馬宏恩,王 鑫,季朝紅,張 圓,魏文揚(yáng)

(西安市第九醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西 西安710054)

高血壓(Hypertension,HTN)是最常見(jiàn)的慢性心血管疾病之一,嚴(yán)重危害著人民的生命健康,同時(shí)造成了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。高血壓可由多種因素誘發(fā),如遺傳、超重和肥胖、高鈉低鉀、長(zhǎng)期精神緊張等均是導(dǎo)致高血壓的主要危險(xiǎn)因素[3-4],而高血壓又可引起中風(fēng)、心肌梗死、心力衰竭和慢性腎病等嚴(yán)重并發(fā)癥,其中在高血壓介導(dǎo)的器官損傷中,心肌肥厚對(duì)高血壓患者的病死率有著極其重要的影響[5-6]。持續(xù)高血壓可引起左心室肥厚、心肌纖維化等心肌損害,并導(dǎo)致惡性心律失常、心梗、心衰、猝死等心血管事件。目前臨床上主要通過(guò)血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、β受體拮抗劑、利尿劑等藥物治療高血壓及其并發(fā)癥,但即便如此我國(guó)高血壓引發(fā)的心血管疾病仍依然呈不斷上升的趨勢(shì)[7]。近些年越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)腦鈉肽在治療心血管疾病中具有獨(dú)特的療效。馬計(jì)等[8]在研究中發(fā)現(xiàn)腦鈉肽對(duì)高血脂大鼠心肌缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用。然而到目前為止,腦鈉肽對(duì)高血壓左心室肥厚的作用還不明確。本研究通過(guò)構(gòu)建高血壓左心室肥厚大鼠模型,并應(yīng)用外源性腦鈉肽干預(yù),檢測(cè)干預(yù)前、后心肌肥厚相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)及心肌肥厚信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵調(diào)控因子水平變化,旨在探討腦鈉肽對(duì)高血壓左心室肥厚是否具有保護(hù)作用及其作用機(jī)制,以期為高血壓左心室肥厚的臨床治療提供全新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑與儀器:重組人腦利鈉肽購(gòu)自成都諾迪康生物制藥有限公司;蛋白激酶(PKG)抑制劑KT5823購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;組織裂解液購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;蛋白激酶Ⅰ(PKG-Ⅰ)抗體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)抗體、β-actin購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京博爾西科技有限公司;血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)檢測(cè)試劑盒、Smad家族成員3(Smad3)檢測(cè)試劑盒、Ⅲ型膠原檢測(cè)試劑盒、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。MK3/Multiskan Sky GO酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾雷勃公司;LW500T生物顯微鏡購(gòu)自中國(guó)上海光電公司;生理檢測(cè)儀(MK-200ST)購(gòu)自香港生科儀有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:50只健康的清潔級(jí)雄性SD大鼠,體質(zhì)量為220～260 g,年齡為8周齡,購(gòu)買于江蘇艾菱菲生物科技有限公司。將所有大鼠常規(guī)飼養(yǎng)在動(dòng)物房中,自由飲食飲水,并適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建:隨機(jī)抽取10只大鼠作為對(duì)照組,除對(duì)照組外,其余組大鼠均參考文獻(xiàn)[9]采用腹主動(dòng)脈縮窄法進(jìn)行高血壓左心室肥厚大鼠模型構(gòu)建:大鼠腹部注射戊巴比妥鈉全身麻醉后在無(wú)菌條件下沿腹部白線開腹,在雙腎動(dòng)脈上方約5 mm處將7號(hào)針頭(直徑約0.7 mm)與腹主動(dòng)脈共同結(jié)扎,抽出針頭,使腹主動(dòng)脈縮窄約70%,縫合腹腔。觀察大鼠狀態(tài),并于造模術(shù)后2周使用血壓計(jì)測(cè)量模型組大鼠收縮壓,與造模前比較,收縮壓上升20 mmHg以上,同時(shí)收縮壓高于135 mmHg即為造模成功。

1.2.2 藥物處理與分組:將所有實(shí)驗(yàn)大鼠分為對(duì)照組、模型組、腦鈉肽組、腦鈉肽+PKG抑制劑(KT5823)組,每組10只,除對(duì)照組外,其余組均按照1.2.1高血壓左心室肥厚大鼠模型構(gòu)建方法:對(duì)照組僅進(jìn)行大鼠腹主動(dòng)脈分離,不予結(jié)扎。所有大鼠術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素20萬(wàn)單位腹腔注射抗感染,造模術(shù)后即開始給藥干預(yù)。腦鈉肽組每天通過(guò)微型泵以0.05 μg/(kg·min)的速率連續(xù)靜脈輸注腦鈉肽;腦鈉肽+KT5823組通過(guò)微型泵輸注相同劑量腦鈉肽的同時(shí)以0.01 μg/(kg·min)的速率連續(xù)靜脈輸注PKG抑制劑KT5823。造模(給藥)后2周測(cè)量各組血壓,造模(給藥)后4周處死各組大鼠,分離心肌組織。

1.2.3 各組大鼠收縮壓的測(cè)定:分別在各組大鼠造模前、造模(給藥)后2、4周采用尾袖法檢測(cè)其在安靜、清醒狀態(tài)下的收縮壓水平。

1.2.4 Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌組織PKG-Ⅰ、TGF-β1蛋白表達(dá)情況:收集各組大鼠心肌組織,加入組織裂解液,裂解各組大鼠組織,并進(jìn)行勻漿。4 ℃條件下離心(12000 r/min,5 min)后收集上清,提取總蛋白。并使用BCA法對(duì)提取的蛋白進(jìn)行定量。取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜后使用5%的脫脂奶粉在室溫下進(jìn)行封閉,2 h后加入一抗稀釋液(1∶1000),并在4 ℃條件下進(jìn)行孵育過(guò)夜,第二天使用TBS進(jìn)行清洗,然后加入IgG二抗稀釋液(稀釋比例為1∶2000),室溫下繼續(xù)孵育2 h后進(jìn)行TBS清洗,顯色后觀察各組PKG-Ⅰ、TGF-β1蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 各組大鼠LVW/TL比值的測(cè)量:收集各組大鼠心臟,取左心室及室間隔部分,用濾紙吸干水分后稱取左心室質(zhì)量(LVW),同時(shí)分離各組大鼠左脛骨并測(cè)量其長(zhǎng)度(TL),最后計(jì)算LVW/TL比值。

1.2.6 各組大鼠心肌組織血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、Smad3、Ⅲ型膠原含量的檢測(cè):取各組大鼠心肌組織,制備組織勻漿后進(jìn)行離心(3000 r/min,20 min),收集上清,然后分別使用AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原檢測(cè)試劑盒,嚴(yán)格按照操作說(shuō)明檢測(cè)各組大鼠心肌組織中AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原的含量。

1.2.7 ELISA檢測(cè)各組大鼠心肌組織ROS、MDA和SOD含量:取各組大鼠心肌組織,制備組織勻漿后進(jìn)行離心(3000 r/min,10 min),收集上清,然后分別使用ROS、MDA、SOD檢測(cè)試劑盒,嚴(yán)格按照操作說(shuō)明檢測(cè)各組大鼠心肌組織中ROS、MDA、SOD的含量。

1.2.8 MASSON法檢測(cè)各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué):收集心肌組織,使用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定,然后進(jìn)行常規(guī)石蠟切片(將固定組織脫水后進(jìn)行石蠟包埋,制備5 μm切片),最后進(jìn)行MASSON染色,觀察各組大鼠心肌組織纖維化程度。

2 結(jié) 果

2.1 腦鈉肽對(duì)各組大鼠心肌組織中cGMP/PKG信號(hào)通路的比較 由表1(圖1)可見(jiàn),與對(duì)照組比較,模型組大鼠心肌組織中TGF-β1蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05),而PKG-Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,腦鈉肽組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),而PKG-Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與腦鈉肽組比較,腦鈉肽+KT5823組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05),而PKG-Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 各組大鼠心肌組織中cGMP/PKG信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

表1 各組大鼠心肌組織中cGMP/PKG信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的比較

2.2 腦鈉肽對(duì)各組大鼠收縮壓的比較 由表2可見(jiàn),各組大鼠之間造模前收縮壓均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05);與對(duì)照組比較,模型組大鼠造模(給藥)后2、4周的收縮壓顯著上升(均P<0.05);與模型組比較,腦鈉肽組大鼠造模(給藥)后2、4周的收縮壓均顯著降低(均P<0.05);與腦鈉肽組大鼠比較,腦鈉肽+KT5823組大鼠造模(給藥)后2、4周的收縮壓顯著回升(均P<0.05)。

表2 腦鈉肽對(duì)各組大鼠收縮壓的比較(mmHg)

2.3 腦鈉肽對(duì)各組大鼠左心室LVW/TL以及心肌組織AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原含量的比較 由表3可見(jiàn),與對(duì)照組比較,模型組大鼠LVW/TL比值、Ang Ⅱ、Smad3、Ⅲ型膠原含量顯著增加(均P<0.05);與模型組比較,腦鈉肽組大鼠LVW/TL比值、Ang Ⅱ、Smad3、Ⅲ型膠原含量顯著降低(均P<0.05);與腦鈉肽組比較,腦鈉肽+KT5823組大鼠VW/TL比值、Ang Ⅱ、Smad3、Ⅲ型膠原含量顯著回升(均P<0.05)。

表3 各組大鼠LVW/TL以及心肌組織AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原含量比較

2.4 腦鈉肽對(duì)各組大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的比較 由表4可見(jiàn),與對(duì)照組比較,模型組大鼠ROS水平和MDA含量顯著增加(均P<0.05),而SOD水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,腦鈉肽組大鼠心肌組織ROS水平和MDA含量顯著降低(均P<0.05),而SOD水平明顯增加(P<0.05);與腦鈉肽組比較,腦鈉肽+KT5823組大鼠心肌組織ROS水平和MDA含量顯著增加(均P<0.05),而SOD水平明顯降低(P<0.05)。

表4 各組大鼠心肌組織ROS、MDA及SOD水平比較

2.5 腦鈉肽對(duì)各組大鼠心肌組織纖維化的比較 MASSON實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠心肌組織纖維化情況顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠心肌組織發(fā)生明顯纖維化改變,腦鈉肽干預(yù)后,大鼠心肌纖維化有所改善,而KT5823逆轉(zhuǎn)了腦鈉肽對(duì)心肌纖維化的改善作用(圖2)。

圖2 MASSON實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠心肌組織纖維化情況(MASSON染色,×300)

3 討 論

腦鈉肽與其受體結(jié)合后可激活細(xì)胞內(nèi)鳥苷酸環(huán)化酶,使三磷酸鳥苷(GTP)轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)磷酸鳥苷(cGMP),進(jìn)而激活PKG。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在PKG-Ⅰ和PKG-Ⅱ兩種同功異構(gòu)體。其中PKG-Ⅰ主要表達(dá)在心臟、腎血管、肺等組織中,它對(duì)心血管系統(tǒng)具有多種調(diào)節(jié)作用,cGMP正是通過(guò)激活PKG-Ⅰ調(diào)控大量目的蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能[10]。胡軍等[11]研究表明,cGMP/PKG信號(hào)通路的激活可對(duì)嗎啡處理后的大鼠具有心肌保護(hù)作用。且已有研究證實(shí)腦鈉肽可通過(guò)激活cGMP/PKG信號(hào)通路保護(hù)心肌組織[12]。本研究發(fā)現(xiàn):模型大鼠心肌組織中cGMP/PKG信號(hào)通路相關(guān)蛋白PKG-Ⅰ和心肌肥厚相關(guān)蛋白TGF-β1表達(dá)水平分別顯著下調(diào)和上調(diào),而腦鈉肽治療后,模型大鼠心肌組織中PKG-Ⅰ和TGF-β1表達(dá)水平分別明顯回升和回落,提示腦鈉肽可能通過(guò)調(diào)節(jié)cGMP/PKG信號(hào)通路對(duì)高血壓左心室肥厚大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。

收縮壓是心臟收縮時(shí)血液對(duì)血管內(nèi)壁的壓力,是反映機(jī)體高血壓的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究中我們發(fā)現(xiàn):模型大鼠的收縮壓顯著升高,且收縮壓高于135 mmHg,而腦鈉肽治療后,模型大鼠的收縮壓顯著降低,提示腦鈉肽對(duì)高血壓具有一定的降壓療效。研究還發(fā)現(xiàn):應(yīng)用cGMP/PKG信號(hào)通路的抑制劑KT5823處理模型大鼠后,可逆轉(zhuǎn)腦鈉肽對(duì)高血壓大鼠的降壓作用,說(shuō)明腦鈉肽對(duì)模型大鼠血壓的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)cGMP/PKG信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

心室肥厚是高血壓導(dǎo)致心臟損傷的一種主要表現(xiàn),研究已經(jīng)證實(shí)在心臟受損時(shí),AngⅡ、Smad3和Ⅲ型膠原均被激活,并誘導(dǎo)膠原蛋白加速合成,誘發(fā)心臟纖維化和心肌肥厚[13-14]。在本研究中,模型組大鼠LVW/TL比值明顯增加,同時(shí)大鼠心肌組織中AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原水平均顯著上升,心肌組織可見(jiàn)纖維化改變,提示模型大鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚;而腦鈉肽治療后,大鼠LVW/TL比值以及心肌組織中AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原水平均顯著降低,心肌纖維化有所改善,提示腦鈉肽可抑制高血壓誘發(fā)的心肌肥厚。本研究還發(fā)現(xiàn):KT5823逆轉(zhuǎn)了腦鈉肽對(duì)LVW/TL比值以及AngⅡ、Smad3、Ⅲ型膠原水平的影響,同時(shí)逆轉(zhuǎn)了腦鈉肽對(duì)模型大鼠心肌纖維化的改善作用,這些結(jié)果均表明腦鈉肽可通過(guò)調(diào)控cGMP/PKG信號(hào)通路影響高血壓左心室肥厚的進(jìn)展。

氧化應(yīng)激在整個(gè)高血壓病程中都扮演著重要的角色,氧化應(yīng)激是指當(dāng)機(jī)體受到損傷時(shí),會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的ROS,ROS如果過(guò)量或不能及時(shí)清除會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞損傷。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí),將產(chǎn)生過(guò)多的有害物質(zhì),如MDA,它是ROS攻擊體內(nèi)脂肪所產(chǎn)生的氧化物,可以引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合,引起DNA損傷,具有一定的細(xì)胞毒性,其含量的多少常被作為評(píng)價(jià)氧化損傷程度的指標(biāo)。SOD能清除體內(nèi)有害的ROS,從而減輕ROS對(duì)機(jī)體造成的損害,對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),當(dāng)合并高血壓時(shí),大鼠會(huì)發(fā)生血管氧化應(yīng)激反應(yīng),這表明氧化應(yīng)激與高血壓緊密相關(guān)[15-17]。而心肌肥厚所導(dǎo)致的缺血缺氧同樣可促使心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),產(chǎn)生更多的ROS,從而引起心肌纖維化和心室肥厚的進(jìn)一步加重[18-20],并不斷重復(fù)上述過(guò)程形成惡性循環(huán)。我們的研究發(fā)現(xiàn):模型大鼠心肌組織中ROS和MDA水平顯著增加,而SOD水平明顯降低,提示模型大鼠發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng),而腦鈉肽治療后,其ROS和MDA水平均明顯回落,且SOD水平顯著回升,提示腦鈉肽可抑制高血壓和心肌肥厚所誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)KT5823削弱了腦鈉肽對(duì)模型大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響,這表明腦鈉肽可通過(guò)調(diào)控cGMP/PKG信號(hào)通路影響高血壓左心室肥厚所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激水平。

綜上所述,腦鈉肽可通過(guò)調(diào)控cGMP/PKG信號(hào)通路降低高血壓左心室肥厚大鼠血壓,減輕其氧化應(yīng)激水平,同時(shí)改善其左心室肥厚程度。