劉龍梅,石懿玉,楊 霞,介 希,連婷婷,王仲朝,韓學(xué)斌

(山西省心血管病醫(yī)院/研究所 山西醫(yī)科大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院,山西 太原 030024)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是臨床常見(jiàn)的危急重癥疾病,是由急性持續(xù)性冠狀動(dòng)脈缺血、缺氧造成部分心肌急性壞死引起的嚴(yán)重冠心病,其基本特征表現(xiàn)為起病急、進(jìn)展快、預(yù)后差,目前已經(jīng)成為引起我國(guó)居民死亡的最主要疾病之一[1]。盡早恢復(fù)急性心肌梗死患者正常血供可使心肌缺血減輕,但可能導(dǎo)致再灌注損傷,加快心肌細(xì)胞壞死,嚴(yán)重者可發(fā)生惡性心律失常甚至死亡,因此治療急性心肌梗死時(shí)要重視心臟保護(hù)[2]。通過(guò)心肌修復(fù),對(duì)抗心肌凋亡,對(duì)于AMI治療有積極的意義。Li等[3]發(fā)現(xiàn),miRNA-34a在心臟中高度表達(dá),miRNA-34a通過(guò)對(duì)相關(guān)靶基因的表達(dá)調(diào)控,參與多種病理生理過(guò)程,與血管損傷和細(xì)胞凋亡均有密切的關(guān)系[4]。之前有研究表明[5-6],微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)參與AMI后心肌修復(fù),RNA納米技術(shù)在心肌修復(fù)靶向治療中的應(yīng)用報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)選取含有antimiR-34a的納米顆粒(Nanoparticles,NP)干預(yù)缺氧24 h后的原代小鼠心肌細(xì)胞,觀察其在急性缺氧小鼠心肌細(xì)胞心肌修復(fù)中的作用與影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 C57BL/6J小鼠購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。PNUTS、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。antimiR-34a納米顆粒購(gòu)自美國(guó)Nanobio Delivery Pharmaceutical有限公司。miScript SYBR Green試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。Western blot試劑、流式細(xì)胞測(cè)試試劑盒購(gòu)自山西賽奧生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定:C57BL/6J雌雄小鼠自然繁殖,取2～4 d齡小鼠乳鼠,75%乙醇消毒,剪開(kāi)胸部迅速取出心臟,預(yù)冷D-Hanks液中將心室剪成1 mm3碎片,加5 ml消化液,室溫靜置5 min后棄上清,再加5 ml消化液,室溫靜置20 min后,將未完全消化的心臟碎片吸到另一個(gè)無(wú)菌離心管中,加入2 ml預(yù)冷培養(yǎng)液終止消化,1000 r/min離心5 min后棄上清,沉淀中加入D-Hanks液3 ml,1500 r/min離心10 min后棄上清,沉淀物加培養(yǎng)液2 ml,用吸管吹打成懸液,吸到細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),37 ℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)[7]。將培養(yǎng)成熟的心肌細(xì)胞接種于玻底培養(yǎng)皿中,固定液12 min,PBS清洗,0.2%Triton X-100室溫通透 5 min,PBS清洗。5%羊血清室溫封閉2 h,加1∶100稀釋好的rat anti-mouse α-actin antibody,封膜4 ℃過(guò)夜。第2天PBS清洗,加1∶200稀釋好的goat anti-rat IgG二抗,37 ℃避光孵育1 h。棄去后加PBS清洗3次,每次10 min,加DAPI,封片,熒光顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù),計(jì)算純度。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組:采用隨機(jī)數(shù)表將其分為三組:對(duì)照組(Control組,C組)、急性缺氧組(Ischemia組,I組)、急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組(Ischemia+antimiR-34a NP組,I+NP組)。缺氧使用厭氧包與細(xì)胞一起孵育。于缺氧前60 min在培養(yǎng)液中加入antimiR-34a納米顆粒。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測(cè)miR-34a的表達(dá):使用無(wú)RNA酶的槍頭和離心管,Trizol法抽提總RNA,使用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度及純度,將終濃度定為100 ng/μl。反應(yīng)體系為:miScriptHispct(5×)4 μl,miScriptNucleics(10×)2 μl,miScript Reverse Transcriptase 2 μl,RNA 模板12 μl。逆轉(zhuǎn)錄條件:37 ℃ 60 min,95 ℃ 10 min。最后加入80 μl ddH2O水稀釋。按照試劑盒進(jìn)行qPCR反應(yīng),反應(yīng)體系10 μl:預(yù)加熱95 ℃ 30 min,變性94 ℃ 15 s,退火55 ℃ 30 s,延伸70 ℃30 s,共40個(gè)循環(huán)。Ct值為反應(yīng)孔的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)。采用U6作為內(nèi)參,miR-34a相對(duì)表達(dá)量為2-ΔΔCt=CtmiR-34a-CtU6。miR-34a引物5’-TGACTGGCAGTGTCTTAGCT-3’,內(nèi)參U6引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測(cè)PNUTS蛋白的表達(dá):使用RIPA提取液,加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,4 ℃勻漿,取上清,BSA法定量,8% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加一抗anti-PNUTS抗體和內(nèi)參anti-GAPDH抗體4 ℃搖床過(guò)夜,1×TBST洗膜3次后加入二抗,再次1×TBST洗膜3次后,ECL發(fā)光,凝膠成像系統(tǒng)曝光,Image J分析條帶灰度值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)凋亡:消化離心收集細(xì)胞至離心管中,PBS洗2遍,每管加入500 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,每管加入5 μl Annexin V-FITC和10μl PI染料,混勻,室溫避光孵育5 min,過(guò)膜,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及其鑒定 通過(guò)細(xì)胞免疫熒光,加入α-actin一抗檢測(cè)原代心肌細(xì)胞,鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)成熟的小鼠心肌細(xì)胞,純度在95%以上。通過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明,缺氧組miR-34a表達(dá)增加,相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。加入了antimiR-34a納米顆粒后,抑制了細(xì)胞內(nèi)miR-34a的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠心肌細(xì)胞miR-34a表達(dá)(細(xì)胞免疫熒光染色,×200)

2.2 小鼠心肌細(xì)胞miR-34a擴(kuò)增倍數(shù) 對(duì)照組(C組)的miR-34a擴(kuò)增倍數(shù)是(1.02±0.04)。與C組相比,急性缺氧組(I組)的miR-34a擴(kuò)增倍數(shù)為(2.07±0.18)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與I組相比,急性缺氧 + antimiR-34a納米顆粒組(I+NP組)的miR-34a擴(kuò)增倍數(shù)為(1.44±0.11) 明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注:與C組比較,*P<0.05;與I組比較,#P<0.05

2.3 小鼠心肌細(xì)胞PNUTS蛋白表達(dá) 經(jīng)過(guò)24 h急性缺氧處理后,miR-34a下游蛋白PNUTS的表達(dá)降低,加入antimiR-34a納米顆粒后表達(dá)上升,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3。

注:與C組比較,*P<0.05;與I組比較,#P<0.05

2.4 小鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組(C組)的凋亡率是(0.05±0.00)。與C組比較,急性缺氧組(I組)的凋亡率為(0.17±0.01)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與I組比較,急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組(I+NP組)的凋亡率為(0.10±0.05) 明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注:與C組相比,*P<0.05;與I組相比,#P<0.05

3 討 論

急性心肌梗死已經(jīng)成為全球發(fā)生率和病死率最高的一類疾病[8]。盡管近年來(lái)該病治療方法和技術(shù)取得巨大進(jìn)步,但缺血缺氧引起的心肌損傷仍然是造成患者死亡的重要原因。近來(lái)研究證實(shí)抑制miR-34a可以降低急性心肌梗死后所發(fā)生的細(xì)胞死亡和纖維化情況,促進(jìn)心肌功能的恢復(fù)[9-10],過(guò)表達(dá)miR-34a可促進(jìn)缺氧復(fù)氧和高血糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞株H9C2 凋亡[11-12],提示miR-34a在促心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用。缺氧參與心肌細(xì)胞miR-34a的表達(dá),以往研究多集中缺氧復(fù)氧后的研究,或者慢性長(zhǎng)期缺氧方面,而關(guān)于早期缺氧的研究較少[5-6,13-16]。本研究通過(guò)觀察急性缺氧對(duì)原代小鼠心肌細(xì)胞miR-34a表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)急性缺氧miR-34a基因表達(dá)明顯升高,其下游的蛋白磷酸酶1核靶向亞基(PNUTS)蛋白亦明顯升高,同時(shí)激活了細(xì)胞凋亡;通過(guò)加入antimiR-34a納米顆粒干預(yù),可以有效進(jìn)入心肌細(xì)胞,減輕急性缺氧引起miR-34a基因升高、PNUTS蛋白升高及細(xì)胞凋亡。

有研究發(fā)現(xiàn),缺氧復(fù)氧導(dǎo)致大鼠H9C2心肌細(xì)胞miR-34a表達(dá)下調(diào),通過(guò)miR-34a激動(dòng)劑才可以增加其表達(dá)[13-14]。這與本實(shí)驗(yàn)的觀察正好相反,可能與細(xì)胞來(lái)源不同、復(fù)氧抵抗miR-34a有關(guān)。通過(guò)文獻(xiàn)我們反向推斷得出,急性缺氧是可以導(dǎo)致miR-34a升高的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)原代小鼠心肌細(xì)胞做qRT-PCR測(cè)miR-34a證實(shí)了這樣的推論。其中,與對(duì)照組miR-34a的表達(dá)倍數(shù)(1.02±0.04)比較,急性缺氧組(2.08±0.18)和急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組(1.44±0.11)均升高(均P<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)antimiR-34a納米顆粒預(yù)干預(yù)并不能完全抵抗缺氧導(dǎo)致的miR-34a升高,且與急性缺氧組相比,急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組的這種抵抗比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示,急性缺氧上調(diào)miR-34a基因的表達(dá),antimiR-34a納米顆?？梢缘挚惯@種上調(diào)趨勢(shì)。我們推斷,這種含有antimiR-34a的納米顆粒,或可以進(jìn)入心肌細(xì)胞影響細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,從而發(fā)揮與之前的文獻(xiàn)一致的效果[6]。

有研究人員找到了miR-34a的一種新型直接靶標(biāo)PNUTS,能調(diào)低端?？s短,DNA損傷反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡,并且促進(jìn)急性心肌梗死后的功能恢復(fù)[15]。在通過(guò)干擾PNUTS的同時(shí),miR-34a亦會(huì)受到影響[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組的(1.12±0.05)比較,急性缺氧組的PNUTS /GAPDH灰度值比值為(0.31±0.03),提示PNUTS表達(dá)顯著降低。加入antimiR-34a納米顆粒后,PNUTS /GAPDH灰度值比值為(0.78±0.09),與急性缺氧組(0.31±0.03)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PNUTS作為miR-34a的下游反饋基因呈負(fù)相關(guān)。antimiR-34a納米顆粒下調(diào)急性缺氧誘導(dǎo)的PNUTS降低。再次證實(shí)急性缺氧的確與miR-34a這一靶標(biāo)高度相關(guān),miR-34a可能成為急性缺氧期PNUTS發(fā)揮心肌修復(fù)作用的生物標(biāo)志靶點(diǎn)[15-16]。

心肌細(xì)胞壞死和凋亡是心肌損傷的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[17]。細(xì)胞凋亡參與了冠心病、心肌病以及慢性心力衰竭等多種心血管疾病的病理生理進(jìn)程,缺氧、機(jī)械應(yīng)力、神經(jīng)激素、炎癥、氧化應(yīng)激等多種刺激因素引起或加劇心肌細(xì)胞凋亡[18]。急性缺氧可以誘導(dǎo)凋亡已獲得證實(shí)[19]。但是凋亡是否與miR-34a增高有關(guān),是否與PNUTS增高有關(guān),有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在急性缺氧條件下加入antimiR-34a納米顆粒后發(fā)現(xiàn),antimiR-34a納米顆粒下調(diào)急性缺氧誘導(dǎo)的凋亡。其中,與對(duì)照組的凋亡率(0.05±0.00)相比,急性缺氧組的凋亡率升高至(0.17±0.01),提示急性缺氧可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。加入antimiR-34a納米顆粒后,急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組的凋亡率降為(0.10±0.05),與急性缺氧組相比有所降低(P<0.05),提示antimiR-34a納米顆粒具有下調(diào)凋亡率的作用,抵抗急性缺氧后心肌凋亡的發(fā)生,保護(hù)心功能。同時(shí),急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組的凋亡率與對(duì)照組的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示急性缺氧深度參與了細(xì)胞凋亡的發(fā)生,而antimiR-34a納米顆粒不可完全逆轉(zhuǎn)這種凋亡損傷。

靶向干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡可能是心血管疾病的潛在治療方式[20]。納米顆粒靶向治療的應(yīng)用,是目前科研界新的探索。研究表明[6],antimiR-34a納米顆粒在動(dòng)物體內(nèi)具有較好的親和性。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),antimiR-34a納米顆?；蛞灿辛己玫男募〖?xì)胞靶向作用,能夠呈遞antimiR-34a進(jìn)入心肌細(xì)胞,延緩心肌細(xì)胞凋亡,改善心功能。

綜上所述,急性缺氧上調(diào)小鼠心肌細(xì)胞miR-34a表達(dá),上調(diào)下游PNUTS蛋白的表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生;antimiR-34a納米顆?？梢赃M(jìn)入心肌細(xì)胞抵抗急性缺氧引起上述損傷。但是,目前仍然需要更進(jìn)一步的觀察和機(jī)制研究來(lái)評(píng)價(jià)antimiR-34a納米顆粒的安全性與有效性,為RNA納米技術(shù)在AMI靶向修復(fù)中提供更多科學(xué)依據(jù)。