參考化學(xué)藥或生物制品相關(guān)指導(dǎo)原則，針對包載藥物本身的特點制定基于包載藥物的臨床前研究策略，可參考國家藥品監(jiān)督管理局2021 年8 月頒布的《納米藥物非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》。

與細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品相同，EV 的非臨床安全性研究同樣應(yīng)盡量遵從《藥物非臨床研究質(zhì)量管規(guī)范》（GLP）。對于某些在非GLP 狀況下開展的研究或檢測，應(yīng)予說明并評估非GLP 對試驗結(jié)果可靠性、完整性及對產(chǎn)品總體安全性評價的影響。

非臨床安全性研究主要包括一般毒性研究（以常規(guī)毒理學(xué)檢測終點為主要觀察指標(biāo)的單次給藥和／或多次給藥毒性研究），以心血管、呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的安全藥理研究，制劑安全性研究，以及遺傳和生殖毒性研究等。

一般毒性研究選擇毒理學(xué)終點時，除應(yīng)包含常規(guī)毒理學(xué)評價終點外，還需關(guān)注免疫原性和免疫毒性風(fēng)險。雖然在EV 治療中尚未研究或觀察到潛在致命反應(yīng)細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），但在基于EV的癌癥免疫治療中，CRS應(yīng)被考慮在內(nèi)。EV 攜帶的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等組分也可能引入免疫原性和免疫毒性風(fēng)險，在臨床前研究階段同樣需適當(dāng)關(guān)注。建議在非臨床研究階段重點觀察相關(guān)的免疫指標(biāo)，包括血液學(xué)（含白細(xì)胞分類）、免疫細(xì)胞表型分型、血清球蛋白水平、詳細(xì)的免疫器官組織病理學(xué)檢查和淋巴器官稱重等。若上述研究發(fā)現(xiàn)明顯異常，還應(yīng)考慮進(jìn)行進(jìn)一步的免疫功能試驗以明確其作用的機(jī)理，為臨床研究方案的設(shè)計提供重要參考。此外，不同于親本細(xì)胞，EV 本身不能在體內(nèi)增殖分化，但可能攜帶了較為復(fù)雜的親本細(xì)胞的遺傳信息，可能具有潛在的致瘤風(fēng)險，除需關(guān)注親本細(xì)胞本身的成瘤／致瘤性風(fēng)險外，還需在EV 安全性評價中重點關(guān)注體內(nèi)試驗中異常／異位增生性病變（如增生、腫瘤）發(fā)生情況，初步評估其致瘤性風(fēng)險。如目前備受關(guān)注的環(huán)狀RNA（circRNA）已被證明廣泛存在于EV［46］，circRNA具有獨立于親本mRNA的生理和病理功能，其治療機(jī)制為體內(nèi)目標(biāo)circRNA分子的過表達(dá)或敲低［47］。基于EV 的治療需關(guān)注circRNA 過表達(dá)產(chǎn)生潛在的錯誤剪接副產(chǎn)物（包括同源線性RNA）的風(fēng)險，以及通過RNA 干擾（RNA interference，RNAi）方法敲除circRNA 對線性同源基因或其他基因的影響［47］。

5 小結(jié)與展望

EV 應(yīng)用前景十分廣闊，未來的發(fā)展應(yīng)集中在輔助現(xiàn)有治療方法上，完善現(xiàn)有療法的不足。最近，實時和高分辨率顯微鏡技術(shù)結(jié)合創(chuàng)新的EV 標(biāo)記策略和報告系統(tǒng)，為在體內(nèi)生理環(huán)境和單囊泡水平研究EV 提供了新工具［48］。目前基于EV 的治療作為藥物或醫(yī)療技術(shù)的研發(fā)進(jìn)程尚處于起步階段，距離工業(yè)化生產(chǎn)并成功應(yīng)用于臨床尚有很長一段距離。開發(fā)和完善EV 的表征和表型檢測技術(shù)，研究外泌體結(jié)構(gòu)和組成，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，減少組成的異質(zhì)性，將有利于其在疾病診斷和治療中的應(yīng)用?；谀壳凹夹g(shù)水平的限制及對EV 認(rèn)識的不足，EV 在研究、監(jiān)管、生產(chǎn)、非臨床研究和臨床試驗等方面均還需標(biāo)準(zhǔn)化的規(guī)則。尤其是臨床前研究，尚需各項體內(nèi)和體外試驗來闡明EV 各種生物學(xué)功能的機(jī)制，加快推進(jìn)EV的臨床轉(zhuǎn)化。相信隨著各項技術(shù)的快速發(fā)展，EV 作為無細(xì)胞治療方式和新型載藥系統(tǒng)，將具有更廣闊的應(yīng)用前景。