秦鵬亮,周 霄,Kahsay Tadesse Mawcha,王 爽,李佳琪,劉 穎,張 娜,楊文香

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病理學(xué)系/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治技術(shù)創(chuàng)新中心/國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河北保定 071001;2.河北省植保植檢總站,石家莊 050000)

0 引 言

【研究意義】由假禾谷鐮孢菌(Fusariumpseudograminearum)引起的莖基腐病已成為嚴(yán)重危害小麥生產(chǎn)品質(zhì)的重要病害[1-2]。該病從苗期到成熟期均可發(fā)生,造成小麥種植期爛種、死苗,成株期莖基部褐變,發(fā)病嚴(yán)重時可見白穗癥狀,產(chǎn)量減少20%～30%[3]。近些年該病害呈嚴(yán)重發(fā)生趨勢,2018年在陜西關(guān)中的部分地區(qū)田塊出現(xiàn)30%以上白穗率[4]。2020年山東省發(fā)生面積133.33×104hm2(2 000×104畝)以上,河北中南部小麥主產(chǎn)地域2015年部分地塊的白穗數(shù)量達(dá)到50%[5]。應(yīng)用種植抗病品種是防治該病害的高效、安全、經(jīng)濟的方法,創(chuàng)制抗小麥莖基腐病的種質(zhì)資源顯得非常重要[6]。由優(yōu)勢致病菌假禾谷鐮孢菌(Fusariumpseudograminearum)引起的莖基腐病已成為影響小麥生產(chǎn)的重要病害?？共∑贩N的應(yīng)用是控制該病害高效、安全、經(jīng)濟的方法。但由于小麥抗莖基腐病抗性資源匱乏,創(chuàng)制小麥莖基腐病的抗病種質(zhì)資源對于培育抗病品種,高效防控小麥莖基腐病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】化學(xué)誘變是資源創(chuàng)制的最有效的方法之一[7]。目前小麥種質(zhì)資源創(chuàng)新工作中使用最廣泛的化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS,Ethyl Methane Sulfonate)具有誘變成本低、操作簡單便利、突變率高、對材料的損傷小、不易引起染色體畸變、突變譜較廣等特點[8-10],被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)突變研究中[11-17]。EMS溶液的濃度與處理時間是影響小麥誘變率的關(guān)鍵因素,在EMS誘變濃度與處理時間等做了探索[12]。薛芳等[13]在對新春11號的誘變研究中發(fā)現(xiàn),0.3%是最適宜新春11號小麥的誘變濃度。Mago等[14]用EMS處理小麥種子,選用不同的濃度進行發(fā)芽試驗,最終以濃度0.4%進行誘變處理,得到一部分突變體。張維宏等[15]用1.0% EMS處理小麥抗葉銹病等基因系TcLr19的種子,通過表型和分子標(biāo)記輔助篩選,從M3中篩選到了6個TcLr19的感病突變體,為Lr19基因和功能研究提供理想的材料。孫玉龍等[16]采用0.4% EMS誘導(dǎo)盛農(nóng)1號小麥,經(jīng)過M3代驗證獲得可穩(wěn)定遺傳的突變株系18個,為小麥品種改良和遺傳研究提供了新的材料。Yasui等[17]利用0.5% EMS處理面包小麥種子,在M2材料中發(fā)現(xiàn)了糯質(zhì)突變體,最終育成了糯質(zhì)普通小麥新品系K107wx1和K107wx2。EMS誘變可以產(chǎn)生較為豐富的突變后代,而且不同的品種誘變的最佳EMS濃度不同?！颈狙芯壳腥朦c】經(jīng)過適宜濃度的EMS誘變可篩選得到一些抗病材料。然而高效準(zhǔn)確的接種鑒定方法是篩選抗病材料的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一?；粞嗟萚18]比較了培養(yǎng)皿幼苗直接接種培養(yǎng)法、水培苗接種法、棉球接種法和菌液浸種接種法4種接菌方法,發(fā)現(xiàn)棉球接菌法為最佳的接種方法。在苗期鑒定病級是判斷小麥莖基腐病發(fā)病嚴(yán)重性有效的方法之一,苗期鑒定結(jié)果與成株期鑒定結(jié)果具有較高的相關(guān)性[11],但由于發(fā)病程度受多種因素的影響,苗期鑒定的結(jié)果與成株期的鑒定結(jié)果可能存在一定差異。需研究小麥品種衡觀35抗莖基腐病EMS突變及其鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用在河北主麥區(qū)大面積種植的小麥品種衡觀35為誘變品種,參照張紀(jì)元等[19]方法通過對EMS最佳處理濃度的篩選。篩選出適宜的誘變濃度,通過濕紙巾接種法[20]和棉球接種法[18]接菌并于后期對小麥抗莖基腐病抗病突變材料進行抗病性鑒定分析,明確其抗病特性,對誘變材料進行加代繁殖,同時跟蹤鑒定。

1 材料與方法

1.1 材 料

以感莖基腐病小麥品種衡觀35為誘變材料,非誘變的衡觀35為感病對照,石優(yōu)17為中抗對照。

所用藥品、試劑:EMS試劑(ALFA AESAR(A Johnson Matthey Company))、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)和硫代硫酸鈉(Na2S2O3)(天津福晨化學(xué)試劑有限公司)。

假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum, Fp)為致病力強菌株,由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院小麥創(chuàng)新團隊實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1 小麥品種的誘變處理

選取籽粒飽滿的感病材料衡觀35種子 2 000粒,先用75%酒精對種子進行消毒,再用滅菌水清洗3次,將衡觀35種子在室溫條件下分別放入配置好的EMS磷酸緩沖液濃度為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的溶液中,在26℃下110 r/min,振蕩處理8 h,加入5%硫代硫酸鈉進行終止反應(yīng),用流動的自來水沖洗3次,每次間隔15 min。放入4℃冰箱中,3 d后觀察并統(tǒng)計其萌發(fā)率。以磷酸緩沖液浸泡的種子作為對照。通過不同濃度EMS對小麥萌發(fā)率的影響,選擇相對萌發(fā)率為50%左右的濃度作為最適誘變濃度。

1.2.2 假禾谷鐮刀菌懸浮液的制備

根據(jù)王佐乾等[21]方法制備綠豆培養(yǎng)基,經(jīng)121℃滅菌30 min。用滅菌的打孔器在PDA培養(yǎng)基上擴繁的Fp菌種,將5個菌餅轉(zhuǎn)移至綠豆湯培養(yǎng)基,28℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h,之后將紗布折疊成多層用于過濾,在顯微鏡下用血球計數(shù)板觀察并計算孢子濃度,調(diào)節(jié)菌液孢子濃度至106/mL。

1.2.3 誘變后小麥萌發(fā)種子的接種鑒定

小麥萌發(fā)后,采用濕紙巾法[20]對其接種,待其芽長至5 mm左右,篩選萌發(fā)率較好的小麥種子浸于孢子懸浮液中,接種10 min后,將種子呈直線均勻置于滅菌的濕潤紙巾上,芽的生長方向一致,指向紙巾邊緣,芽上端離紙巾邊緣2 cm左右,將紙巾從一端向另一端卷起,然后將其置于泡沫盒中,在22～25℃,90%的相對濕度環(huán)境中進行培養(yǎng)。小麥成功接菌35 d后,參考Wildermuth[22]的改進方法進行鑒定。采用5級鑒定標(biāo)準(zhǔn)對每個品種的處理的苗子進行鑒定,0級為未發(fā)病;Ⅰ級為第一葉鞘病斑長度小于1.0 cm;Ⅱ級為第一葉鞘病斑長度在1.0～2.0 cm;Ⅲ級為第一葉鞘病斑長度大于2.0 cm,幼苗未萎蔫;Ⅳ級為幼苗出現(xiàn)萎蔫病癥;Ⅴ級為幼苗死亡。

1.2.4 突變材料的加代

采用0.4% 的EMS對衡觀35進行誘變,將誘變后的M0幼苗采用Li等[24]的方法接種假禾谷鐮刀菌的懸浮液,在接種35 d后對品種M0的發(fā)病級別進行鑒定,M0抗病的幼苗轉(zhuǎn)入花盆,低溫處理后完成春化,轉(zhuǎn)至溫室進行加代。收獲后繼續(xù)加代,直至獲得M3代。

1.2.5 誘變加代幼苗的接菌

經(jīng)溫室加代培養(yǎng)篩選獲得M3代的種子播種于盆中,在小麥播種15 d左右后,挑選健康、長勢相似的小麥,采用棉球接種法[18]在距土表0.5～1 cm的莖基部纏繞適量醫(yī)用脫脂棉球,用移液槍在棉球內(nèi)側(cè)與莖基部接觸的地方注射0.5 mL菌液,后用適量的保鮮膜包裹潤濕的脫脂棉球,外再纏繞適量透明膠帶進行固定,于20℃條件下進行迷霧保濕72 h。在小麥成功接菌35 d后,將麥苗輕輕拔出然后沖洗干凈,查看病害等級程度,根據(jù)改進后Wildermuth[22]方法鑒定。

健康的植株繼續(xù)生長到成株期,利用Raju等[23]鑒定標(biāo)準(zhǔn)進行鑒定。0級:莖基部無腐爛壞死病斑;Ⅰ級:第一莖節(jié)局部腐爛;Ⅱ級:第一莖節(jié)完全腐爛,第二莖節(jié)局部腐爛或完全腐爛;Ⅲ級:腐爛癥狀上升至第二莖節(jié)及以上;Ⅳ級:麥穗以下腐爛;Ⅴ級植株整株死亡或不抽穗或白穗。

病情指數(shù)=(∑(各級病株數(shù)×相對級數(shù)值) /調(diào)查總株數(shù)×最高病級)×100。

采用0.4% 的EMS對衡觀35進行誘變,將誘變后的M0幼苗采用Li等[24]的方法接種假禾谷鐮刀菌的懸浮液,在接種35 d后對品種M0的發(fā)病級別進行鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

收獲M3成熟小麥種子進行千粒重測定。采用SPSS 19.0軟件對病情指數(shù)和千粒重進行Duncan＇s新復(fù)極差法方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜EMS處理濃度的確定

研究表明,小麥品種衡觀35經(jīng)0.4% EMS誘變后其萌發(fā)率為49.00%(相對萌發(fā)率為52.13%),其它濃度造成萌發(fā)率偏低,衡觀35誘變適宜濃度為0.4%。

2.2 苗期病級鑒定

研究表明,品種M0衡觀35 中0級株數(shù)最多,共計106株,占突變總株數(shù)的14.50%,并且比兩個對照組高出3倍。M0衡觀35的病情指數(shù)比中抗品種石優(yōu)17低19.02%。表1

表1 M0小麥人工接菌后苗期的病級鑒定

對選擇出0～Ⅱ級的材料進行繁殖,保留病害Ⅱ級以下的材料,收獲種子,繁殖直至M3代。對M3代的小麥粒播種,進行苗期接菌鑒定,從120株M3衡觀35中獲得25株免疫材料,占該品種突變材料的20.83%,比對照感病衡觀35和中抗石優(yōu)17免疫株數(shù)所占百分比分別高出1倍和3倍。M3衡觀35苗期的病情指數(shù)顯著低于對照感病衡觀35的病情指數(shù),并且與對照中抗石優(yōu)17的病情指數(shù)沒有顯著性差異。M3衡觀35品種在苗期能夠抵抗莖基腐病的發(fā)生。表2,圖1

A:衡觀35;B:M3衡觀35;C:石優(yōu)17

表2 M3突變品種苗期病級鑒定

2.3 M3突變品種成株期病級鑒定結(jié)果

研究表明,M3衡觀35各發(fā)病等級株數(shù)有所變化,病情指數(shù)高于苗期的病情指數(shù),但與對照感病衡觀35的病情指數(shù)存在顯著性差異,小麥莖基腐病發(fā)生的嚴(yán)重程度隨著生育期的延長而加重,共獲得突變免疫抗性資源7株,占測試突變株材料的5.83%。表3和圖2

注:A:衡觀35;B:M3衡觀35;C:石優(yōu)17

表3 M3突變品種成株期病級鑒定

2.4 M3突變株的農(nóng)藝性狀和抗莖基腐病材料的千粒重變化

研究表明,小麥品種衡觀35的EMS誘變突變株在農(nóng)藝性狀和抗病性上均發(fā)生了變化。在測試的小麥突變材料中,植株出現(xiàn)抽穗晚、矮化、分蘗增多及畸形穗等癥狀。與對照相比,M3衡觀35小麥抗莖基腐病的病能力增強,而且同一小麥品種千粒重隨其病害級別的增大而降低,與感病衡觀35和中抗石優(yōu)17對照相比,同一病害等級下的不同品種間千粒重差異顯著。圖3,表4

注:A:少分蘗;B:半矮化;C:少分蘗、抽穗晚;D:抽穗晚,冬性增強;E:畸形穗

表4 M3突變品種不同病害級別的千粒重變化

3 討 論

3.1EMS誘變劑是目前最為有效的植物化學(xué)誘變技術(shù)方法之一[8]。目前利用該技術(shù)獲得抗性基因突變體,Mago等[25]報道,利用EMS誘導(dǎo)在基因組中產(chǎn)生隨機點突變獲得抗銹病基因敏感型突變體。李韜等[26]使用EMS對抗赤霉病的小麥地方品種進行誘變處理,發(fā)現(xiàn)處理小麥的發(fā)病率都比相應(yīng)株野生型的高得多。趙天祥等[27]利用EMS技術(shù)對小麥偃展4110種子進行誘變,對其M2代整個的生育期田塊表現(xiàn)型進行抗性鑒定及實時觀察,從而其獲得了特殊性狀的突變體。

3.2溫日宇等[28]用EMS 處理后使藜麥幼苗種子細(xì)胞產(chǎn)生許多生理生化反應(yīng),生成了大量有害自由基及其他分子。而在誘變劑過程中,其化學(xué)誘變物質(zhì)會導(dǎo)致植物內(nèi)部的生理損傷,在某種程度上,增加誘變劑劑量和延長誘變劑處理的時間可能會提高誘變劑的效力;當(dāng)其誘變劑的劑量超過劑量限制時,植物本身就會受到嚴(yán)重的生理損害,導(dǎo)致更多的死亡和失常?，F(xiàn)已知EMS誘變對種子的萌發(fā)產(chǎn)生一定的影響。EMS作為應(yīng)用最廣、效果最好的誘變劑,已經(jīng)用于多種作物的誘變育種及抗病選擇。盧銀等[29]采用不同濃度 EMS 誘變大白菜種子萌發(fā)及幼苗生長的研究,發(fā)現(xiàn)誘變的最佳濃度為 0.4%～0.6%。曲高平等[30]用不同濃度的EMS處理甘藍(lán)油菜種子發(fā)現(xiàn)隨著 EMS濃度的增大,發(fā)芽率降低,發(fā)芽時間延長。研究采用不同濃度EMS對衡觀35進行誘變來篩選莖基腐抗性突變體,試驗選擇了0.4%、0.6%、0.8%和1.0% 4個濃度的誘變試驗,隨著EMS濃度的提高,種子的發(fā)芽率降低,考慮到誘變效率,以小麥的相對萌發(fā)率在50%左右,確定處理組小麥品種衡觀35的誘變適宜濃度為0.4%,獲得了抗莖基腐病免疫突變株M0衡觀35。經(jīng)溫室盆栽進行加代繁殖,以病害級別為選擇依據(jù),得到M3代。對于M3代的苗采用霍燕等[18]方法接菌,分別于苗期和成株期鑒定病級篩選抗病資源,共從供試突變品種M3代中篩選獲得7份免疫的抗小麥莖基腐病的資源。發(fā)現(xiàn)突變獲得的M3材料在鑒定中仍然存在免疫和不同級別的抗病性,可能是由于決定小麥莖基腐病抗病性的基因是微效基因決定的。而金京京[31]通過對普通小麥品種抗莖基腐病全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選出的04中36和石優(yōu)17等抗性品種豐富了我國小麥莖基腐病抗病資源,并篩選出抗病相關(guān)蛋白及其編碼基因。Yang等[32]通過EMS誘變建立突變體庫,利用GWAS(Genome-wide association study)和QTL定位分析發(fā)現(xiàn)了小麥莖基腐病相關(guān)基因TaDIR-B1,并通過基因沉默技術(shù),發(fā)現(xiàn)該基因的功能缺失能顯著增強小麥莖基腐病的抗病能力,且可能通過調(diào)節(jié)植株中木質(zhì)素含量來調(diào)控植株抗病能力。然而參與小麥莖基腐病調(diào)控基因的表達(dá)受環(huán)境的影響,或者目前所得到的M3代尚不穩(wěn)定,需要后期通過分子技術(shù)進行進一步的確認(rèn)。

3.3此外,許云峰等[33]利用EMS處理小麥品種煙農(nóng)15,得到了一些具有不同性狀的突變體,而且出現(xiàn)了一些優(yōu)良農(nóng)藝性狀突變。

4 結(jié) 論

4.1在苗期表現(xiàn)免疫的植株,有些到成株期則不再表現(xiàn)免疫,鑒定中發(fā)現(xiàn)苗期抗病性和成株抗病性存在差異,隨著接種時間的延長,病害發(fā)生程度加重,成株期測試的突變植株僅為7株表現(xiàn)免疫,成株期的鑒定結(jié)果更能代表植株的抗病性。

4.2EMS突變小麥衡觀35,適宜的突變濃度為0.4%,共從供試突變品種M3代中篩選獲得了7份免疫的抗小麥莖基腐病的資源。