劉俊璇,曾繼濤,何 畏

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,重慶 400038)

不孕癥的醫(yī)學(xué)定義為未避孕未孕超過1年,對8%～12%的夫婦造成了困擾[1],根據(jù)世衛(wèi)組織的統(tǒng)計,全世界有超過5000萬對夫婦患不孕不育癥,其中50%與男性因素有關(guān)[2-3]。男性不育的主要原因之一是精子發(fā)生異常,臨床上稱為少精癥或無精癥[4]。精子質(zhì)量問題導(dǎo)致男性生育力下降的現(xiàn)狀逐漸引起臨床醫(yī)生的關(guān)注,盡管對雄性生殖的研究取得了很大進(jìn)展,但我們對于少、弱精癥的機制缺乏了解,在很大的程度上阻礙了對男性不育癥的治療。

研究表明,免疫因素在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用,其中睪丸巨噬細(xì)胞作為睪丸內(nèi)數(shù)量最多的免疫細(xì)胞,在保護(hù)精子發(fā)生免受自身免疫攻擊過程中扮演著重要的角色,可維持睪丸的免疫豁免,其功能障礙將導(dǎo)致睪丸內(nèi)睪酮水平降低、不育和性欲減退,被譽為生育的守護(hù)者[5-7]。細(xì)胞發(fā)揮功能需要多種表面分子協(xié)同工作,以傳遞適當(dāng)?shù)男盘?相應(yīng)環(huán)境刺激。Ms4a家族是一組具有四個跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì),通過調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo),在調(diào)節(jié)細(xì)胞活化、生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用[8-10]。跨膜4域亞家族成員6D(Membrane-spanning4-domainssub family a member 6D,Ms4a6d)是該家族中的一員,主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞表面和樹突狀細(xì)胞等表面[11]。研究顯示Ms4a6d參與免疫受體的生物學(xué)功能的調(diào)節(jié),Ms4a6d可與巨噬細(xì)胞表達(dá)共刺激因子VSIG4(V-setandIgdomain-containing4)結(jié)合形成表面抑制信號復(fù)合物,通過介導(dǎo)JAK2-STAT3-A20信號通路的激活,從而抑制NLRP3炎性體的產(chǎn)生,可有效抑制巨噬細(xì)胞的炎癥狀態(tài)[12-13]?？紤]到巨噬細(xì)胞炎癥狀態(tài)對精子生成的重要影響,我們推測Ms4a6d同樣在精子發(fā)生過程中扮演重要的角色。我們研究Ms4a6d基因敲除小鼠模型,通過生育力比較、睪丸形態(tài)學(xué)分析和精子質(zhì)量分析,探究Ms4a6d基因缺失對雄性小鼠生育力的影響,以期為男性不育癥患者的診療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:Ms4a6d基因敲除小鼠通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建,由陸軍軍醫(yī)大學(xué)免疫教研室陳永文教授惠贈。對照組小鼠為C57BL/6野生型(Wild-type,WT),購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心(符合國家級動物標(biāo)準(zhǔn))。小鼠飼養(yǎng)條件保持一致,溫度為22～26 ℃,相對濕度50%～60%,光照周期14 L∶10 D,定期更換干凈飲用水、飼料及墊料,保持飼養(yǎng)環(huán)境的安靜、衛(wèi)生。實驗中涉及到的動物操作已得到陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物福利倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑儀器:動物睪丸組織固定液(Servicebio,貨號:G1121),F12培養(yǎng)基(Thermo,貨號:31765035),Krebs-Ringer緩沖液(Solarbio,貨號:G0430),一抗MCSFR(Servicebio,貨號:GB111205),熒光二抗CY3山羊抗兔(Servicebio,貨號:GB21303),PCR試劑盒(重慶繹恒生物技術(shù)有限公司),HE染色試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),PCR儀及電泳儀(美國Bio-Rad公司),臺式低溫離心機(美國Thermo公司),M8光學(xué)顯微鏡(北京萬邦君意商貿(mào)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠基因型鑒定:取小鼠耳部組織5 mm,剪碎后加入裂解液,56 ℃水浴過夜,采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA,以提取DNA為模板,鑒定野生型基因所用引物(引物F:5’-CATGTCCAGACTGTAAGCGCCACT-3,引物R:5’-TGTATTGGCCTG-ACTAAAGCAGAAATCA-3’),鑒定敲除基因所用引物(引物F:5’CATGTCCAGACTGTAAGCGCCACT,引物R:5’-TGTGGAGAAGCACCTGAATGCAGA-3’),冰上配置25 μl反應(yīng)體系(DNA提取液1 μl,引物F 1 μl,引物R 1 μl,2×Taq PCR Mix12.5 μl,ddH2O補至25 μl),PCR擴增條件:(94 ℃ 3 min→94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s)×30個循環(huán)→72 ℃ 1 min→72 ℃ 5 min,經(jīng)PCR儀擴增后取部分反應(yīng)產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳后拍照分析,鑒定小鼠的基因型。其中引物設(shè)計原理:選取Ms4a6d的外顯子2和3作為作用靶點(圖1A),在靶點兩側(cè)分別設(shè)計引物F和引物R用于擴增野生型基因(長度3678 bp),進(jìn)一步在作用靶點外側(cè)和兩作用靶點之間設(shè)計引物F和引物Wt/He-R用于擴增敲除基因(長度602 bp)(圖1A)。

A:基因敲除及引物設(shè)計策略示意圖;B:鑒定野生型和陽性純雜合子;C:鑒定陽性純合子與雜合子

1.2.2 睪丸巨噬細(xì)胞免疫熒光染色:取出動物睪丸組織固定液固定的睪丸組織樣本;依次經(jīng)梯度脫水,透明,浸蠟,包埋制成石蠟塊;石蠟切片脫蠟至水,組織切片置于盛滿EDTA(pH8.0)抗原修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。采用BSA封閉30 min,一抗4 ℃孵育過夜(一抗稀釋比,MCSFR 1∶200),PBS漂洗3次,每次5 min,二抗室溫孵育1 h(二抗稀釋比,CY3山羊抗兔1∶300),PBS漂洗3次,每次5 min,DAPI復(fù)染細(xì)胞核10 min,加入自發(fā)熒光猝滅劑,封片后顯微鏡下觀察并采集圖像。每組隨機選取5個視野,使用Image J對圖像進(jìn)行平均熒光強度分析。

1.2.3 小鼠生育力檢測:取經(jīng)過鑒定的8～10周齡Ms4a6d-/-雄鼠10只,以1∶2的比例與育齡期WT雌鼠合籠,每天清晨和下午各檢查一次雌鼠的陰道栓形成情況,見到陰道栓后即視為交配完成,取出雌鼠單獨飼養(yǎng)直至分娩。如未觀察到陰道栓則繼續(xù)合籠,直至交配成功后取出雌鼠單獨飼養(yǎng),統(tǒng)計雌鼠懷孕率和產(chǎn)仔數(shù)。同法選取健康野生型雄鼠作為對照。

1.2.4 小鼠睪丸指數(shù)測定與組織病理學(xué)分析:小鼠睪丸指數(shù)測定:取8～10周齡的Ms4a6d-/-雄鼠和WT雄鼠各5只,處死小鼠后電子天平稱量小鼠體重并記錄。迅速用眼科剪剪開腹部,解剖取得小鼠雙側(cè)睪丸,吸水紙上吸干后采用電子天平稱重,將Ms4a6d-/-雄鼠及WT雄鼠睪丸置于同一直尺下對比形態(tài)大小,拍照保存。將一側(cè)睪丸置入睪丸組織固定液固定48 h,繼續(xù)后續(xù)實驗,另一側(cè)睪丸經(jīng)液氮冷凍后放于-80 ℃保存?zhèn)溆?。小鼠睪丸器官指數(shù)計算公式如下:睪丸器官指數(shù)(%)=睪丸質(zhì)量(g)/體重(g)×100%。

石蠟切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水、染色、脫水、封片等環(huán)節(jié),完成HE染色切片,顯微鏡下觀察并拍照。采用View Point BETA軟件測量曲細(xì)精管管腔直徑及管腔厚度,分別計數(shù)生精小管中的支持細(xì)胞、精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞。

1.2.5 小鼠精子參數(shù)檢測:取8～10周齡經(jīng)鑒定的Ms4a6d-/-雄鼠和WT雄鼠各5只,處死小鼠并消毒腹部后用眼科剪分離雙側(cè)附睪尾,分離除去多余脂肪組織后,放入經(jīng)37 ℃預(yù)熱的Krebs-Ringer Buffer中,用1 ml注射器針頭小心劃開附睪,37 ℃熱臺上放置5 min待精子充分從附睪尾中釋放,充分吸取上清液置于1.5 ml EP管中,37 ℃水浴保存。使用計算機輔助精子分析系統(tǒng)進(jìn)行小鼠精子參數(shù)檢測,每次檢測至少達(dá)到5個視野和200條以上的精子。分析精子數(shù)量、活率及精子運動情況:包括前向運動精子數(shù)(PR)、平均曲線運動速率(VCL)、平均直線運動速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)、運動的前向性(STR)、精子平均鞭打頻率(BCF)、精子平均頭部側(cè)擺幅值(ALH)等。

2 結(jié) 果

2.1 Ms4a6d-/-雄鼠基因型鑒定 以雄性小鼠DNA為模板,配制反應(yīng)體系,經(jīng)PCR擴增后采用1%瓊脂糖凝膠電泳曝光,引物設(shè)計原理圖1A。鑒定小鼠基因型電泳結(jié)果:泳道7無680 bp條帶,為野生型(圖1B),其中泳道1、2、3、4、5、6泳道中DNA條帶在680 bp附近,可能為陽性純合子或雜合子,泳道5、6的DNA條帶在602 bp附近,表示雜合子,泳道1、2、3、4無602 bp條帶,表示純合子(圖1C)。

2.2 Ms4a6d-/-成年雄鼠睪丸巨噬細(xì)胞的檢測 免疫熒光染色結(jié)果顯示,與WT雄鼠相比,Ms4a6d-/-雄鼠睪丸間質(zhì)區(qū)域及曲細(xì)精管MCSFR平均熒光強度顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖2。

A:MCSFR免疫熒光染色結(jié)果;B:MCSFR平均熒光強度統(tǒng)計結(jié)果(n=5)。注:與WT組比較,*P<0.05

2.3 Ms4a6d-/-雄鼠的生育力檢測 Ms4a6d-/-雄鼠對應(yīng)雌鼠受孕率為65%,低于WT雄鼠對應(yīng)雌鼠的90%,兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),Ms4a6d-/-雄鼠與WT雄鼠對應(yīng)的雌鼠平均產(chǎn)仔數(shù)分別為(2.5±2.1)只、(7.1±3.1)只,Ms4a6d-/-雄鼠子代數(shù)目顯著低于WT小鼠,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

2.4 Ms4a6d-/-成年雄鼠睪丸發(fā)育及組織病理學(xué)改變 將Ms4a6d-/-雄鼠和WT雄鼠處死后解剖取出完整的睪丸,清理周圍附睪組織后置于直尺旁拍照觀察,結(jié)果顯示Ms4a6d-/-雄鼠睪丸相較于WT雄鼠睪丸體積顯著減少(圖3A),對兩組小鼠進(jìn)行稱重,計算睪丸器官指數(shù),發(fā)現(xiàn)Ms4a6d-/-雄鼠體重(20.12±0.99)g,與WT雄鼠體重(19.15±0.37)g無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖3B),Ms4a6d-/-雄鼠睪丸質(zhì)量(0.06±0.01)g,明顯低于WT鼠睪丸質(zhì)量(0.08±0.01)g(P<0.05)(圖3C),而Ms4a6d-/-雄鼠的睪丸器官指數(shù)(0.29±0.05)%明顯低于WT雄鼠(0.42±0.04)%(P<0.05)(圖3D)。石蠟切片HE染色結(jié)果顯示與WT組小鼠相比,Ms4a6d-/-小鼠睪丸組織中生精小管內(nèi)精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞明顯減少,僅見少量支持細(xì)胞,生精小管直徑縮小,生精細(xì)胞缺失,部分生精上皮空泡化(圖3E、3F),見表2。

表2 小鼠睪丸生精小管上皮及單個生精小管橫截面上各種細(xì)胞數(shù)量比較

2.5 Ms4a6d-/-雄鼠精子參數(shù)檢測 取Ms4a6d-/-雄鼠和WT小鼠,獲取附睪尾精子,利用計算機輔助精子分析技術(shù)(CASA)分析精子參數(shù),顯微鏡下見Ms4a6d-/-雄鼠精子數(shù)量明顯少于WT雄鼠;分析數(shù)據(jù)顯示,Ms4a6d-/-雄鼠的精子濃度為(2.30±2.49)×106/ml,WT組為(14.91±3.95)×106/ml,Ms4a6d-/-雄鼠精子濃度相較于WT雄鼠顯著降低(P<0.05),精子運動參數(shù)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組精子參數(shù)比較

3 討 論

Ms4a家族作為一類新發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)的膜蛋白,在與不同免疫受體相互作用和調(diào)節(jié)信號通路中發(fā)揮著重要作用。盡管該家族功能如此重要,但目前對于該家族的研究主要集中在Ms4a1、Ms4a2和Ms4a4A等成員,仍有許多Ms4a蛋白的功能特點不為人知,特別是Ms4a6d,很少有關(guān)于該成員的文獻(xiàn)報道[14-15]。本實驗室在對Ms4a6d-/-雄性小鼠的飼養(yǎng)過程中,發(fā)現(xiàn)該動物模型小鼠出現(xiàn)生育能力下降等現(xiàn)象,眾所周知,巨噬細(xì)胞在雄性精子發(fā)生中發(fā)揮著重要作用,而Ms4a6d基因主要在巨噬細(xì)胞表面表達(dá),因此我們推測Ms4a6d基因可能通過巨噬細(xì)胞參與小鼠生殖的調(diào)控。我們希望進(jìn)一步驗證Ms4a6d基因在雄性生殖中的作用,以期發(fā)現(xiàn)該基因的功能,為男性不育癥的診療提供新的思路。

本研究中的Ms4a6d-/-雄鼠通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建而成,該技術(shù)根據(jù)目的基因序列,設(shè)計向?qū)NA,在其介導(dǎo)下即可實現(xiàn)定向基因打靶。具有簡單快捷,靶向效率高,不需要胚胎干細(xì)胞,可以在絕大多數(shù)生物中應(yīng)用等優(yōu)點,是近年來研究基因特點的常用技術(shù)[16-17]。本實驗所用Ms4a6d-/-實驗小鼠均通過敲除小鼠繁育而來,剪取新生代小鼠耳部組織提取DNA,經(jīng)PCR擴增后行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型鑒定,經(jīng)基因型鑒定的小鼠納入后續(xù)實驗中。

在本次研究中我們將Ms4a6d-/-雄鼠與野生型雄鼠分別與育齡期雌鼠合籠交配,結(jié)果顯示Ms4a6d-/-雄鼠對應(yīng)的雌鼠產(chǎn)仔數(shù)明顯低于WT組,表明Ms4a6d-/-雄鼠的生育能力下降。免疫熒光染色結(jié)果表明Ms4a6d基因敲除導(dǎo)致雄鼠睪丸巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少。接著我們對比發(fā)現(xiàn)Ms4a6d-/-雄鼠睪丸體積小于WT鼠,同時睪丸器官指數(shù)減小,為探索小鼠精子數(shù)量的改變是否與其中的細(xì)胞組成變化具有相關(guān)性,我們將WT與Ms4a6d-/-雄鼠睪丸進(jìn)行石蠟組織切片及HE染色,結(jié)果顯示Ms4a6d-/-雄鼠睪丸生精小管直徑及管腔厚度均明顯減少,支持細(xì)胞,精原細(xì)胞,初級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞均減少。睪丸是精子發(fā)生的主要場所,睪丸的體積及組織結(jié)構(gòu)與生精能力具有一定的相關(guān)性[18],因此我們合理的猜測Ms4a6d-/-雄鼠的精子發(fā)生或成熟可能受到一定的影響?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果和假設(shè),我們對小鼠附睪尾精子進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示Ms4a6d-/-雄鼠附睪尾的精子濃度顯著降低,精子運動能力無明顯差異。上述結(jié)果表明Ms4a6d的缺失導(dǎo)致雄性小鼠生精功能受損。研究表明精子的發(fā)生需要免疫抑制微環(huán)境,睪丸炎癥狀態(tài)可導(dǎo)致精子發(fā)生障礙,精子數(shù)量減少。由于血睪屏障的存在,睪丸被認(rèn)為是免疫特權(quán)器官,對炎癥反應(yīng)具有抵抗力,實際上睪丸可受自身免疫性炎癥的影響,處于免疫和抑制免疫之間的微妙平衡[19]。研究表明Ms4a6d與VSIG4相互作用形成表面信號復(fù)合體,從而抑制炎癥因子Nlrp3和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的生成。推測Ms4a6d基因的敲除會導(dǎo)致炎癥因子表達(dá)增多,影響睪丸免疫抑制狀態(tài),引起精子生成受損,進(jìn)而對生育能力造成影響[13]。

精子發(fā)生始于精原干細(xì)胞,通過減數(shù)分裂和一系列形變成為精子,這一過程受到復(fù)雜的調(diào)控。巨噬細(xì)胞是睪丸內(nèi)數(shù)量最多的免疫細(xì)胞,主要分布在睪丸間質(zhì)及曲細(xì)精管周圍,睪丸巨噬細(xì)胞被認(rèn)為通過對精原干細(xì)胞的影響干預(yù)精子的生成[20]。研究顯示巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生部分集落刺激因子(CSF1),而CSF1被認(rèn)為可單獨或與其他調(diào)節(jié)因子一起共同促進(jìn)精原干細(xì)胞的增殖和自我更新缺乏CSF1的小鼠表現(xiàn)為不育及精子減少[21]。此外,巨噬細(xì)胞表達(dá)ALDH1A2和RDH10,兩者都是維甲酸(RA)合成所需要的關(guān)鍵生物酶,而RA被認(rèn)為可促進(jìn)精原細(xì)胞分化并啟動減數(shù)分裂,在生精過程中發(fā)揮重要功能,通過耗竭RA可導(dǎo)致精子分化發(fā)生在初始階段,巨噬細(xì)胞可通過CSF1和RA干預(yù)精子的生成[22-24]。本次研究通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)Ms4a6d-/-雄鼠的睪丸間質(zhì)巨噬細(xì)胞和管周巨噬細(xì)胞數(shù)量受到影響,這可能是導(dǎo)致雄鼠生育能力下降,精子生成減少的原因。具體的影響機制需要后續(xù)實驗進(jìn)一步研究論證。

我國男性不育癥的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢,其中精子質(zhì)量是導(dǎo)致男性不育的關(guān)鍵因素[25-27]。精子發(fā)生受到多種基因表達(dá)的調(diào)控,與精子發(fā)生直接相關(guān)的基因出現(xiàn)表達(dá)異?？赡軙鹉行圆挥齕28-29],目前仍有大量的男性不育癥患者病因未知,給臨床診療帶來了很大的困擾。本次研究發(fā)現(xiàn)Ms4a6d基因敲除告知雄性小鼠生育力下降,Ms4a6d通過何種途徑干預(yù)巨噬細(xì)胞功能,進(jìn)而調(diào)控精子發(fā)生影響生育力,有待進(jìn)一步探究。