徐 霞,王鵬程,韓 璐

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院蘇州九龍醫(yī)院,江蘇 蘇州 215000)

人類胎盤的侵襲性絨毛外滋養(yǎng)層與成功的妊娠結(jié)局密切相關(guān)。它們重塑子宮螺旋動脈,以增加流向胎盤和發(fā)育中胎兒的血流和氧氣輸送[1-2]。滋養(yǎng)層細胞系的細胞活動,如滋養(yǎng)層的增殖、分化、遷移和侵襲,是健康妊娠的關(guān)鍵。由于滋養(yǎng)層侵襲與螺旋動脈重塑相關(guān),甚至是其關(guān)鍵,而螺旋動脈重塑是成功胎盤形成的先決條件[3]。與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)的一些特征已被證實,波形蛋白和N-鈣黏蛋白作為間充質(zhì)細胞的強制性標(biāo)記,迄今為止尚未在EVT亞群中報道[4]。此外,據(jù)報道,兩種非經(jīng)典鈣黏蛋白,血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)和鈣黏蛋白-11(CDH-11)在人類胎盤滋養(yǎng)層細胞中表達。CDH-11和VE-cadherin被描述為ST和EVT的特征。已有研究表明,幾種miRNA通過靶向不同的基因?qū)TR-8/SVneo細胞的凋亡產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用,如靶向胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的miR-30a-3p[4]、靶向肝細胞受體B4(EPHB4)[5]的miR-454,miR-320a靶向肝臟雌激素相關(guān)受體γ(ERRγ)[6],miR-423-5p靶向胰島素樣生長因子2mRNA結(jié)合蛋白1(IGF2BP1)[7],微小RNA-184(miR-184)靶向趨化因子12(CXCL12β)[8],miR-184靶向野生型p53誘導(dǎo)基因1(WIG1)[9]miR-210靶向Notch跨膜受體-1(NOTCH1)[10]。原位雜交顯示,滋養(yǎng)層在胎盤中表達miR-184[11],而唐氏綜合征胎兒胎盤中miR-184的表達上調(diào)[12]。在早發(fā)性重度子癇前期,miR-184通過靶向鞘氨醇1磷酸酯裂解酶1(SGPL1)增強滋養(yǎng)層細胞產(chǎn)生(IL-8)[13]。然而,miR-184在滋養(yǎng)層細胞中的功能仍不清楚[14]。本文進一步從女性滋養(yǎng)層細胞組織中miR-184表達水平、外源性miR-184表達水平,以及miR-184對細胞增殖、凋亡的影響進行研究,以全面掌握miR-184在女性滋養(yǎng)層細胞組織中的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑:HTR8/SVneo、Swan71和正常的上皮組織細胞,胎牛血清,頭孢噻嗪(HT),300 μg/ml,100 mmol/L Tris-HCl(pH7.5),5 mol/L EDTA緩沖液,堿性裂解液:0.2 mol/L NaOH,1% SDS乙酸鈉:3 mol/L KAc(pH 4.8);異丙醇70%乙醇;溴酚藍,蔗糖指示劑。 TBE緩沖液,1%瓊脂糖,溴化乙錠。 PI母液:500 μg/ml; Ho33342母液:2 mmol/L。

1.1.2 儀器和設(shè)備:熒光顯微鏡,電泳儀,電泳槽,微量取樣器(1 ml,100 μl)0.5、1.5 ml離心管,載玻片,蓋玻片。

1.2 實驗方法 ①使用DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(10%)、制作細胞培養(yǎng)基進行樣本細胞培養(yǎng)。②在培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清、青霉素、鏈霉素,將采集的女性滋養(yǎng)層細胞組織樣本細胞在37 ℃和5%的CO2條件下進行培養(yǎng)。③將si-miR-184轉(zhuǎn)染到女性滋養(yǎng)層細胞組織腺細胞HTR8/SVneo、Swan71中,完成轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng),同時設(shè)置空白載體和陰性對照組(Si-NC)一起進行培養(yǎng),培養(yǎng)周期為2 d。④提取PCR進行反轉(zhuǎn)錄,以Primescript和SYBR primixextaq試劑作為轉(zhuǎn)錄試劑進行轉(zhuǎn)錄效率檢測,對其轉(zhuǎn)染率進行定量的檢測和數(shù)據(jù)記錄。

2 結(jié) 果

2.1 女性滋養(yǎng)層細胞組織中miR-184表達水平 在HTR8/SVneo細胞、Swan71細胞及正常細胞中miR-184表達水平依次為3.27±0.51、1.57±0.22、1.00±0.23,比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.2 女性滋養(yǎng)層細胞組織細胞中外源性miR-184表達水平 見圖1。從結(jié)果可以看出,在正常上皮細胞中miR-184在轉(zhuǎn)染后的細胞表達水平要比轉(zhuǎn)染前低,而在女性滋養(yǎng)層細胞組織miR-184的表達水平比轉(zhuǎn)染前的要高。并且從其相對表達量的直方圖來看,相對表達量呈現(xiàn)明顯的差異,在miR-184組中表現(xiàn)更為明顯。經(jīng)2 d的轉(zhuǎn)染siR-NA后,miR-184在A549與HTR8/SVneo兩種細胞中的表達水平比在轉(zhuǎn)染之前更低(均P<0.05)。經(jīng)2 d的轉(zhuǎn)染pcDNA3．1-miR-184后,miR-184在A549細胞中的表達水平比轉(zhuǎn)染之前更高(均P<0.05)。

A為上皮組織細胞組織;B為女性滋養(yǎng)層細胞組織中miR-184的表達

2.3 miR-184表達水平對細胞增殖的作用 si-miR-184促使miR-184的表達能夠抑制HTR8/SVneo和Swan71細胞的增殖。在HTR8/SVneo細胞中,各時間段si-miR-184的吸光值與si-NC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),在A549細胞中,各時間段si-miR-184的吸光值明顯低于si-NC(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-184表達水平對細胞增殖的作用

2.4 miR-184表達水平對細胞凋亡的作用 利用si-miR-184的轉(zhuǎn)染降低miR-184的表達水平能夠阻礙女性滋養(yǎng)層細胞的凋亡作用(P<0.01),而miR-184的過度表達能夠明顯推動女性滋養(yǎng)層細胞的凋亡作用(P<0.01)。見圖3。

圖3 miR-184表達水平對細胞凋亡的作用

3 討 論

女性滋養(yǎng)層細胞凋亡是胎盤發(fā)育過程中發(fā)生的程序性細胞死亡,其潛在的調(diào)節(jié)機制負責(zé)胎盤的穩(wěn)態(tài)。這些凋亡過程的改變可導(dǎo)致胎盤功能障礙,并導(dǎo)致各種病理狀況。miRNA是破壞mRNA和(或)誘導(dǎo)翻譯抑制的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,其在胎盤形成過程中調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞凋亡中起著關(guān)鍵作用[15]。然而,在女性滋養(yǎng)層細胞凋亡過程中,miRNA參與的分子調(diào)控機制仍不清楚。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-184通過靶向髓細胞白血病基因1(MCL1)在調(diào)節(jié)HTR-8/SVneo細胞凋亡中起作用。越來越多的證據(jù)表明,miR-184在誘導(dǎo)多種細胞(主要是免疫細胞和腫瘤細胞)凋亡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。已有研究分析了miR-184在HTR-8/SVneo細胞中誘導(dǎo)凋亡,這表現(xiàn)出滋養(yǎng)層細胞的特征,滋養(yǎng)層細胞表達miR-184,在所謂的胎盤中觀察到特別強烈的表達,但在胎盤中被IUGR下調(diào)。已有研究結(jié)果表明,miR-125可能參與正常胎盤形成和妊娠相關(guān)并發(fā)癥,這些并發(fā)癥通過誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細胞凋亡而發(fā)生。

本文利用定量的反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)滋養(yǎng)層細胞組織中miR-184的表達,通過測定miR-184在HTR8/SVneo和Swan71兩種細胞中的相對表達水平作為女性滋養(yǎng)層細胞組織中miR-184表達水平[17]。測定經(jīng)2 d培養(yǎng)周期的轉(zhuǎn)染siR-NA后,miR-184在A549與HTR8/SVneo兩種細胞中的表達水平作為女性滋養(yǎng)層細胞組織細胞中外源性miR-184表達水平。在HTR8/SVneo細胞中對各時間段si-miR-184的吸光值與si-NC差異分析miR-184表達水平對細胞增殖的作用,最后通過si-miR-184的轉(zhuǎn)染方式降低miR-184的表達水平觀察對女性滋養(yǎng)層細胞的凋亡影響[18]。

從實驗結(jié)果來看,miR-184在HTR8/SVneo和Swan71兩種細胞中的相對表達水平比在正常的上皮組織細胞中更高;在A549細胞中的相對表達水平比在正常的上皮組織細胞中更低;經(jīng)2 d的轉(zhuǎn)染siR-NA后,miR-184在A549與HTR8/SVneo兩種細胞中的表達水平比在轉(zhuǎn)染之前更低。同時通過細胞增殖對比實驗,發(fā)現(xiàn)經(jīng)2 d的轉(zhuǎn)染真核表達載體pcDNA3.1的miR-184后,miR-184在A549細胞中的表達水平比轉(zhuǎn)染之前更高(均P<0.05)。 轉(zhuǎn)染miR-184促使miR-184的表達能夠抑制HTR8/SVneo和Swan71細胞的增殖[19]。 在HTR8/SVneo細胞中,各時間段si-miR-184的吸光值與si-NC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),在A549細胞中,各時間段si-miR-184的吸光值明顯低于si-NC(P<0.05);在進行的凋亡實驗中,利用si-miR-184的轉(zhuǎn)染降低miR-184的表達水平能夠阻礙女性滋養(yǎng)層細胞的凋亡作用,而miR-184的過度表達能夠明顯推動女性滋養(yǎng)層細胞的凋亡作用[20]。

綜上所述,實驗結(jié)果表明可以通過從表達水平、細胞增殖和凋亡等多方面綜合系統(tǒng)的分析了miR-184在女性滋養(yǎng)層細胞組織中的表達機制和其對細胞的增殖凋亡的影響,對后續(xù)進一步對女性滋養(yǎng)層細胞組織疾病的預(yù)防、治療和早發(fā)現(xiàn)具有非常重要的參考價值。通過抑制miR-184表達可以調(diào)控和誘導(dǎo)滋養(yǎng)層的細胞凋亡的保護作用,臨床上可以采用miR-184調(diào)節(jié)方式調(diào)控其滋養(yǎng)層細胞的凋亡來對滋養(yǎng)層細胞異常導(dǎo)致的相關(guān)疾病進行預(yù)防和治療。