劉天牧,滕 玥

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院急診醫(yī)學科,遼寧 沈陽110016)

慢性心力衰竭是較為常見的心血管疾病,因心臟功能或結(jié)構(gòu)受損引起心室充盈、射血能力減弱,造成心功能不全的臨床綜合征,涉及各種器官,具有復雜性,主要表現(xiàn)為呼吸困難、疲勞、陣發(fā)咳嗽、運動耐量減低、體液潴留等,嚴重威脅了患者的生命安全[1-3]。微小RNA-203(micro RNA-203,miR-203)位于人染色體14q32-33處,與多種心臟相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān),上調(diào)該表達會減輕心肌組織炎癥,減少心肌損傷,有利于病情的好轉(zhuǎn)和改善預后[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1/叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(Sirt1/Foxo1)通路在慢性心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,通過心臟電脈沖的產(chǎn)生、傳導來調(diào)節(jié)心臟功能,還可調(diào)節(jié)機體的氧化應激、發(fā)揮抗炎作用,進而促進病況的改善[5]?；诖?本文將研究基于Sirt1/Foxo1通路上調(diào)miR-203對慢性心力衰竭大鼠的干預效果,為慢性心力衰竭的臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取45只SD健康大鼠,由賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司提供。年齡7～9周齡,飼養(yǎng)溫度22～26 ℃,室內(nèi)濕度35%～55%。定期對其進行紫外線消毒,每天保持12 h光照,喂飲純凈水,可自由活動,飼養(yǎng)時間為一周。本次實驗操作均嚴格參照動物實驗倫理要求相關(guān)規(guī)定進行,且獲得我學院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與建模:選取45只SD大鼠,隨機選中10只作為對照組,其余參照左冠狀動脈結(jié)扎術(shù)建立慢性心力衰竭模型[6],具體步驟如下:分別于腹腔注射10%水合氯醛(20221014-2)麻醉,剪除手術(shù)區(qū)域體毛,插入氣管,連接呼吸機,使用碘酒消毒,于左側(cè)第4肋間作為手術(shù)切口,依次分離肌肉、肋間隙,打開胸腔,暴露心臟,找到冠狀動脈的左前位置降支,使用帶線縫合針結(jié)扎(對照組大鼠只做穿線不結(jié)扎),建模成功的標準:心電圖顯示ST段升高,且結(jié)扎部位以下心肌為蒼白色。共有30只大鼠建模成功,分為模型組10只、下調(diào)組10只、上調(diào)組10只。術(shù)后均連續(xù)3 d腹腔注射青霉素(20221102-8)來預防感染。

1.2.2 miR-203轉(zhuǎn)染:對照組和模型組每天給予等量0.9%氯化鈉溶液;下調(diào)組大鼠使用8 μl miR-203 inhibitor慢病毒注射轉(zhuǎn)染;上調(diào)組大鼠攜帶8 μl miR-203 mimics慢病毒注射轉(zhuǎn)染,觀察大鼠的情況變化。

1.3 指標觀察

1.3.1 樣本采集:于miR-203轉(zhuǎn)染后,采集大鼠的靜脈血4 ml,以離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速2000 r/min離心處理15 min,分離上層血清,保存于-20 ℃。于干預4周后采用斷頭法處死大鼠,將心肌組織置于-80 ℃冰箱,待檢。

1.3.2 miR-203轉(zhuǎn)染效率鑒定:于miR-203轉(zhuǎn)染后,取大鼠心肌組織,采用RT-PCR法鑒定miR-203的轉(zhuǎn)染效率,提取總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用Primer 5.0軟件設(shè)計miR-203、GAPDH引物序列,啟動PCR儀,反應體系:上下游引物各0.5 μl、cDNA(20 ng/μl)模板、2×SYBRMi×10 μl,加蒸餾水至20 μl。反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 205 s,共進行40個循環(huán),采用2-ΔΔCt方法計算出miR-203的表達量。miR-203上游引物序列:5’-CCTGATGCTAACCTGATGCA-3’,下游引物序列:5’-CTGTAACTAGCTGAGCTGAC-3’。試劑盒由上海研卉生物科技有限公司提供。

1.3.3 HE染色處理:取出大鼠的心肌組織,將其放入10%的多聚甲醛浸泡和固定12 h,進行常規(guī)的石蠟包埋和制作厚度為4～5 μm的石蠟切片,使用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色,借助顯微鏡儀器來觀察大鼠的心肌組織病理變化。

1.3.4 心臟功能指標、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)、醛固酮(Aldosterone,ALD)、炎性因子、氧化應激指標檢測:借助小動物超聲心電圖機(武漢偉思生物科技有限公司)測定各組大鼠的心臟功能,包括心室射血分數(shù)(Ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短軸收縮率(Short-axis contraction rate of the left ventricle,LVFS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(Left ventricular end diastolic dimension,LVIDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular end-systolic dimension,LVIDS)水平。

采用ELISA法檢測AngⅡ、ALD、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-1β(Interleukin-1 β,IL-1β)、過氧化氫(Hydrogen peroxide,H2O2)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)水平,先用碳鹽酸緩沖液稀釋抗體至適合濃度,在反應孔加0.1 ml,保存于冰箱4 ℃過夜,次日棄去,反復洗滌3次,加稀釋的樣品至反應孔,封存好溫育(37 ℃/60 min),孔中加入酶標抗體(37 ℃/30 min),洗滌。加TMB底物溶液0.1 ml,使其顯色,15 min后加入終止液0.05 ml,將其置于白色背景,觀察并測定各孔吸光值,進而檢測出AngⅡ、ALD、TNF-α、IL-6、IL-1β、H2O2、MDA、GSH-PX、SOD水平,儀器購自上海淳麥生物科技有限公司,其檢測步驟均由專業(yè)人員按照說明書進行。

1.3.5 Sirt1/Foxo1蛋白表達量檢測:采用Western blot檢測,取0.5 g心肌組織,剪碎后加入600 μl組織裂解液,以12000 r/min離心6 min,提取上層清液,使用BCA法檢測蛋白濃度。每個樣品提取15 μg蛋白,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳處理,轉(zhuǎn)入PVDF膜,常溫下密封90 min,加入一抗過夜(保持4 ℃)。第2天取出后進行沖洗,再加入二抗,60 min后洗滌、顯色,用成像儀器顯影保存圖片,使用軟件計算灰度值,采用GAPDH作為內(nèi)參蛋白,從而測定Sirt1/Foxo1蛋白的表達量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠組織學觀察 對照組大鼠的心肌組織完整,細胞結(jié)構(gòu)規(guī)則,排列有序;模型組大鼠的心肌組織輪廓不清或破碎,細胞排列紊亂,伴有炎癥細胞浸潤;下調(diào)組大鼠心肌組織破碎嚴重,細胞雜亂,有大量炎癥細胞;上調(diào)組大鼠的心肌結(jié)構(gòu)破壞程度明顯改善,細胞較為完整,炎癥細胞明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠組織學觀察(HE染色,×200)

2.2 各組大鼠miR-203轉(zhuǎn)染效率鑒定 與對照組比較,模型組、下調(diào)組、上調(diào)組miR-203表達量均降低,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與模型組比較,下調(diào)組miR-203表達量降低,上調(diào)miR-203表達量升高,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與下調(diào)組比較,上調(diào)組miR-203表達量升高,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠miR-203轉(zhuǎn)染效率鑒定

2.3 各組大鼠心臟功能指標比較 與對照組比較,經(jīng)干預2、4周后模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠的LVEF、LVFS水平均降低,LVIDD、LVIDS水平均升高,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05);與模型組比較,經(jīng)干預2、4周后下調(diào)組大鼠的LVEF、LVFS水平均降低,LVIDD、LVIDS水平均升高,上調(diào)組大鼠的LVEF、LVFS水平均升高,LVIDD、LVIDS水平均降低,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與下調(diào)組比較,經(jīng)干預2周、4周后上調(diào)組大鼠的LVEF、LVFS水平均升高,LVIDD、LVIDS水平均降低,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心臟功能指標比較

2.4 各組大鼠血清AngⅡ、ALD水平比較 與對照組比較,經(jīng)干預2、4周后模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠的AngⅡ、ALD水平均升高,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與模型組比較,經(jīng)干預2、4周后下調(diào)組大鼠的AngⅡ、ALD水平均升高,上調(diào)組大鼠的AngⅡ、ALD水平均降低,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與下調(diào)組比較,經(jīng)干預2、4周后上調(diào)組大鼠的AngⅡ、ALD水平均降低,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清AngⅡ、ALD水平比較(ng/L)

2.5 各組大鼠炎癥因子指標比較 與對照組比較,經(jīng)干預2、4周后模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠的TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與模型組比較,經(jīng)干預2、4周后下調(diào)組大鼠的TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高,上調(diào)組大鼠的TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與下調(diào)組比較,經(jīng)干預2、4周后上調(diào)組大鼠的TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠炎癥因子指標比較

2.6 各組大鼠氧化應激指標比較 與對照組比較,經(jīng)干預2、4周后模型組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠的H2O2、MDA水平均升高,GSH-PX、SOD水平均降低,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與模型組比較,經(jīng)干預2、4周后下調(diào)組大鼠的H2O2、MDA水平均升高,GSH-PX、SOD水平均降低,上調(diào)組大鼠的H2O2、MDA水平均降低,GSH-PX、SOD水平均升高,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與下調(diào)組比較,經(jīng)干預2、4周后上調(diào)組大鼠的H2O2、MDA水平均降低,GSH-PX、SOD水平均升高,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠氧化應激指標比較

2.7 各組大鼠Sirt1/Foxo1信號通路蛋白相對表達量比較 與對照組比較,模型組、下調(diào)組、上調(diào)組Sirt1表達量降低,Foxo1表達量均升高,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與模型組比較,下調(diào)組Sirt1表達量降低,Foxo1表達量均升高,上調(diào)組Sirt1表達量升高,Foxo1表達量均降低,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與下調(diào)組比較,上調(diào)組Sirt1表達量升高,Foxo1表達量均降低,具有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠Sirt1/Foxo1信號通路蛋白相對表達量比較

3 討 論

慢性心力衰竭具有較高的發(fā)病率和病死率,隨著人口老齡化的加劇,發(fā)病率呈升高趨勢,且多繼發(fā)與高血壓病、冠心病、心肌病等,發(fā)病機制較為復雜,且早期癥狀不明顯,病情發(fā)展會造成心肌收縮功能障礙、心肌組織結(jié)構(gòu)改變及代謝紊亂,導致死亡的發(fā)生,因此需要引起我們的重視,防止病情惡化[7-9]。

慢性心力衰竭的主要生理改變?yōu)樾呐K功能的降低,伴有嚴重程度不同的炎癥反應,LVEF、LVFS、LVIDD、LVIDS是衡量心功能的常用指標,TNF-α、IL-6、IL-1β是重要的炎癥因子,參與心肌細胞的壞死和心肌纖維化,影響心肌重構(gòu),造成心肌損傷[10-11]。同時該病的發(fā)生會激活腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng),使心輸出量下降,加快腎素分泌,致使AngⅡ升高,進而促進ALD的合成與分泌,發(fā)生心肌纖維化,加重心室重構(gòu)[12-13]。本文研究發(fā)現(xiàn),AngⅡ、ALD、TNF-α、IL-6、IL-1β均高表達于慢性心力衰竭模型大鼠,上調(diào)miR-203能夠降低AngⅡ、ALD、TNF-α、IL-6、IL-1β水平,減輕炎癥反應,保護心臟功能。相關(guān)學者研究發(fā)現(xiàn),炎癥反應在發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,主要表現(xiàn)為TNF-α、IL-6、IL-1β的過度釋放,引起炎癥細胞的聚集、浸潤,造成心肌細胞受損,降低心臟功能,此外炎癥因子水平越高說明病情越嚴重[14]。miR-203與心肌損傷有關(guān),上調(diào)其表達可促進心肌組織炎癥的消散,抑制病情的發(fā)展[15]。表明上調(diào)miR-203可抑制炎癥因子的釋放,使得心肌受損減少,改善心臟功能。

研究顯示,氧化應激的過度激活與慢性心力衰竭密切相關(guān),是心肌功能發(fā)生障礙的重要因素之一[16]。H2O2是活性氧的重要組成部分,MDA水平可體現(xiàn)心肌組織中氧自由基的含量變化,GSH-PX、SOD是機體重要的抗氧化酶,能夠有效清除氧自由基[17-18]。本文研究顯示,上調(diào)miR-203可使H2O2、MDA水平均降低,GSH-PX、SOD水平升高,有效減輕了機體的氧化應激。相關(guān)研究學者發(fā)現(xiàn),在正常生理狀態(tài)下機體的氧化與抗氧化系統(tǒng)保持相對平衡,當發(fā)生慢性心力衰竭時,受到刺激會打破平衡,GSH-PX、SOD水平降低,抗氧化能力減弱,H2O2水平升高引起心肌細胞肥大和凋亡,氧化應激的水平可反映病情的嚴重程度,應激反應越強,抗氧化作用越弱,加重氧化還原狀態(tài)失衡,造成心肌損傷,使病情進一步惡化[19]。該研究與本文研究較為一致,表明上調(diào)miR-203能夠改善氧化應激反應,減輕心肌損傷。

Sirt1/Foxo1是調(diào)控炎癥反應、氧化應激的關(guān)鍵信號通路,在慢性心力衰竭中有重要的調(diào)控作用[20]。Sirt1屬于一種組蛋白去乙?；?通過參與炎癥、氧化應激等過程達到對心血管的保護目的,還可調(diào)節(jié)Foxo1水平,減輕心肌損傷[21]。本研究發(fā)現(xiàn),在慢性心力衰竭模型大鼠中Sirt1/Foxo1通路處于抑制狀態(tài),上調(diào)miR-203可使Sirt1升高,Foxo1降低,激活該通路。相關(guān)學者發(fā)現(xiàn),Sirt1水平降低會減弱對心肌細胞的保護作用,進而誘發(fā)心功能疾病[22]。該研究與本研究結(jié)果一致,表明激活Sirt1/Foxo1可改善炎癥反應、氧化應激,使病情得到控制。

綜上所述,在對慢性心力衰竭大鼠miR-203干預后,有效抑制炎癥反應,調(diào)節(jié)氧化應激,促進心臟功能的恢復,其作用機制可能與Sirt1/Foxo1信號通路被激活有關(guān)。