王 輝,邵 偉,張少穎,王富蘭,王 帥,武亞婷,范 雪,趙艷坤

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆肉乳用草食動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】在生鮮乳低溫貯藏過程中,嗜冷菌成為優(yōu)勢菌,隨貯藏時(shí)間的增加而快速生長繁殖,開始代謝產(chǎn)生耐熱的脂肪酶和蛋白酶,這些酶經(jīng)巴氏殺菌甚至超高溫滅菌后仍能保留一部分活性[1-4],蛋白酶水解乳蛋白將帶來苦味、異味、果味和酵母味[5]等非正常風(fēng)味,導(dǎo)致生鮮乳和乳制品質(zhì)量的改變。對(duì)解決嗜冷菌分泌的蛋白酶導(dǎo)致UHT乳中蛋白水解而改變產(chǎn)品質(zhì)量有重要意義。【前人研究進(jìn)展】嗜冷菌分泌的蛋白酶經(jīng)巴氏殺菌后都有較強(qiáng)的恢復(fù)能力,經(jīng)77℃/15s加熱處理仍可以保留55%～65%的活性,即使超高溫140℃/5s 處理后,也有一定的活性殘留。恢復(fù)活性的蛋白酶殘留在產(chǎn)品中,緩慢作用于牛乳蛋白,分解α-酪蛋白和κ-酪蛋白,失去穩(wěn)定作用,酪蛋白膠束聚集,輕微的出現(xiàn)少量蛋白質(zhì)沉淀,嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致UHT乳在貯存過程中出現(xiàn)蛋白質(zhì)凝膠和乳清析出現(xiàn)像[6-7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】UHT乳作為眾多乳制品中的重要角色,其貨架期嚴(yán)重的受到嗜冷菌的影響。嗜冷菌影響奶制品貨架期,需要分析嗜冷菌影響奶制品品質(zhì)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】可視鑒定優(yōu)勢嗜冷菌的產(chǎn)蛋白酶能力,研究BCA蛋白定量與UHT乳樣本稀釋濃度間的最優(yōu)線性關(guān)系,分析嗜冷菌分泌的耐熱蛋白酶引起蛋白水解這一現(xiàn)象與溫度、細(xì)菌添加量之間的關(guān)系,為延長UHT乳貨架期提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

嗜冷菌計(jì)數(shù)平板瓊脂MPC購自北京路橋技術(shù)股份有限公司,營養(yǎng)肉湯和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自北京路橋技術(shù)股份有限公司,高蛋白脫脂奶粉購自內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)股份有限公司,UHT乳購自新疆西域春乳業(yè)有限責(zé)任公司,BCA蛋白定量試劑盒夠自新疆鼎楓生物科技有限公司,磷酸鹽緩沖液(PBS),葡萄糖蛋白胨水均購自北京路橋技術(shù)股份有限公司,天根細(xì)菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 原料乳中嗜冷菌的分離純化

原料乳收集之后需要對(duì)其進(jìn)行酸鹽緩沖液對(duì)原料乳進(jìn)行梯度稀釋,對(duì)稀釋后的原料乳進(jìn)行混培,取1 mL奶樣與9 mLPBS混合震蕩均勻制成10-1梯度稀釋液,每個(gè)樣品做原液和10-1至10-5稀釋梯度,每個(gè)稀釋梯度吸取1 mL于培養(yǎng)皿中,每個(gè)稀釋梯度做兩個(gè)平行,將嗜冷菌計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基冷卻至40℃的嗜冷菌計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基,緩慢倒入培養(yǎng)皿,充分搖勻、靜置凝固,置于6.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d[8]。10 d后將平板取出,仔細(xì)觀察其菌種菌落形態(tài)、顏色、光滑程度等,并按其菌落形態(tài)編號(hào)進(jìn)行嗜冷菌純化保存?zhèn)溆肹9]。

1.2.2 嗜冷菌基因組DNA提取與PCR反應(yīng)

樣品中基因組DNA采用天根細(xì)菌基因組試劑盒按照說明書方法提取,以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性、純度、片段大小及濃度[10]。

嗜冷菌16S rDNA序列根據(jù)文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)合成引物,引物序列選擇嗜冷菌通用引物,引物序列為:16S(F)5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;16S(R):5′-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3′PCR反應(yīng)體系:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告[11]確定25 μL的PCR最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。PCR反應(yīng)體系25 μL:2×Taq·Mix12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/mL)各1 μL,模板DNA為2 μL,無菌水為8.5 μL。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s;54℃退火30 s;72℃延伸2 min;循環(huán)35次;72℃延伸10 min;冷卻4℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可參考《分子克隆試驗(yàn)指南(第三版)》[12]使用濃度為2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。將擴(kuò)增后的16S rDNA序列送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。所得擴(kuò)增序列登陸(www.ncbi.nlm.nih.gov/)應(yīng)用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中的已有細(xì)菌16S rDNA序列同源相似性分析[13]當(dāng)待檢菌株的身份鑒定%ID>99代表鑒定結(jié)果準(zhǔn)確,%ID>90代表同源性較強(qiáng)[14-15]。

1.2.3 脫脂乳平板法鑒定假單胞菌的產(chǎn)蛋白酶能力

3 g脫脂高蛋白奶粉+2.35 g嗜冷菌平板計(jì)數(shù)瓊脂+100 mL蒸餾水,攪拌均勻,121℃高壓滅菌15 min,冷卻至40℃倒入培養(yǎng)皿,靜置冷卻,制成含3%脫脂高蛋白脫脂奶粉的乳平板。在乳平板中心做一圓孔,圓孔中注入30 μL活化好的菌液,將乳平板21℃培養(yǎng)25 h, 觀察是否形成蛋白水解圈[16]。

1.2.4 BCA蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

通過BCA蛋白試劑盒測定不同嗜冷菌添加量、儲(chǔ)存溫度、時(shí)間點(diǎn)的乳蛋白含量,在堿性條件下,蛋白將Cu2+還原為Cu+,Cu+與BCA 試劑形成紫藍(lán)色的絡(luò)合物,測定其在562 nm 處的吸收值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算消化產(chǎn)物蛋白的濃度。

BCA工作液的配置:將試劑A與試劑B按照體積比50∶1比例混合,配成BCA工作液。如:50 mL試劑A與1 mL試劑B混合,配制成51 mL BCA工作液。

(1)將總體積為20 μL的待測樣品注入到96孔酶標(biāo)板中,每樣3份。向微孔板中加入200 μL BCA工作液,混勻,37℃放置30 min。

(2)測定562 nm處的吸光值,并記錄讀數(shù)。以不含標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品吸光值作為空白對(duì)照。

(3)以A562吸光值為縱坐標(biāo),樣品含量作為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1.2.5 不同稀釋倍數(shù)的UHT乳在蛋白濃度測定試驗(yàn)中的線性關(guān)系

設(shè)計(jì)UHT乳稀釋PBS磷酸緩沖液中的稀釋倍數(shù)為8、12、16、20、24、28倍,制作線性關(guān)系圖。

1.2.6 UHT乳中蛋白濃度變化與嗜冷菌添加量和儲(chǔ)存溫度的關(guān)系

選擇同一批次的UHT乳為基礎(chǔ)液態(tài)奶。

將產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)菌株的磁珠復(fù)活在嗜冷菌平板計(jì)數(shù)瓊脂上21℃恒溫培養(yǎng)25 h,用PBS緩沖液沖洗培養(yǎng)皿上的菌落,將菌液轉(zhuǎn)至空無菌玻璃管中,將菌液調(diào)至酶標(biāo)儀450 nm波長下吸光值為0.5,將菌量調(diào)整為103、104、105CFU/mL。

取200 mL UHT乳加入無菌錐形瓶共計(jì)9瓶,共分為3組,每組3瓶,每組分別接入103、104、105CFU/mL的菌液1 mL。放入不同溫度下4、7及21℃培養(yǎng)168 h(7 d),每隔24 h取樣測定1次,測定樣品中蛋白濃度。

1.2.7 假單胞菌胞外蛋白酶對(duì)UHT乳中蛋白質(zhì)的影響

取15 mL UHT乳于無菌瓶中,共3份,每份添加1 mL 105CFU/mL的菌液后密封,置于21℃的恒溫箱中,培養(yǎng)7 d后,除去上層乳樣,留沉淀部分。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜冷菌篩選及鑒定結(jié)果

研究表明,經(jīng)過培養(yǎng)、純化,在33份生鮮乳樣品中,篩選出212株嗜冷菌,其中11株菌所占比例較大,確定為優(yōu)勢嗜冷菌。圖1

圖1 嗜冷菌PCR鑒定的凝膠電泳圖譜

2.2 假單胞菌產(chǎn)蛋白酶能力脫脂乳平板法鑒定

研究表明,透明圈的大小反應(yīng)了菌株分泌胞外蛋白酶的能力。其中99號(hào)菌的產(chǎn)蛋白能力最強(qiáng),其次是93號(hào)菌和36號(hào)菌,最后為6號(hào)菌產(chǎn)蛋白酶的能力最弱,其余菌株產(chǎn)蛋白酶能力極弱,選擇產(chǎn)酶能力最強(qiáng)的99號(hào)菌株做為原料乳中具有的代表性的優(yōu)勢嗜冷菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。測序后所得到的基因序列通過BLAST數(shù)據(jù)庫比對(duì)并建系統(tǒng)發(fā)育樹,99號(hào)菌株與假單胞菌同源性達(dá)到100%,確定99號(hào)菌株為假單胞菌。圖2,圖3,表2

圖2 乳平板鑒定結(jié)果

圖3 進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

表2 乳平板鑒定結(jié)果

2.3 BCA蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

研究表明,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.993 3。圖4

圖4 蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 UHT乳不同稀釋倍數(shù)對(duì)蛋白濃度測定影響

研究表明,UHT乳在28倍稀釋濃度下,相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到了0.998,線性關(guān)系最好,后續(xù)蛋白濃度測定試驗(yàn)均采用經(jīng)過稀釋28倍的UHT乳。圖5～10

圖5 8倍稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 12倍稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 16倍稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖9 24倍稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖10 28倍稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 蛋白濃度與儲(chǔ)存溫度和接菌量的關(guān)系

研究表明,細(xì)菌添加量為103CFU/mL的試驗(yàn)組在第7 d時(shí),21℃條件下蛋白濃度0.136 mg/mL度顯著(P<0.05)低于7℃條件下的蛋白濃度0.143 mg/mL,4℃試驗(yàn)組隨著時(shí)間的推移蛋白濃度的變化差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)樣品乳添加菌量為104CFU/mL時(shí),7℃蛋白濃度在第6 d出現(xiàn)顯著(P<0.05)下降,蛋白濃度為0.143 mg/mL,在第7 d為最低值0.141 mg/mL;21℃時(shí)蛋白濃度在第3 d開始顯著(P<0.05)下降,在第5 d時(shí)蛋白總濃度極顯著(P<0.01)下降,并在第7 d達(dá)到最低值0.137 mg/mL。當(dāng)樣品乳菌液濃度為105CFU/mL在21℃條件下儲(chǔ)存第7 d時(shí),蛋白濃度在所有試驗(yàn)組中達(dá)到最低值0.128 mg/mL,蛋白濃度極顯著(P<0.01)低于103CFU/mL試驗(yàn)組在相同條件下的蛋白濃度0.136 mg/mL。圖11～13

注:按蛋白濃度由高到低a、b、c、d、e(P<0.05),按順序排序,字母相同為不顯著(P>0.05),大寫字母為極顯著(P<0.01)。下同

圖12 104CFU/mL接菌量下UHT乳蛋白濃度變化

圖13 105CFU/mL接菌量下UHT乳蛋白濃度變化

2.6 樣品在不同條件下蛋白濃度的顯著性

研究表明,4℃條件儲(chǔ)存下,添加菌量為103、104、105CFU/mL的試驗(yàn)組蛋白濃度變化差異均無顯著性(P>0.05);添菌量在103CFU/mL時(shí),21℃試驗(yàn)組的蛋白濃變化差異度極顯著(P<0.01);在添菌量在104CFU/mL時(shí),7℃和21℃試驗(yàn)組的蛋白濃度變化差異顯著(P<0.05);在添菌量在105CFU/mL時(shí),21℃試驗(yàn)組蛋白濃度變化差異極顯著(P<0.01)。

2.7 假單胞菌胞外蛋白酶導(dǎo)致的UHT乳中蛋白質(zhì)沉淀

研究表明,假單胞菌蛋白酶水解了酪蛋白膠粒外層的κ-casein后,蛋白膠粒的穩(wěn)定性遭到破壞,造成牛奶在貯存過程中出現(xiàn)沉淀、凝膠、蛋白水解等,縮短牛奶的貨架期。添加1 mL含105CFU/mL假單胞菌菌液的UHT乳在21℃的恒溫箱中培養(yǎng)7 d后,UHT乳出現(xiàn)了明顯蛋白沉淀。圖14

圖14 胞外蛋白酶導(dǎo)致的乳蛋白沉淀變化

3 討 論

3.1生鮮乳作為嗜冷的優(yōu)良培養(yǎng)基,在低溫下得益于生鮮乳的營養(yǎng)成分可迅速繁殖[11],其代謝產(chǎn)生的耐熱蛋白酶,破壞乳中營養(yǎng)成分,改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)使結(jié)構(gòu)發(fā)生變性[4]。

結(jié)合16Sr DNA序列同源性分析鑒定出嗜冷菌212株,其中11株假單胞菌為優(yōu)勢嗜冷菌,此前報(bào)道的假單胞菌是對(duì)乳制品品質(zhì)影響最主要的因素[17-18]與試驗(yàn)結(jié)果一致。

嗜冷菌菌株之間產(chǎn)蛋白酶能力有所不同,為保證試驗(yàn)的可靠性與準(zhǔn)確性,試驗(yàn)采用乳平板可視鑒定法鑒定出產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)的菌株為99號(hào)菌株假單胞菌,其產(chǎn)生的耐熱蛋白酶可分解培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì),出現(xiàn)明顯的水解圈,魏超[19]等研究結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果相符。

儲(chǔ)存溫度升高時(shí),乳樣品內(nèi)的蛋白濃度相應(yīng)的降低[20]。試驗(yàn)中,添加菌量為103、104和105CFU/mL的試驗(yàn)組,均在儲(chǔ)存溫度為21℃時(shí)達(dá)到蛋白總量最低值,與相關(guān)文獻(xiàn)[21-23]報(bào)道相一致。

3.2試驗(yàn)添加嗜冷菌模擬被污染的生鮮乳,隨著添菌量的加大和時(shí)間的延長,添加菌量為105CFU/mL試驗(yàn)組在第7 d時(shí),最低蛋白濃度為0.128 mg/mL,極顯著(P<0.01)低于103CFU/mL試驗(yàn)組的第7 d蛋白濃度0.136 mg/mL,與王嬌等[24-25]通過在滅菌原料乳中接入經(jīng)篩選得到的優(yōu)勢嗜冷菌菌株,檢測得到隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,得到乳中蛋白濃度明顯降低的結(jié)果與試驗(yàn)得到結(jié)論一致。

3.3生鮮乳中的嗜冷菌來源主要是因其生產(chǎn)環(huán)節(jié)的污染導(dǎo)致生鮮乳在運(yùn)送的過程中會(huì)出現(xiàn)大量繁殖,從而使乳品質(zhì)遭到破壞[26-27]。但運(yùn)送過程中的儲(chǔ)存溫度,對(duì)嗜冷菌的生長繁殖也非常重要。試驗(yàn)中,在4℃條件儲(chǔ)存下的103、104和105CFU/mL的試驗(yàn)組蛋白濃度變化差異均無顯著性(P>0.05),蛋白濃度變化平穩(wěn)。而在21℃儲(chǔ)存條件下,3組試驗(yàn)組的蛋白濃度都有顯著和極顯著的變化。在2℃下貯藏和運(yùn)輸?shù)纳r乳生產(chǎn)的UHT乳要比在6℃下貯藏運(yùn)輸?shù)纳r乳生產(chǎn)的UHT乳的保質(zhì)期要長[28],應(yīng)盡量將生鮮乳避免光線下保存以及在4℃以下貯藏為最佳;與洪青等[29]所闡述的生鮮乳進(jìn)入貯存罐迅速冷卻到4℃是抑制乳中嗜冷菌生產(chǎn)蛋白酶從而達(dá)到預(yù)防乳制品蛋白降解。

應(yīng)避免乳制品在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中受到細(xì)菌的污染,生鮮乳采集過程中奶牛乳房和擠奶設(shè)備的清洗和消毒是必不可少的,更要避免運(yùn)輸和加工過程的二次污染[30-31],盡快運(yùn)輸?shù)焦S,防止嗜冷菌大量的繁殖代謝,使原料乳中嗜冷菌含量保持在最低水平,減少蛋白酶的產(chǎn)生,從而延長UHT乳的貨架期[32-33]。

4 結(jié) 論

在33份生鮮乳樣品中,共篩選出212株嗜冷菌。假單胞菌為生鮮乳中優(yōu)勢嗜冷菌,分離率為5.19%。99號(hào)菌株假單胞菌產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng),在UHT乳樣品接菌量相同的情況下,儲(chǔ)存溫度高的試驗(yàn)組蛋白濃度明顯低于低溫儲(chǔ)存的試驗(yàn)組,UHT乳低溫儲(chǔ)存的重要性。在儲(chǔ)存溫度相同時(shí),乳樣品接菌量越大,相同時(shí)間內(nèi)的蛋白濃度越低。