肖 輝,張卉青,王學彬,楊 提4#(.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院重癥醫(yī)學科,湖北 十堰 44000; .東莞市濱海灣中心醫(yī)院臨床藥學科,廣東 東莞 53900; 3.海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院藥學部,上海00433; 4.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院臨床藥學部,上海 0035)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由多種因素造成肺內(nèi)和(或)肺外發(fā)生過度炎癥反應,引起全身多器官功能障礙的臨床綜合征,也是引起重癥患者發(fā)生急性呼吸衰竭的常見病因[1-2]。但目前并沒有特效藥物治療ARDS[3]。胃腸道功能障礙是ARDS突出的臨床表現(xiàn)之一。四磨湯源于《嚴氏濟生方》,組方中的木香、枳殼、烏藥和檳榔等有順氣降逆、疏肝和胃及消積止痛的功效,多用于消化功能障礙患者的治療。同時,肺與大腸相表里是中醫(yī)臟腑整體觀的重要理論觀點。因此,本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法,分析四磨湯能否在ARDS的治療中發(fā)揮積極作用,并探究其發(fā)揮藥效的具體分子機制,為將來的實驗驗證提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 四磨湯活性成分及潛在靶點的獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)對方劑中的4味組分的化學成分進行檢索,將檢索結果中各成分的口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18作為篩選依據(jù),初步篩選出符合要求的活性成分并收集各成分的作用靶點[4]。最后,利用Uniprot蛋白質數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)對收集到的作用靶點進行名稱規(guī)范。

1.2 ARDS相關靶點的獲取

以“acute respiratory distress syndrome”作為ARDS的檢索關鍵詞,分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.GeneCards.org)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)中檢索ARDS的相關靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中,Score值表示靶點與疾病相關性,Score值越大,表示關系越密切;依據(jù)經(jīng)驗,設置相關性分值(Relevance score)≥20為篩選條件,對檢索到的疾病靶點處理、去重后,獲取ARDS靶點[5]。

1.3 四磨湯-ARDS共有靶點的獲取

為了明確四磨湯潛在靶點與ARDS相關靶點間的相互關系,利用在線工具Venny 2.1平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將二者靶點取交集并繪制韋恩圖,獲得四磨湯-ARDS共有靶點及其對應的核心藥物成分。

1.4 四磨湯-ARDS共有靶點蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選

將獲得的共有靶點輸入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),物種設定為“Homo sapiens”,medium confidence>0.4,其余參數(shù)均為默認值,構建“1.3”項下獲取的目標靶點的PPI網(wǎng)絡圖;再將PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)導入CytoScape 3.7.2(http://cytoscape.org/),利用其內(nèi)置工具NetworkAnalyzer對PPI網(wǎng)絡進行分析,篩選出核心靶點。

1.5 四磨湯-ARDS的核心靶點基因本體(GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

GO功能富集分析是從分子功能(MF)、細胞組分(CC)和生物過程(BP)3個方面對基因與蛋白質的功能進行限定和描述,由于不同基因在生物體內(nèi)相互協(xié)同作用發(fā)揮其相應的生物學功能,因此,對目標基因進行KEGG通路富集分析更有助于了解目標基因的功能。應用R語言軟件中cluster Profiler GO.R插件對核心靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析并對分析結果可視化,進一步探究四磨湯發(fā)揮治療ARDS作用的過程中可能涉及參與調(diào)控的信號通路。

1.6 四磨湯活性成分-ARDS核心靶點-通路網(wǎng)絡圖的構建及分子對接驗證

運用CytoScape 3.7.2構建四磨湯活性成分-ARDS共有核心靶點-信號通路網(wǎng)絡圖。利用CytoScape 3.7.2內(nèi)置工具NetworkAnalyzer對所構建的四磨湯核心活性成分及其對應的作用靶點網(wǎng)絡的拓撲學參數(shù)進行分析,并依據(jù)經(jīng)驗設置該網(wǎng)絡的拓撲參數(shù)閾值,最終篩選出四磨湯組方中發(fā)揮治療ARDS的關鍵活性成分及核心靶點;再利用分子對接軟件AutoDock Vina(http://vina.scripps.edu/)對上述關鍵活性成分與其對應的核心靶點進行分子對接模擬,對其結合活性在計算機水平進行驗證。

2 結果

2.1 四磨湯活性成分及潛在作用靶點的獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫分別對木香、枳殼、烏藥和檳榔進行檢索,再經(jīng)過Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點蛋白的名稱進行統(tǒng)一規(guī)范后剔除重復值,最終得到24種候選活性成分及222個與其對應的作用靶點。

2.2 ARDS相關靶點的獲取

通過GeneCards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索、篩選,得到848個ARDS相關靶點。

2.3 四磨湯-ARDS共有靶點篩選結果

將篩選所得的四磨湯潛在靶點與ARDS相關靶點取交集,通過Venny 2.1繪制韋恩圖,得到四磨湯-ARDS共有靶點76個,見圖1;其對應的組方中藥物活性成分18種,根據(jù)共有靶點與活性成分間的映射關系可知活性成分所屬中藥的名稱,見表1。

表1 四磨湯治療ARDS的核心成分相關信息Tab 1 Information about the core components of Simot detection in the treatment of ARDS

圖1 四磨湯潛在靶點-ARDS相關靶點韋恩圖Fig 1 Potential targets of Simo decoction-Venn diagram of ARDS related targets

2.4 PPI網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選結果

將篩選出的76個共有靶點輸入String平臺得到四磨湯-ARDS共有靶點PPI網(wǎng)絡(包含76個節(jié)點和1 389條邊),見圖2。利用Cytoscape 3.7.2軟件篩選該PPI網(wǎng)絡中的核心靶點。用“節(jié)點”(node)表示靶點,用“邊”(edge)表示靶點之間的關系,抓取其中3個網(wǎng)絡特征參數(shù)如介度、連接度以及緊密度等對靶點進行篩選。根據(jù)經(jīng)驗,以一級網(wǎng)絡特征參數(shù)的2倍中位數(shù)為篩選條件,即以連接度≥38、介度≥0.005以及緊密度≥0.658為條件,篩選出二級網(wǎng)絡圖(包含33個節(jié)點和501條邊);同樣,以二級網(wǎng)絡特征參數(shù)的2倍中位數(shù)為篩選條件,即以連接度≥52、介度≥0.011以及緊密度≥0.765為條件,最終得到三級網(wǎng)絡(包含14個節(jié)點和91條邊),即篩選出14個靶點作為四磨湯-ARDS的核心靶點,見圖3。應用R語言count.R插件統(tǒng)計出現(xiàn)頻次較高的前14位靶點,依次為腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)6、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、蛋白激酶B(AKT1)和基質金屬蛋白酶9(MMP9)等,為四磨湯治療ARDS的核心靶點,見圖4。

圖2 四磨湯-ARDS共有靶點PPI網(wǎng)絡圖Fig 2 Simo decoction-ARDS common target PPI network diagram

圖3 四磨湯-ARDS的核心靶點篩選流程圖Fig 3 Flow diagram of core targets screening for Simo decoction-ARDS

圖4 四磨湯-ARDS核心靶點出現(xiàn)頻次分布圖Fig 4 Frequency distribution of core target for Simo decoction-ARDS

2.5 四磨湯-ARDS的核心靶點GO和KEGG富集分析

利用R語言對核心靶點進行基因富集分析,進一步探討四磨湯治療ARDS的分子作用機制。根據(jù)信號通路基因所占總體輸入基因的比率(GeneRatio)排列,展示前15位,見圖5(A—C)。圖5(A)為BP分析,表明四磨湯-ARDS的核心靶點主要涉及細胞化學應激的應答過程(cellular response to chemical stress)、活性氧的應答過程(response to reactive oxygen species)等;圖5(B)為CC分析,可見核心靶點主要作用于RNA聚合酶Ⅱ轉錄調(diào)控復合物(RNA polymerase Ⅱ transcription regulator complex);圖5(C)為MF分析,核心靶點的功能主要富集于細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)等。

A.GO-BP分析;B.GO-CC分析;C.GO-MF分析;D.KEGG分析。A. GO-BP analyssis; B. GO-CC analysis; C. GO-MF analysis; D. KEGG analysis.圖5 四磨湯-ARDS核心靶點的富集分析Fig 5 Enrichment analysis of core target of Simo decoction-ARDS

KEGG通路富集分析結果展示以GeneRatio排序居前20位的信號通路,包括流體剪切應力與動脈粥樣硬化、TNF、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)以及IL-17等信號通路,見圖5(D);靶點通路富集結果見表2。以上分析結果體現(xiàn)了四磨湯多成分、多靶點、多通路的作用特點。

2.6 四磨湯活性成分-ARDS核心靶點-通路網(wǎng)絡圖的構建結果

運用CytoScape 3.7.2構建四磨湯活性成分-ARDS核心靶點-通路網(wǎng)絡圖,見圖6。利用其內(nèi)置工具NetworkAnalyzer分析四磨湯治療ARDS的網(wǎng)絡拓撲學參數(shù),得到其治療ARDS的主要活性成分及核心作用靶點。NetworkAnalyzer分析結果顯示,槲皮素(quercetin)的連接度為13,介度為0.064 9,緊密度為0.596 8,預測槲皮素為四磨湯治療ARDS的關鍵成分,其次為蜜橘黃素、柚皮素和β-谷甾醇,見表3。原癌基因蛋白(JUN)在網(wǎng)絡中的連接度為23,介度為0.139 4,緊密度為0.711 5,預測JUN為四磨湯治療ARDS的關鍵靶點。其他關鍵靶點主要集中在MAPK8、原癌基因(FOS)、AKT1、胱天蛋白酶3(CASP3)和TNF等,見表4。

表3 四磨湯主要活性成分網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)Tab 3 Characteristic parameters of active component network nodes of active components of Simo decoction

表4 四磨湯治療ADRS靶點網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)Tab 4 Characteristic parameters of network nodes of Simo decoction in the the treatment of ARDS

圓形節(jié)點為藥物核心成分,菱形為核心靶點,倒三角為通路;節(jié)點的面積代表其度數(shù),面積越大說明該節(jié)點越重要。The circular node is the core component of the drug, the diamond is the core target, and the inverted triangle is the pathway; the area of a node represents its degree, and the larger the area, the more important the node.圖6 四磨湯核心成分-ARDS核心靶點-通路網(wǎng)絡圖Fig 6 Core components of Simo decoction-core target of ARDS-pathway of network diagram

2.7 分子對接

分子對接結合能越小,表示成分-靶點結合越穩(wěn)定。當結合能<-20.92 kJ/mol時,表示結合能力較好;<-29.29 kJ/mol時,表示結合能力極好。將獲得的關鍵成分槲皮素與關鍵靶點JUN、MAPK8、FOS、AKT1、CASP3和TNF進行分子對接,結果見表5。槲皮素與關鍵靶點的結合能均<-20.92 kJ/mol,說明其結合活性良好;其中,槲皮素與靶點TNF結合能為-34.64 kJ/mol,提示其結合活性最強,見圖7。分子對接進一步驗證了四磨湯治療ARDS的可能性。

A.槲皮素與TNF(結合能為-34.64 kJ/mol);B.槲皮素與CASP3(結合能為-27.61 kJ/mol);C.槲皮素與AKT1(結合能為-26.36 kJ/mol);D.槲皮素與FOS(結合能為-26.36 kJ/mol);E.槲皮素與MAPK8(結合能為-24.69 kJ/mol);F.槲皮素與JUN(結合能為-20.01 kJ/mol)。A. quercetin and TNF (binding energy -34.64 kJ/mol);B. quercetin and CASP3 (binding energy -27.61 kJ/mol); C. quercetin and AKT1 (binding energy -26.36 kJ/mol); D. quercetin and FOS (binding capacity -26.36 kJ/mol); E. quercetin and MAPK8 (binding energy -24.69 kJ/mol); F. quercetin and JUN (binding energy -20.01 kJ/mol).圖7 四磨湯關鍵成分與關鍵靶點分子對接圖Fig 7 Molecular docking diagram of key components of Simo decoction and key targets

表5 四磨湯關鍵成分與關鍵靶點分子結合能Tab 5 Binding energy between key components and key target molecules of Simo decoction

3 討論

近年來,中藥復方在治療ARDS方面取得了實質性進展。如大承氣湯灌腸可顯著改善ARDS患者的肺動態(tài)順應性和肺氧合功能,并減少機械通氣并發(fā)癥[6-8];涼膈散可有效降低ARDS大鼠模型肺組織中Toll樣受體4蛋白的表達,進而減輕炎癥反應,緩解肺組織損傷[9-10]。王中華等[11]給予ARDS模型小鼠四磨湯灌胃治療后,可顯著抑制ARDS的炎癥反應,減輕氧化應激而減少ARDS小鼠肺損傷,但其中具體的分子機制尚未闡明。

本研究通過對四磨湯活性成分-ADRS靶點-信號通路網(wǎng)絡圖進行網(wǎng)絡拓撲學分析,推測四磨湯可能通過調(diào)控JUN、MAPK8、FOS、AKT1、CASP3和TNF等關鍵靶點來發(fā)揮治療ADRS的作用。研究結果發(fā)現(xiàn),TNF水平在ARDS患者中顯著升高,與病毒介導的呼吸系統(tǒng)疾病(ARDS和急性肺損傷)的發(fā)生密切相關[12];抑制由JUN和FOS家族組成的轉錄因子AP-1的活性,可降低炎癥因子的表達,改善肺損傷程度[13-15];抑制CASP3的表達,對肺內(nèi)皮細胞具有保護作用[16]。另有研究結果發(fā)現(xiàn),ARDS患者血液中D-二聚體水平升高,血液循環(huán)處于高凝狀態(tài),血小板的活化可能在ARDS發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[17-18]。而JNK1(MAPK8)作為JNK家族成員之一,參與調(diào)控血小板的聚集、黏附及分泌等過程[19]。AKT1是AKT異構體之一,參與細胞生長、代謝、凋亡和轉錄調(diào)控等多種重要生理過程[20-22]。但是,AKT1在ARDS方面的研究目前尚未見報道,今后可進一步加強兩者間的探討。

ARDS的臨床表現(xiàn)除了呼吸道癥狀外,還伴有腹脹等胃腸道癥狀。本研究結果發(fā)現(xiàn),四磨湯治療ARDS的關鍵成分為槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素和蜜橘黃素等。槲皮素作為一種自由基清除劑,具有抗氧化損傷、保護胃黏膜的作用[23];β-谷甾醇具有心臟保護、抗炎及抗腹瀉的作用[24-25];柚皮素不僅具有心臟保護的作用,還具有抗炎、抗氧化、抗菌抗病毒和改善內(nèi)皮功能等作用[26-27]。這在一定程度上為四磨湯治療ARDS提供了佐證。

本研究通過GO/KEGG富集分析,明確了四磨湯發(fā)揮治療ARDS作用中的BP以及信號通路。其中涉及的主要BP包括細胞化學應激的應答過程、活性氧的應答過程等,表明四磨湯可以通過影響多個BP而發(fā)揮其治療ARDS的藥效;涉及的主要信號通路包括流體剪切應力與動脈粥樣硬化、TNF、MAPK以及IL-17等,這些信號通路與ARDS相關的胃腸道癥狀有密切的關系,也表明四磨湯可能協(xié)同多個信號通路共同發(fā)揮治療ARDS的作用。

綜上所述,本研究運用網(wǎng)絡藥理學及分子對接方法分析并在計算機模擬水平驗證了四磨湯治療ARDS可能涉及的分子機制,該機制關聯(lián)多個BP和信號通路,展現(xiàn)了中藥多組分與多靶點的綜合作用,多維度治療疾病的思路。但是,本研究僅是以生物信息學和網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫為基礎,在理論上對四磨湯治療ARDS的分子機制進行預估,還需要在細胞和動物水平更深一步地對分析得到的活性成分、關鍵靶點以及信號通路進行驗證,繼而闡釋四磨湯發(fā)揮治療ARDS作用的具體分子機制。