何 齊,馮 倩,李 雪,易鴛鴦,顧美英,朱 靜,孫 建,張志東,

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】賽里木鎮(zhèn)位于新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣,賽里木酸奶質(zhì)地粘稠,拉出的長(zhǎng)絲能達(dá)到1 m左右,又被稱(chēng)作賽里木拉絲酸奶[1]。乳酸菌在胃腸道中繁衍增殖, 能夠維持腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[2]。賽里木酸奶雖然具有良好的風(fēng)味特征,但關(guān)于其中微生物組成的研究還不深入,傳統(tǒng)的發(fā)酵方式該種酸奶的微生物組成復(fù)雜,組分及其相互作用也不明確。分離、保藏賽里木酸奶中的乳酸菌對(duì)于開(kāi)發(fā)和利用優(yōu)良菌種資源有著重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】瑪依諾·木圖拉[3]從賽里木酸奶中篩選得到得到2株產(chǎn)粘乳酸菌,分別為嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilic)和瑞士乳酸菌(Lactobacillushelveticus);高冬臘[4]在賽里木酸奶中分離得到1株德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus),均具有較好的益生特性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)賽里木酸奶中乳酸菌的分離鑒定及特性分析文獻(xiàn)較少,近些年來(lái),對(duì)賽里木酸奶的相關(guān)研究在逐漸增加,但賽里木酸奶中微生物資源豐富,需進(jìn)一步挖掘利用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以采集到的12種賽里木酸奶為研究對(duì)象,篩選鑒定賽里木酸奶中分離得到的乳酸菌,檢測(cè)生理生化特性。篩選益生效果好、食用安全的乳酸菌資源,有效擴(kuò)大特色乳酸菌資源庫(kù)和保護(hù)利用相關(guān)益生資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原 料

賽里木酸奶樣品:分別采自新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣賽里木鎮(zhèn)周邊。

供試菌株:枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、青霉菌(Penicillium)和黑曲霉(Aspergillusniger)菌株,均由新疆微生物資源保藏管理中心(Microbiological Culture Collection Center of Xinjiang,MCCCX)提供。

1.1.2 試 劑

無(wú)水乙醇、冰乙酸、溴酚藍(lán)、吐溫-80、戈盧氏碘液、剛果紅,均為分析純,由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

吲哚試劑:取 0.1 g 對(duì)二甲氨基苯甲醛,用 5 mL 95%乙醇溶解,然后再緩慢加入 2 mL 濃鹽酸。

α-萘胺試劑:1 g α-萘胺溶于 20 mL 蒸餾水和 150 mL 200 g/L 的乙酸溶液中。

對(duì)氨基苯磺酸試劑:0.5 g 對(duì)氨基苯磺酸溶于 150 mL 200 g/L 的乙酸溶液中。

抗生素濾紙片:青霉素 10 IU/片、紅霉素 15 μg/片、四環(huán)素 30 μg/片、鏈霉素 10 μg/片、慶大霉素 10 μg/片、卡那霉素 30 μg/片、諾氟沙星 10 μg/片、氨芐西林 10 μg/片、利福平 5 μg/片、萬(wàn)古霉素 30 μg/片,購(gòu)自北京天壇生物制品股份有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基和 LB 液體培養(yǎng)基,由青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司提供。

生物胺檢測(cè)培養(yǎng)基:牛肉膏 5.0 g,胰蛋白胨 5.0 g,酵母粉 5.0 g,葡萄糖 0.5 g,檸檬酸銨 2.0 g,NaCl 2.5 g,K2HPO4·7H2O 2.0 g,吐溫-80 1 mL,MgSO40.2 g,CaCO30.1 g,FeSO40.04 g,MnSO40.05 g,VB10.01 g,5-磷酸吡哆醛 0.05 g,溴甲酚紫 0.06 g,瓊脂 20 g,蒸餾水 1 000 mL,pH 值 5.8～6.0。

改良氨基脫羧酶檢測(cè)培養(yǎng)基:分別在生物胺檢測(cè)培養(yǎng)基中加入 10 g/L 的對(duì)應(yīng)前體氨基酸(精氨酸、酪氨酸、尸氨酸、色氨酸、組氨酸)。

蛋白胨水培養(yǎng)基:蛋白胨 20 g,氯化鈉 5 g,蒸餾水 1 000 mL,pH 7.4～7.6。

1.1.4 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本 HIRAYAMA 公司);TS 恒溫振蕩器(德國(guó)耶拿分析儀器股份公司);PCR儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司);生化培養(yǎng)箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);立式冷藏柜(海爾 HAIER 公司);電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集

賽里木酸奶樣品采自新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣,經(jīng)滅菌的 50 mL 離心管分裝,放入車(chē)載低溫冰箱保存,采樣結(jié)束后分別放入4℃和-80℃冰箱保存,備用。表1

表1 樣品及來(lái)源

1.2.2 菌株分離篩選

在無(wú)菌條件下吸1 mL 樣品于9 mL的無(wú)菌生理鹽水中, 振蕩混勻, 采用梯度稀釋法,將稀釋液在含有1% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上涂布,37℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的細(xì)菌單菌落,進(jìn)一步劃線純化后,轉(zhuǎn)接至MRS斜面培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)48 h, 4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

該船船型較小，為了提高軸系安裝的工作效率，選用直線校中方法，按連接法蘭上規(guī)定的偏中值進(jìn)行校中。采用此法安裝和校中軸系時(shí)，通常按照從后往前的順序，先按軸系中心線裝好尾軸，然后以尾軸為基準(zhǔn)，從船尾向船頭方向一段一段地調(diào)整各段軸的具體位置，并按照規(guī)范要求調(diào)節(jié)每一對(duì)連接法蘭上的偏移值和曲折值，最后，以推力軸的前法蘭作為基準(zhǔn)對(duì)主機(jī)進(jìn)行定位。具體步驟如下：

1.2.3 菌株分子鑒定

挑取少量新鮮的乳酸菌單菌落,以菌株DNA為模板,使用16S rRNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物在進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)之后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

將測(cè)序完成的DNA序列利用SeqMan (DNAStar 6.0)軟件進(jìn)行序列拼接,將得到的菌株的16S rRNA基因序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ezbiocloud.net/)中比對(duì)分析,使用MEGA 7.0進(jìn)行ClustalX多重比對(duì),構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),確定菌株分類(lèi)地位。

1.2.4 菌株的生長(zhǎng)特性

以MRS液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的生長(zhǎng)溫度、耐鹽、耐酸特性檢驗(yàn),在含0.5%豬膽鹽的乳糖膽鹽培養(yǎng)基上進(jìn)行膽鹽耐受性檢驗(yàn),牛奶胨化實(shí)驗(yàn)參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]進(jìn)行。

1.2.5 菌株的功能性酶活

將各乳酸菌株點(diǎn)接接種至相應(yīng)功能酶篩選培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)3～5 d,測(cè)定菌株的蛋白酶、果膠酶、酯化酶、淀粉酶和纖維素酶活性,其中,蛋白酶、果膠酶和酯化酶篩選直接觀察透明圈;淀粉酶篩選用0.1%的碘液染色后觀察透明圈;纖維素酶篩選用0.1%的剛果紅染色后觀察透明圈[6]。

1.2.6 菌株的抑菌活性

將指示菌株大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌,接種于LB液體培養(yǎng)基中,30℃、120 ×g條件下振蕩培養(yǎng)16 h。取100 μL發(fā)酵菌液,均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基。全部菌液平板吸收后,在設(shè)定區(qū)域的中央接種菌株,30℃培養(yǎng)48 h,確定出其產(chǎn)抑菌圈性能,充分的沖洗青霉菌、黑曲霉,根據(jù)要求將孢子懸液涂布后點(diǎn)接待測(cè)菌株,30℃環(huán)境條件下充分培養(yǎng)48 h后觀察,判斷出其產(chǎn)抑菌圈。

1.2.7 溶血性測(cè)定

將乳酸菌株接種到血瓊脂平板上,在37℃下培養(yǎng)48 h,其附近產(chǎn)生透明的溶血環(huán),對(duì)應(yīng)為β-溶血;觀察出現(xiàn)一定尺度的草綠色環(huán),對(duì)應(yīng)為α-溶血;未出現(xiàn)變化的,對(duì)應(yīng)為γ-溶血。以金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.8 有害代謝物質(zhì)檢測(cè)

①生物胺的測(cè)定[7]:將活化后的菌株繼續(xù)進(jìn)行接種培養(yǎng),分別在改良氨基脫羧酶、無(wú)前體氨基酸的平板接種,37℃下培養(yǎng)48 h,觀察其顏色,在發(fā)現(xiàn)紫色情況下判斷為陽(yáng)性,否則為陰性。②吲哚試驗(yàn)參照王夢(mèng)嬌[8]試驗(yàn)。③硝基還原酶活性檢測(cè)參照孟丹實(shí)驗(yàn)[9]進(jìn)行。

1.2.9 菌株的自聚合能力測(cè)定

將乳酸菌接種至MRS液體培養(yǎng)基,37℃,120 ×g條件下培養(yǎng)48 h,將發(fā)酵后菌液在3 000 ×g、4℃條件下離心10 min,棄去上清液,保留菌體,重懸于無(wú)菌生理鹽水中,調(diào)節(jié)600 nm下的OD值至0.5,記為A0h)。振蕩混勻30 s,在酶標(biāo)板中加入400 μL菌懸液,37℃條件下靜置2 h。靜置完成后,吸取200 μL上清液,測(cè)定其在,記為A2h,乳酸菌自凝率測(cè)定如下所示,取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值[10]。

自凝率(%)=(1-A2h/A0h)×100.

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品測(cè)定 3 次取平均值,采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶中分離乳酸菌及其生理生化特性鑒定

研究表明,從賽里木酸奶中分離出4種乳酸菌菌分屬于Eremococcus、Leuconostoc、Lentilactobacillus、Streptococcus4個(gè)屬下的4個(gè)種。圖1

圖1 賽里木酸奶中乳酸菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 菌株的生長(zhǎng)特性

研究表明,其中4株乳酸菌在45℃正常生長(zhǎng),沒(méi)有異常;所有菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)5%的NaCl都有良好的耐受性,其中菌株S5-1能耐受7%的NaCl;pH 3.0時(shí)不生長(zhǎng),適當(dāng)?shù)脑黾铀釅A度在pH為4時(shí),開(kāi)始微弱的生長(zhǎng)。在含0.5%豬膽鹽培養(yǎng)基上4株試驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)都沒(méi)有受到影響。4株試驗(yàn)菌株的胨化能力均較好,生長(zhǎng)過(guò)程中并不析出乳清;菌株H4-2發(fā)酵牛奶可產(chǎn)生濃郁香氣,質(zhì)地柔和細(xì)膩。表2

表2 菌株的生長(zhǎng)情況

2.3 菌株的自聚合能力測(cè)定

研究表明,4種菌株均表現(xiàn)出良好的自聚合能力,自凝率最高的為H4-2,達(dá)到83.46%,最低為S5-1,達(dá)到67.1%。 圖2

圖2 菌株的自凝率變化

2.4 菌株的功能酶活性

研究表明,4株菌均具有蛋白酶活性,但不具有其他功能酶活性。表3

2.5 菌株的抑菌活性

研究表明,4株菌均對(duì)大腸埃希菌有抑制作用,其中D1-3與H4-2的抑菌活性較強(qiáng);4株菌對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用,其中H4-2的抑菌活性較強(qiáng);3株菌對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用;僅有H4-2對(duì)白色念珠菌有抑制作用,所有菌均不抑制青霉菌和黑曲霉。表4

表4 菌株的抑菌活性

2.6 菌株的生物安全性

研究表明,4株菌的生物安全性都達(dá)到較高水平,其中H5-4菌株在含L-色氨酸的平板上陽(yáng)性,由此可判斷出其產(chǎn)胺性能強(qiáng),可轉(zhuǎn)換前體形成色胺,其他的菌株都為陰性。在硝基還原酶檢測(cè)結(jié)果表明,除H5-4菌株外都不產(chǎn)生硝基還原酶。所有菌株在吲哚實(shí)驗(yàn)中均為陰性結(jié)果,并且均不具有溶血性。表5

表5 菌株的有害代謝物質(zhì)檢測(cè)

3 討 論

3.1傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品的品質(zhì)和與所處地理?xiàng)l件之間存在密切聯(lián)系,是因?yàn)楫?dāng)?shù)氐臍夂?、環(huán)境等因素對(duì)乳制品中微生物的種群特征會(huì)產(chǎn)生明顯影響[11]。在食品風(fēng)味物質(zhì)形成過(guò)程中,微生物群落的作用很重要,同時(shí)也和食物的儲(chǔ)藏密切相關(guān)[12]。研究傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的微生物菌群結(jié)構(gòu),在分析發(fā)酵進(jìn)程方面也有較高的應(yīng)用價(jià)值,同時(shí)也可為產(chǎn)地溯源系統(tǒng)的建立提供依據(jù)和支持[13]。

3.2賽里木酸奶獨(dú)特風(fēng)味的形成與其復(fù)雜的微生物組成有著直接的關(guān)系,高冬臘[4]在賽里木酸奶中利用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn),酸奶中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén),優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌屬和鏈球菌屬。王子涵[14]利用高通量測(cè)序技術(shù)在賽里木酸奶中得到的結(jié)果基本相同,酸奶中鏈球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬,其次為乳桿菌屬。研究在阿克蘇地區(qū)賽里木鎮(zhèn)周邊收集到12份賽里木酸奶樣品,分離篩選得到36株乳酸菌,經(jīng)16S rRNA基因序列分析鑒定為Eremococcus、Leuconostoc、Lentilactobacillus、Streptococcus4個(gè)屬下的4個(gè)種,分別為S5-1(Eremococcuscoleocola)、H4-2(Lentilactobacilluskefiri)、H5-4(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)及D1-3(Streptococcusthermophilus)。

3.3乳酸菌作為典型的益生菌,具有多種益生特性,但乳酸菌需要經(jīng)過(guò)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn),粘附在宿主腸道的上皮細(xì)胞表面實(shí)現(xiàn)腸道定植,是乳酸菌能夠更好發(fā)揮其益生功能的關(guān)鍵。由于胃腸道中存在的胃酸及膽汁,乳酸菌必須具有一定的耐酸和耐膽鹽能力[15, 16]。研究中4株乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)5%的NaCl都有良好的耐受性,其中菌株S5-1能耐受7%的NaCl,并均具有一定的耐酸能力。自聚合能力也是評(píng)價(jià)乳酸菌粘附性能的重要因素之一,也是益生菌粘附于腸道,作為生物屏障發(fā)揮功能的基礎(chǔ)[10],4種菌株均表現(xiàn)出良好的自聚合能力,自凝率最高的為H4-2,達(dá)到83.46%,最低為S5-1,達(dá)到67.1%。

3.4乳酸菌的抗菌能力,是其眾多益生功能中的一個(gè)重要特性,能夠避免胃腸道感染的出現(xiàn)[17]。王融等[18]在研究魚(yú)類(lèi)腸道乳酸菌時(shí)發(fā)現(xiàn),腸道乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌出胞外物質(zhì),這種物質(zhì)可以將病原菌與胃腸道黏膜隔絕開(kāi)來(lái),此外腸道乳酸菌還會(huì)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),同時(shí)分泌出具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物,進(jìn)而達(dá)到抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖的效果。蔡靜靜等[19]在新疆伊犁地區(qū)乳制品中分離得到7株對(duì)大腸埃希氏菌具有較好抑制性的乳酸菌。研究中4株乳酸菌均對(duì)大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌均有抑制作用,其中H4-2的抑菌活性較強(qiáng);3株菌對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用;僅有H4-2對(duì)白色念珠菌有抑制作用。不同乳酸菌之間抑菌范圍及抑菌效果均存在較大差異,可能是由于不同乳酸菌所產(chǎn)生的的代謝產(chǎn)物不同,仍需進(jìn)一步研究。

3.5生物胺是一種含氮化合物,具有一定的生物活性[20],生物體內(nèi)普遍存在著微量的生物胺,并且承擔(dān)著重要的生理功能[21-23],但生物胺攝入過(guò)量會(huì)引起多種不良反應(yīng)[24-26]。

4 結(jié) 論

在12種賽里木酸奶樣品中篩選得到4種乳酸菌,分屬于Eremococcus、Leuconostoc、Lentilactobacillus、Streptococcus4個(gè)屬下的4個(gè)種,試驗(yàn)菌株可耐受0.5%膽鹽,0.5%NaCl,且具有較好耐高溫、牛奶胨化和抑制細(xì)菌等特性,并展現(xiàn)出良好的自聚合能力。4株乳酸菌均不溶血,且吲哚檢測(cè)試驗(yàn)均呈陰性,除H5-4外均不產(chǎn)生硝基還原酶及生物胺。